Protocol
Alle dyreforsøg er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Texas Tech University Health Sciences Center og fulgte de retningslinjer, der er skitseret i "Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr", udgivet af National Institutes of Health. Bruge otte til tolv uger gamle BALB / c-mus, der er kommercielt tilgængelige. Injicer 1 x 10 5 4T1 eller 1 x 10 5 4T1 celler, der udtrykker GFP, som kan købes fra forskellige leverandører, ind i brystfedtpuden.
1. Kultur af 4T1 og 4T1-GFP Cells & Udarbejdelse af Tumor Cell Suspension til injektion 14
- 4T1 og 4T1-GFP Cellekultur
BEMÆRK: Udfør alle trin ved hjælp sterile opløsninger i en laminar luftstrøm (LAF) biosikkerhed kabinet, medmindre andet er angivet.- Vedligehold 4T1 og 4T1-GFP-celler i RPMI-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillinG og 100 ug / ml streptomycinsulfat.
BEMÆRK: Bestem en passage nummer ved at tælle hver trypsinisering og plettering af celler. Det er vigtigt at anvende celler med samme passage nummer til alle muse eksperimenter, som antallet af passager påvirker celle tumorigenicitet og metastatisk potentiale. - Før celle injektioner fjerner T75 cm2 kolbe indeholdende tumorceller ved 80% konfluens, fra en inkubator og aspirat medium. Der tilsættes 10 ml PBS og rotere kolben forsigtigt at vaske ud resterende medium, og derefter suge PBS.
- Tilsæt 2 ml 0,25% trypsin med EDTA til kolben og vippe det at fordele opløsningen ensartet på overfladen og inkuberes i en befugtet inkubator i 3 min ved 37 C med 5% CO2.
- Tryk kolben for at lette frigørelse af celler og tilsæt 8 ml frisk medium. Pipette op og ned flere gange for at forstyrre klumper og få en enkelt cellesuspension.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter. ved 500 xg ved stuetemperatur.Aspirer supernatanten og vask cellerne i 10 ml PBS.
- Pipette op og ned flere gange for at forstyrre klumper og få en enkelt cellesuspension. Tag 100 pi af en cellesuspension og tælle celler under anvendelse af cellelevedygtigheden analysator i henhold til producentens anvisninger.
- Beregn antal celler, der kræves for alle injektioner efter formel: 10 5 celler per mus x # af mus anvendt i et eksperiment (altid forberede ekstra celler til at være på en sikker side).
- Centrifuge celler som i 1.1.5. Fjern supernatanten gennem aspiration og resuspender celler i mængden af frisk PBS kræves for at opnå en endelig cellekoncentration på 1 x 10 6 celler / ml. Hold cellesuspensionen på is indtil klar til injektion.
- Vedligehold 4T1 og 4T1-GFP-celler i RPMI-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillinG og 100 ug / ml streptomycinsulfat.
- 4T1 eller 4T1-GFP celleinjektion-mus Procedurer
- Dagen før tumorcelleinjektion, bedøver mus i en induktion kammer med 3% isofluran. Når mus sover og ånder regelmæssigt sted than musen på en kirurgisk pad med næsen inde i næsen kegle, og tilslut den til isofluran fordamper. Vedligehold anæstesi med 2,5% isofluran. Klem muse tå at sikre, at musen er bedøvet.
- Påfør hårfjerning creme med en vatpind til injektionsstedet (højre brystmuskel brystfedtpude) og vente i 2 min. Rengør websted ved hjælp af et vådt køkkenrulle, placere musen tilbage i buret og overvåge et dyr, indtil det genvinder tilstrækkeligt bevidsthed til at opretholde den brystleje.
- På dagen for injektion, bedøver de mus som i 1.2.2 og placere på kirurgiske pad.
- Vortex rør indeholdende tumorceller at få ensartet cellesuspension. Aspirer 100 pi af en cellesuspension indeholdende 1 x 10 5 tumorceller, i en 0,5 ml insulinsprøjte (29 g, 12,7 mm-kanyle længde).
