Protocol
Alle Tierversuche wurden von Institutional Animal Care und Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center und folgen den Leitlinien gemäß dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren", veröffentlicht von der National Institutes of Health zugelassen. Verwenden von acht bis zwölf Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse, die im Handel erhältlich sind. Injizieren Sie 1 x 10 5 4T1 oder 1 x 10 5 4T1 Zellen, die GFP, die von verschiedenen Anbietern gekauft werden können, in das Brustfettpolster.
1. Kultur von 4T1 und 4T1-GFP - Zellen und Herstellung von Tumorzellsuspension für Injektionszwecke 14
- 4T1 und 4T1-GFP Zellkultur
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung von sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstrom (LAF) Biosicherheitsschrank, sofern nicht anders angegeben.- Maintain 4T1 und 4T1-GFP-Zellen in RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin ergänztG und 100 ug / ml Streptomycinsulfat.
HINWEIS: Bestimmen Sie eine Passage-Nummer von jedem Trypsinierung und Galvanisieren von Zellen zu zählen. Es ist wichtig, die Zellen mit der gleichen Durchgangszahl für alle Maus-Experimente zu verwenden, da die Anzahl der Durchgänge Zelle Tumorigenität und metastatische Potential beeinflußt. - Vor der Zellinjektionen entfernen Sie den T75 cm 2 Kolben, Tumorzellen bei 80% Konfluenz enthält, aus einem Inkubator und absaugen Medium. 10 ml PBS und drehen Sie den Kolben vorsichtig restliche Medium zu waschen, und dann PBS absaugen.
- 2 ml 0,25% Trypsin - EDTA mit dem Kolben und kippen die Lösung gleichmäßig auf der Oberfläche zu verteilen und es wurde 3 min bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator inkubiert.
- Tippen Sie auf den Kolben Ablösung von Zellen zu erleichtern und 8 ml frisches Medium. Pipette nach oben und unten mehrmals Klumpen zu stören und eine Einzelzellsuspension erhalten.
- Zentrifugenzellen für 5 min. bei 500 × g bei RT.Aspirieren den Überstand und wasche Zellen in 10 ml PBS.
- Pipette nach oben und unten mehrmals Klumpen zu stören und eine Einzelzellsuspension erhalten. Nehmen Sie 100 ul einer Zellsuspension und die Zellen zählen, um die Lebensfähigkeit der Zellen-Analyzer als den Anweisungen des Herstellers.
- Berechnung der Anzahl der für alle Injektionen erforderlich Zellen Formel: 10 5 Zellen pro Maus x Anzahl der Mäuse in einem Experiment verwendet (immer zusätzliche Zellen vorbereiten auf einer sicheren Seite zu sein).
- Zentrifugen Zellen, wie in 1.1.5. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Zellen in der Menge an frischer PBS erforderlich , um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis sie bereit zur Injektion.
- Maintain 4T1 und 4T1-GFP-Zellen in RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin ergänztG und 100 ug / ml Streptomycinsulfat.
- 4T1 oder 4T1-GFP Zellinjektion-Maus - Verfahren
- Am Tag vor der Injektion der Tumorzellen, betäuben Mäuse in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran. Sobald Mäuse schlafen und atmen regelmäßig statt ter die Maus auf einem OP-Pad mit der Nase in der Nase Kegel, und verbinden Sie es mit der Isofluran Verdampfer. Pflegen Anästhesie mit 2,5% Isofluran. Pinch die Maus Zehe, um sicherzustellen, dass die Maus betäubt.
- Bewerben Enthaarungscreme mit einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle (rechte Brustbrustfettpolster) und für 2 Minuten warten. Reinigen Sie die Website ein nasses Papiertuch verwenden, legen Sie die Maus wieder in den Käfig und zu überwachen, ein Tier, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt die Brustlage zu halten.
- Am Tag der Injektion, betäuben die Mäuse wie in 1.2.2 und auf den OP-Pad.
- Vortex die Röhre Tumorzellen mit einheitlichen Zellsuspension zu erhalten. Aspirat 100 & mgr; l einer Zellsuspension, die 1 x 10 5 Tumorzellen in ein 0,5 ml Insulinspritze (29 G, 12,7 mm-Nadellänge).
- Heben Sie die Haut mit dem Daumen und Zeigefinger in der Nähe des 2. und 3. Nippel, legen Sie die Nadel der Spritze in die Mammary fat pad knapp unterhalb der dritten Brustwarze unter der Haut zwischen den Fingern und injizieren Zellen langsam eine Blase (subkutane Injektion) zu bilden.