- Løft huden ved hjælp af tommel- og finger-indekset tæt på 2. og 3. brystvorte, indfør kanylen af sprøjten ind i Mammary fedtpude lige under den tredje brystvorte under huden mellem fingrene og indsprøjter celler langsomt at danne en boble (subkutan injektion).
- Placer musen tilbage i buret efter injektion og overvåge som i 1.2.2.
- Overvågning tumorvækst
- Tykkelsesmålinger 14
BEMÆRK: Sprøjtes 4T1 eller 4T1-GFP celler danner aggressiv brystkræft tumor. Normalt tydelige tumorer vises ~ ved dag 4 - 5 efter celle podning. 4T1-GFP-celler danner tumorer, der vokser langsommere og giver metastaser senere. Mål tumor to til tre gange om ugen. Hvis klinisk status af dyr forringes, dyr mister mere end 10% kropsvægt, tumorer overstiger 10% af kropsvægten eller blive sår, aflive mus med det samme.- Bedøver en mus som i 1.2.1., Vejer, sted på den kirurgiske pad og våd område med 70% ethanol.
- Palpere tumor i injektionsstedet (4 - 5 dage efter celleinokulering). <li> Mål den største diameter (D) og mindre diameter (d1) med en passer.
- Beregn tumor volumen ved hjælp formel Volume = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Overvåg musen opsving fra anæstesi som i 1.2.2.
- Tykkelsesmålinger 14
- Imaging (Kun for 4T1 GFP Cells)
- Bedøver musen som i 1.2.1. Placer musen på en bevægelig platform inde i billeddannende instrument. Opretholde anæstesi gennem næsen kegle.
- Tænd for billeddannende instrument og lyskilden i henhold til producentens anvisninger.
- Under fanebladet "Acquisition" gå til "Lys" og skifte til den tomme position (ingen filter) til hvidt lys. Sørg for, at lyset motor er tændt, og vælg 'Trans «i lyset tabellen.
- Under fanebladet "mikroskop", vælg "Ryd" emission filter og 0,5X forstørrelse. I fanen "Camera", skal du sørge for, at udsmidningen fangst- er "1 x 1 'og forhåndsvisning' 4 x 4 '. Klik på Eksempel for at lokalisere tumor i hvidt lys, fokus at få klart billede, og klik på capture.
- Gå til "Acquisition" fanen og ændre belysning til at filtrere en (filter til GFP som pr fabrikantens anvisninger). I fanen "mikroskop", ændre emission filter til "530/20 GF". Eksempel og capture billede i en grøn kanal. Juster eksponeringen tid til at få den ønskede lysstyrke.
- Påfør pseudofarve til billedet og gemme i passende folder (figur 1).
2. intranasal administration af liposomer 10
BEMÆRK: Udfør alle trin ved hjælp sterile opløsninger i en laminar luftstrøm (LAF) Bio-sikkerhed fryser, medmindre andet er angivet.
- På dag 6 efter tumorcelleinjektion bedøver mus som i 1.2.1.
- Vortexes clodronat eller kontrol (PBS) liposomsuspension opnået fra producenten. Tag 60 pi liposom suspension anvendelse af sterilt pipettespids.
- Slip langsomt liposom løsning (5 pi hver gang) i nærheden af næseborene tillader musen til at trække vejret i løsningen, gentages, indtil hele dosis på 60 pi administreres.
- Lad musen kommer til bevidsthed, inden det sættes tilbage i buret.
- Gentag liposomindgivelse hver 3. dag, indtil musene aflives. Må ikke anvendes liposomer på en dag med offer.
3. Mus Sacrifice og Tissue Collection
BEMÆRK: Brug autoklaveres og sterile instrumenter til mus dissektion. Afliv mus, mens under anæstesi via afblødning og fjernelse af de vitale organer.
- På dag 22 (For 4T1-celler) eller dag 26 (for 4T1-GFP-celler) efter tumorcelleinjektion bedøver musen som i 1.2.1. og placere på kirurgiske pad med en næse kegle tilsluttet vaporizer, vedligeholde anæstesi som i 1.2.1. Klem et af tæerne at sikre, at mOuse er bevidstløs.