- Platzieren Sie die Maus wieder in den Käfig nach der Injektion und zu überwachen, wie in 1.2.2.
- Überwachung Tumorwachstum
- Kalipermessungen 14
HINWEIS: Eingespritzte 4T1 oder 4T1-GFP-Zellen bilden aggressive Brusttumor. Normalerweise sind die tastbaren Tumoren erscheinen ~ am Tag 4 - 5 nach Zellinokulation. 4T1-GFP-Zellen bilden Tumoren, die langsamer wachsen und Metastasen später geben. Messen Sie den Tumor zwei- bis dreimal pro Woche. Wenn klinischen Zustand der Tiere verschlechtert, Tiere verlieren mehr als 10% des Körpergewichts übersteigen Tumoren 10% des Körpergewichts oder vereitert werden, einschläfern sofort Mäuse.- Anesthetize eine Maus, wie in Abschnitt 1.2.1., Wiegen, Platz auf dem OP-Pad und benetzen Sie den Bereich mit 70% Ethanol.
- Palpieren Geschwulst in der Injektionsstelle (4 - 5 Tage nach der Inokulation Zelle). <li> Messen der größte Durchmesser (D) und kleineren Durchmesser (d1) mit einem Sattel.
- Berechnen Tumorvolumen Formel Lautstärke mit = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Überwachen Sie die Maus aus der Narkose wie in 1.2.2.
- Kalipermessungen 14
- Imaging (Nur für 4T1 GFP - Zellen)
- Anesthetize die Maus wie in Abschnitt 1.2.1. Platzieren Sie die Maus auf einer beweglichen Bühne im Inneren des Abbildungsinstruments. Pflegen Anästhesie durch die Nase Kegel.
- Schalten Sie das Abbildungsinstrument und die Lichtquelle als den Anweisungen des Herstellers.
- Unter dem Reiter "Erwerb" Gehe zu "Beleuchtung" und wechseln Sie in die leere Position (kein Filter) für weißes Licht. Stellen Sie sicher, dass der Light-Engine ist ON und wählen Sie "Trans" in dem Lichttisch.
- Unter dem Reiter "Mikroskop", wählen Sie "Clear" Emissionsfilter und 0,5X Vergrößerung. In der "Kamera" Registerkarte, stellen Sie sicher, dass für die Aufnahme Binning "1 x 1 'und Vorschau" 4 x 4'. Klicken Sie auf Vorschau, den Tumor in weißem Licht ausfindig zu machen, konzentrieren klares Bild zu bekommen, und Capture.
- Gehen Sie auf "Acquisition" Registerkarte und ändern Beleuchtung zu filtern 1 (Filter für GFP gemäß Herstelleranweisung). Im "Mikroskop" Registerkarte ändern Emissionsfilter auf "530/20 GF". Vorschau und Aufnahme-Bild in einem grünen Kanal. Passen Sie die Belichtungszeit die entsprechende Helligkeit zu erhalten.
- Bewerben Pseudo auf das Bild , und speichern Sie in den entsprechenden Ordner (Abbildung 1).
2. Die intranasale Verabreichung von Liposome 10
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung von sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstrom (LAF) Bio-Sicherheitsschrank, sofern nicht anders angegeben.
- Am 6. Tag nach der Tumorzellinjektion betäuben Mäuse wie in Abschnitt 1.2.1.
- Vortex die Clodronat oder Kontrolle (PBS) Liposomensuspension vom Hersteller erhalten. Nehmen Sie 60 ul Liposomen sUSSETZUNG mit einer sterilen Pipettenspitze.
- Freisetzung langsam Liposom-Lösung (5 ul jedes Mal) in der Nähe der Nase der Maus ermöglicht in der Lösung zu atmen, wiederholen, bis die gesamte Dosis von 60 & mgr; l verabreicht.
- Lassen Sie die Maus wieder zu Bewusstsein kommen, bevor es Platzierung in den Käfig zurück.
- Wiederholen Sie Liposom Verabreichung alle 3 Tage, bis die Mäuse getötet. Nicht anwenden Liposomen an einem Tag des Opfers.
3. Maus-Opfer und Gewebeentnahme
HINWEIS: Die Verwendung autoklaviert und sterile Instrumente für Maus-Dissektion. Euthanize Mäuse während der Narkose durch die Ausblutung und die Entfernung der lebenswichtigen Organe.