- Pin tæerne bruger nåle til dissektion bord. Spray ethanol på musen hud.
- Løft huden med pincet og foretage en incision med de kirurgiske sakse. eksponere Langsomt peritoneum og fortsætte skære huden gennem thorax indtil halsen.
- Brug af kirurgiske sakse lave et snit i peritoneum og udsætte omhyggeligt organerne med vatpind undgå skader på blodkarrene.
- Flyt organerne til side og blotlægge vena cava inferior. Punkter venen og indsamle blod med 29 g insulinsprøjte. Placer opsamlede blod ind i røret og efterlade på is til yderligere bearbejdning.
- Skær membranen for at blotlægge brystkassen, lunger og hjerte. skåret langsomt brystkassen på begge sider ved hjælp knoglen cutter og løft toppen af brystkassen. Grab hjertet med pincet og skæres bindevævet forbinder hjertet og lungerne til brysthulen.
- Placer lungerne i lille mængde PBS i 60 mmPetriskål på is indtil den er klar til billedbehandling og yderligere behandling til frosne snit til immunfluorescent mikroskopi eller rutine histologi [herunder hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning].
4. lungemetastaser Evaluation
- Tælle og Scoring Surface Metastaser
- Placer petriskål med lungerne under dissektion mikroskop. Fokus at få et klart billede af lungeoverfladen.
- Ved hjælp af en dissektion mikroskop observere lungeoverfladen. Tæl metastaser på de forreste og bageste sider af begge lunger.
BEMÆRK: Den normale lunge er hvidlig eller rødlig og porøs og har en svamp struktur. 4T1-metastaser er faste og ikke-porøse, undertiden synes at svare til en dråbe væske (figur 2A).
- Lung billedbehandling
- Anbring petriskålen med lungerne på den bevægelige fase inde i billeddannende instrument.
- Tænd for instrumentet ogBioLite multispektrale kilde. Åbne softwaren. Under fanen "Acquisition", gå til "Lys", og skifte til tomme position (ingen filter) til hvidt lys. Light Engine -> ON, lysbord -> Epi. Under fanebladet "mikroskop" Vælg 'Ryd' emission filter og 1.66X forstørrelse. I fanen "Camera", skal du sørge for, at udsmidningen fangst- er "1 x 1 'og forhåndsvisning' 4 x 4 '.
- Klik på preview-og fokus for at få et klart billede af lungerne i hvidt lys, og klik capture.
- Gå til "Acquisition" fanen og ændring af filteret 1 (filter til GFP som pr fabrikantens anvisninger). I fanen "mikroskop", ændre emission filter til "530/20 GF". Eksempel og capture billede i en grøn kanal. Juster eksponeringen tid til at få den ønskede lysstyrke.
- Påfør pseudofarve til billedet og gemme i relevante mappe.
- Flip lungerne at få billede af den anden side på samme måde. Denne procedure genererer billeder af GFP-positive metastaser, som kan yderligere kvantificeres ved anvendelse af passende software (figur 2B) 14.
- immunfluorescerende Microscopy
- Fix lungerne i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 4 timer i mørke.
- Vask vævet to gange med 10 ml PBS i 5 minutter for fuldstændigt at fjerne fiksativ. Overførsel til 18% sucrose i PBS og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Fjern væv fra saccharose og dup overskydende.
- Tag en kryoformen, dækker det nederste lag med oktober medium. Placer vævet den okt medium. Fyld formen med oktober medium til helt at dække vævet og sted på tøris.
- Store blok ved -80 ° C indtil skæring.
- Forbered 5 um tykke sektioner med et kryostat og sted på ladede dias.
- Opbevar ubrugte dias i -80 ° C indtil videre brug.
- Air tørre dias i 7 min. og vask med PBS for at fjerne oktober Wipe slide med væv eller køkkenrulle for at fjerne overskydende vand, montere dækglas med montering medie indeholdende DAPI og visualisere med GFP-filter under mikroskop.