- Am Tag 22 (Für 4T1-Zellen) oder Tag 26 (für 4T1-GFP-Zellen) nach der Injektion von Tumorzellen der Maus, wie in Abschnitt 1.2.1 betäuben. und auf den OP-Pad mit einem Nasenkegel auf Verdampfer verbunden ist, halten Anästhesie wie in Abschnitt 1.2.1. Einklemmen einer der Zehen, dass der m, um sicherzustellen,Ouse ist bewusstlos.
- Stecken Sie die Zehen mit Nadeln zur Dissektion Bord. Spray Ethanol auf die Haut von Mäusen.
- Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und einen Schnitt machen die chirurgische Schere. Langsam das Peritoneum aussetzen und fortsetzen, bis die Haut am Hals durch den Brustkorb zu schneiden.
- Unter Verwendung der chirurgischen Schere einen Einschnitt in das Peritoneum machen und sorgfältig die Organe mit Baumwollspitzen ausgesetzt werden Schäden an den Blutgefäßen zu vermeiden.
- Verschieben Sie die Organe auf der einen Seite und setzen die untere Hohlvene. Die Punktion der Vene und sammeln Blut mit dem 29 G Insulinspritze. Legen Sie gesammelte Blut in das Röhrchen und verlassen auf dem Eis zur weiteren Verarbeitung.
- Schneiden Sie die Membran der Brustkorb, Lunge und Herz zu belichten. schneiden Sie langsam den Brustkorb auf beiden Seiten des Knochenschneider und heben Sie die Spitze der Brustkorb mit. Ergreifen Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie das Bindegewebe, das Herz und die Lunge in die Brusthöhle verbindet.
- Platzieren Sie die Lungen in kleinen Menge PBS in den 60 mmPetrischale auf Eis, bis sie bereit für die Bildgebung und die Weiterverarbeitung zu Gefrierschnitten für Immunfluoreszenz-Mikroskopie oder Routine-Histologie [einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung].
4. Lungenmetastasen Bewertung
- Zählen und Scoring Oberflächen Metastasierung
- Legen Sie die Petrischale mit den Lungen unter dem Präpariermikroskop. Konzentrieren Sie eine klare Sicht auf die Lungenoberfläche zu erhalten.
- ein Präpariermikroskop Mit der Lungenoberfläche beobachten. Graf Metastasen auf den vorderen und hinteren Seiten der beiden Lungen.
HINWEIS: Die normale Lunge ist weißlich oder rosa und porös und weist eine schwammartige Struktur. 4T1 Metastasen sind solide und nicht porösen, manchmal scheinen zu einem Tropfen Flüssigkeit (2A) ähnlich zu sein.
- Lungenbildgebung
- Legen Sie die Petrischale mit Lungen auf der beweglichen Bühne im Inneren des Abbildungsinstruments.
- Schalten Sie das Gerät und dieBioLite Multispektraldaten Quelle. Öffnen Sie die Software. Unter der Registerkarte "Erwerb", gehen Sie zu "Beleuchtung", und wechseln Sie in leere Position (kein Filter) für weißes Licht. Light Engine -> ON, Lichttisch -> Epi. Unter dem Reiter "Mikroskop" Wählen Sie "Löschen" Emissionsfilter und Vergrößerung 1.66X. In der "Kamera" Registerkarte, stellen Sie sicher, dass für die Aufnahme Binning "1 x 1 'und Vorschau" 4 x 4'.
- Klicken Sie auf Vorschau und konzentrieren sich ein klares Bild von der Lunge in weißes Licht zu erhalten und Capture.
- Gehen Sie (für GFP-Filter gemäß Herstelleranweisung) an den Filter 1 auf "Acquisition" Registerkarte und ändern. Im "Mikroskop" Registerkarte ändern Emissionsfilter auf "530/20 GF". Vorschau und Aufnahme-Bild in einem grünen Kanal. Passen Sie die Belichtungszeit die entsprechende Helligkeit zu erhalten.
- Bewerben Pseudo auf das Bild, und in entsprechenden Ordner speichern.
- Flip die Lungen Bild der anderen Seite in ähnlicher Weise zu erhalten. Diese procEDURE erzeugt Bilder von GFP-positiven Metastasen , die weitere geeignete Software (2B) quantifiziert werden kann unter Verwendung von 14.
- Immunfluoreszenz - Mikroskopie
- Fixieren die Lungen in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 4 Stunden in Dunkelheit.
- Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 10 ml PBS für 5 Minuten, um vollständig das Fixiermittel zu entfernen. Übertragen auf 18% Saccharose in PBS und O / N bei 4 ° C inkubiert.
- Entfernen Sie das Gewebe aus der Saccharose und abtupfen überschüssige.
- Nehmen Sie einen cryomold, decken Sie die untere Schicht mit Oktober Medium. Legen Sie das Gewebe auf Oktober Medium. Füllen Sie die Form mit Oktober Medium vollständig in das Gewebe und auf Trockeneis zu decken.
- Speicher-Block bei -80 ° C bis zum Schneiden.
- Bereiten Sie 5 um dicke Abschnitte mit einem Kryostaten und auf geladene Objektträger.
- Nicht gebrauchte Folien in -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Luft trocknen die Folien für 7 min. und waschen mit PBS Oktober zu entfernen. Wipe der Schieber mit Handtuch Gewebe oder Papier über Wasser zu entfernen, montieren Deckgläser mit Medium mit GFP-Filter unter dem Mikroskop enthält DAPI Montage und zu visualisieren.
- Quantifizierung GFP Metastasen (3A) mit der Verwendung von geeigneter Software 14.
- Histologie und die digitale Pathologie
- Klicken Sie auf die manuelle Last Taste unter der Registerkarte Start und warten auf den Schlitten Rack halten vom Scanner auszuwerfen.
- Nehmen Sie die H & E-gefärbten Gewebeschnitt, reinigen Sie es mit Gewebe Schmutz zu entfernen, und legen Sie sie sicher in der Dia Haltegestell.
- Geben Sie die Dia Beschreibung in knallte-up-Fenster.
- Wählen Sie den Scanbereich auf die Registerkarte SS Imaging-Konsolenfenster und stellen Sie den grünen Quadrat der Region of Interest (ROI) zu definieren, gescannt werden.
- Ziehen Sie den blauen Kalibrierungs Diamant zu einem klaren Teil des Schlittens, in dem Gewebe nicht vorhanden ist, jedoch innerhalb der ROI.
- Als nächstes wählen Sie den Fokus Punkte Registerkarte und klicken Sie auf die Auto-Select-Taste mehrere Fokuspunkte (gelbe Pluszeichen) auf das Gewebe in der ROI zu erzielen.
- Falls erforderlich, legen Sie zusätzliche Schwerpunkte manuell durch einen Doppelklick innerhalb des ROI.
- Fahren Sie mit der Kalibrier-Menü und wählen Sie die Schaltfläche Kalibrieren Dia Kalibrierung an der blauen Kalibrierungsdiamantspitze zu beginnen. Nach der Kalibrierung das Bild von dem Kalibrierungspunkt abgeschlossen ist, wird angezeigt.
- Überprüfen Sie das Bild, um sicherzustellen, dass sie klar und frei von Schmutz oder Artefakte.
- Fahren Sie mit der Registerkarte Scannen und wählen Sie Start Scan Scannen des ROI zu beginnen. Abgetastet histologischen Schnitt wird in ein digitales umgewandelt Schieber (3B und 4A)
- Quantifizierung metastatic Belastung wie zuvor beschrieben (4B) 14.
5. Durchflusszytometrie (FACS) Analyse der Alveolarmakrophagen in den Lungen
- Herstellung von Single Cell Schutzsperreauf
- Nach der Bebilderung und das Zählen von Metastasen, waschen Sie die Lungen mit sterilem PBS und in die Petrischale legen. Damit 1 - 2 mm Stücke der Lunge mit chirurgische Schere und Pinzette.
- Übertragen die Lungenstücke in die 15 ml konischen Röhrchen mit 3 ml des Verdauungspuffer, enthaltend 1 mg / ml Kollagenase P, 0,04 mg / ml DNase I und 10 ug / ml Trypsininhibitor gelöst RPMI-Medium (steril).
- Inkubieren des konischen Rohr auf einer rotierenden Schüttelmaschine im Inkubator bei 37 ° C für 40 min.
- Entfernen Sie das Rohr konisch aus dem Inkubator und Pipette die Lösung nach oben und unten um das Gewebe zu distanzieren.
- Übergeben Sie die Lösung durch die 40 & mgr; m Sieb zu Klumpen zu vermeiden und eine Einzelzellsuspension erhalten. Falls erforderlich, besser das verdaute Gewebe Pressgewebe gegen die Zellsieb mit Hilfe eines Spritzenkolbens zu zerfallen.
- Wenn eine Einzelzellsuspension erreicht worden ist, sammelt die Zellen durch Zentrifugation und Lyse mit roten Blutkörperchen2 ml ACK-Puffer für 10 min bei RT. Dann waschen ein Pellet zweimal in 8 ml RPMI.
- Die Zellen in 3 ml des kompletten RPMI-Medium und gehen Sie den Anweisungen des Herstellers, die die Lebensfähigkeit der Zellen Analysator zählen zu Zelle.
- Die Färbung von Lungenzellen für Oberflächenmarker
ANMERKUNG: Führen alle Inkubationen bei 4 ° C. Zentrifugenplatte bei 500 xg und 4 ° C.- Pipette 1 x 10 6 Zellen in 100 & mgr; l FACS - Puffer (1% FBS in PBS) in die einzelnen Vertiefungen einer V-Boden 96-Well - Platte. ein V-Boden 96 Well-Platte unter Verwendung erleichtert Gabe von mehreren Proben.
- Pre-Inkubation der Zellsuspension mit 1 ug Maus-Fc-Block gereinigt anti-Maus-CD16 / CD32 in 100 ul FACS-Puffer für 15 min. Zentrifugieren Sie die V-Boden 96-Well-Platte, die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu entfernen, indem die Platte Spiegeln und lassen Sie die Lösung abtropfen lassen.
- Für die Oberflächenfärbung, im Voraus, verdünnen die Antikörper gegen Murine - Antigene in einem Rohr (Master - Mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (SM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml in FACS - Puffer , enthaltend 10 ug / ml Fc Block CD16 / CD32 Antikörper.
HINWEIS: Dieser Satz von Antikörpern ist nützlich für die Identifizierung und die Bewertung eines funktionellen Status von alveolären Makrophagen und dendritischen Zellen. - 100 l verdünnte Antikörper (Master-Mix) zu den Vertiefungen der V-Boden 96 Well-Platte und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
- Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und entfernen Überstand wie in 5.2.2. Wasche die Zellen mit 200 & mgr; l FACS-Puffer, Zentrifugation bei 500 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand wie in 5.2.2. und resuspendieren Zellen in 200 ul PBS.
- Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und fügen Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt in PBS (1: 1000). Inkubieren für 20 Minuten bei 4 ° C. </ Li>
- Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und entfernen Sie den Überstand wie in 5.2.2. Waschen mit 200 ul PBS und Zentrifuge wieder die Platte.
- Die Zellen in 100 ul 1% Paraformaldehyd und lagern bei 4 ° C bis zum Erwerb durch FACS-Instrument. Vor der Akquisition Transfer Zellsuspensionen auf die Polypropylen-FACS-Röhrchen.
6. Analyse der FACS Daten: Gating-Strategien und die Identifizierung von Zell-Subpopulationen
- Führen Sie die FACS - Analyse wie zuvor 10 berichtet. Tor erworben Zellen / Ereignisse basierend auf zukunfts- (FSC) und Seitenstreuung (SSC); und dann Tor Live und CD45 + Zellen. Für Alveolarmakrophage Identifizierung, Tor CD11b-negativ und dann CD11c + F4 / 80 + Zellen. (5A).
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Representative Results
Die Injektion von 4T1-GFP Tumorzellen in das Brustfettpolster führt zur Bildung von Mäuse - Tumoren (1A), die die Metastasierung von menschlichen Brustkrebs rekapitulieren, wie Metastasen in der Lunge (2), Leber, Knochen schnell gebildet und das Gehirn von Mäusen 11. Die stabile Transfektion von 4T1 - Zellen mit GFP erleichtert die Überwachung des Tumorwachstums (1B), metastasierende Tumorzellen verfolgt und Quantifizieren der metastatischen Belastung (2B, 3B). Zusätzlich Abbildung von Tumoren bietet die zusätzliche Information bezüglich verschiedener pathologischer Funktionen wie Tumorzelltod und Tumorvaskulatur. Die helle grüne Fluoreszenz (Abbildung 1B-die mittleren Platten) zeigen die hohe GFP - Expression, die in der Regel mit dem lebensfähigen Tumorparenchym verbunden ist. Während der Mangel an GFP in einigen Tumorbereichen kann Tumor Zelltod zeigen (
Da die Mehrzahl von Lungenmetastasen auf der Lungenoberfläche befinden, können sie sich unter dem regulären Präpariermikroskop beobachtet werden. Die Metastasen sind in der Regel deutlich von dem umgebenden Parenchym (2A). Um grobe Beobachtungen überprüfen und zu bewerten Metastasen , die tiefer im Lungenparenchym sind, können Fluoreszenz - Bildgebung der Lunge durchgeführt (2B), wenn GFP - exprimierenden Zellen wurden für die Injektion verwendet. Obwohl Lungenautofluoreszenz in den Bildern, helle GFP-Fluoreszenz abgeleitet erleichtert Scheidungs Metastasen von umgebenden Lungenparenchym deutlich sichtbar ist. Alternativ Routine - Histologie (3A und 4A) in Verbindung mit digitalen Pathologie Algorithmen ( Mehrfarben-FACS bietet Gelegenheit, sogar seltene Zellpopulationen durch die Verwendung von Multipol-Zelloberfläche und / oder zytoplasmatischen Marker gleichzeitig zu charakterisieren. Alveolarmakrophagen werden durch den Mangel an CD11b - Expression und die Expression von F4 / 80 und CD11c (Abbildung 5) charakterisiert. Der typische Ansatz , um diese Zellen zu identifizieren , mittels Durchflusszytometrie umfasst: (i) die Auswahl der Zellpopulation auf Basis von Morphologie durch Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften dargestellt, (ii) Auswahl der lebenden CD45 + Zellen , gefolgt von (iii) Gating von CD11b - negativen Zellen, und (iv) Gating von Zellen Koexpression F4 / 80 und CD11c (5A, B). 
Abbildung 1. Überwachung des Tumorwachstums Through Tier Imaging. (A) Weißlichtbildern der injizierten Maus mit GFP Zellen in das Brustfettpolster zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tumorzellinjektion. (B) Die entsprechenden Fluoreszenzbilder erhalten durch die Verwendung von GFP exprimierenden Filters. Eine gestrichelte Linien markieren Tumorbereich. Beachten Sie das Fehlen von leuchtend grünen Fluoreszenz in einigen Tumorbereichen am Tag 26, die aus Gewebe Nekrose oder die Entwicklung von neovasculature führen kann. Maßstabsleiste, 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 2. Bewertung der Lunge Metastasen Burden. (A) Bilder von den Lungen von Mäusen , die mit 4T1 Zellen in das Brustfettpolster mit den Oberflächen Metastasen injiziert (Pfeile).(B) Bilder von GFP + Lungenmetastasen (helle grüne Fluoreszenz) erhalten durch den Einsatz von Imaging - Mikroskop. Maßstabsleiste, 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3. Digitale Histopathologie und konfokale Mikroskopie in Imaging von Lungenmetastasen. (A) Die Scan des Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt Lunge Abschnitt von Mäusen , die mit 4T1 Zellen in das Brustfettpolster (dunkelblau Gewebe-Metastasen) injiziert. Maßstabsbalken, 4 mm. (B) Die konfokale Mikroskopie von GFP + Lungenmetastasen (helle grüne Fluoreszenz). Maßstabsbalken, 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere versio zu sehenn dieser Figur. 
Abbildung 4. Quantifizierung der Lunge Metastasen Burden von Digital Histopathologie. (A) Die Scan von Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt Lunge Abschnitt (dunkelblau Gewebe-Metastasen). (B) Das Bild der Lunge in (A) gezeigt ist, erzeugt durch ein trainierbar Histomorphologie Bildanalyse-Tool (software- "Genie"). Rote Farbe zeigt die Lungenbereiche von "Genie", wie Metastasen identifiziert. Maßstabsbalken, 5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 5. Flow Cytometry AppKakerlaken zur Identifizierung von Alveolarmakrophagen in der Lunge. (A) Die representativeflow cytometrydot die Gating - Strategie plotsillustrating CD45 + CD11b negativen F4 / 80 + CD11c + Alveolarmakrophagen zu identifizieren. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie plotsillustrating Wirkung der Kontrolle oder Clodronat-Liposomen auf die Lungen Alveolarmakrophagen dot. Die Zahlen in Parzellen Prozente von gated Zellen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das Department of Defense gewähren TSA 140010 MK und BC 111038 MMM Ansichten und Meinungen von und Vermerke, die von dem Autor (en) nicht genau den von der US-Armee oder dem Department of Defense unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
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