- Kvantificer GFP metastaser (figur 3A) med brug af passende software 14.
- Histologi og Digital Patologi
- Klik manuel belastning knappen under fanen start og vente på dias holde rack for at skubbe fra scanneren.
- Tag H & E farvede vævssnit, rense det med væv til at fjerne snavs, og placere den sikkert i dias holder rack.
- Indtast slide beskrivelse i poppet-up vindue.
- Vælg fanen Scan Area på SS imaging konsol vindue og justere den grønne firkant for at definere området af interesse (ROI), der skal scannes.
- Træk den blå kalibrering diamant til en klar del af dias, hvor vævet er fraværende, dog inden for ROI.
- Dernæst skal du vælge Focus Points fanen og klik på knappen Vælg auto for at få flere fokuspunkter (gul plustegn) på vævet i ROI.
- Hvis det er nødvendigt, lægge yderligere fokuspunkter manuelt ved at dobbeltklikke i ROI.
- Fortsæt til fanen kalibrere og vælge knappen kalibrere at begynde slide kalibrering på den blå kalibrering diamant point. Efter kalibreringen er fuldført billedet fra kalibreringen punkt vil blive vist.
- Undersøg billedet for at sikre, at det er klart og fri for snavs eller artefakter.
- Fortsæt til fanen Scan og vælg Start Scan for at starte scanningen af ROI. Scannet histologisk snit omdannes til et digitalt glas (figur 3B og 4A)
- Kvantificere metastatisk byrde som tidligere beskrevet (figur 4B) 14.
5. flowcytometri (FACS) analyse af alveolære makrofager i lungerne
- Udarbejdelse af Single Cell Suspensipå
- Efter billeddannelse og optælling af metastaser, vask lungerne med sterilt PBS og placere til petriskålen. Foretag 1 - 2 mm stykker af lungerne anvendelse af kirurgiske sakse og tænger.
- Overfør lung brikker til 15 ml konisk rør med 3 ml af fordøjelsen buffer indeholdende 1 mg / ml collagenase P, 0,04 mg / ml DNase I, og 10 ug / ml trypsin inhibitor opløst RPMI-medium (steril).
- Inkubér konisk rør på en roterende rysteapparat i inkubatoren ved 37 ° C i 40 min.
- Fjern røret konisk fra inkubatoren og pipette opløsningen op og ned for at dissociere vævet.
- Sendes gennem den 40 um si for at undgå klumper og få en enkelt cellesuspension. Hvis det er nødvendigt, at gå i opløsning bedre det fordøjede væv tryk væv mod cellesigte ved hjælp af et sprøjtestempel.
- Når der er opnået en enkelt cellesuspension, indsamle cellerne ved centrifugering og lyserer røde blodlegemer med2 ml ACK-buffer i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes en pellet to gange i 8 ml RPMI.
- Resuspender celler i 3 ml af det komplette RPMI-medium og fortsætte til celletælling ved brug af cellelevedygtigheden analysator i henhold til producentens anvisninger.
- Farvning af lungeceller for Surface Markers
BEMÆRK: Udfør alle inkubationer ved 4 ° C. Centrifuge plade ved 500 xg og 4 ° C.- Pipette 1 x 10 6 celler i 100 pi FACS buffer (1% FBS i PBS) til individuelle brønde i en V-bundplade med 96 brønde. Ved hjælp af en V-bund plade med 96 brønde letter aflevering af multiple prøver.
- Præinkuberes cellesuspensionen med 1 ug muse-Fc Block oprenset anti-mus CD16 / CD32 i 100 pi FACS buffer i 15 min. Centrifugeres V-bund plade med 96 brønde for at pelletere cellerne og fjern supernatanten ved at vende pladen og lade opløsningen afløbet.
- For overflade farvning, på forhånd, fortynde antistofferne til Murine antigener i et rør (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / i DA (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), aF 647 CD86 (GL-1) til en slutkoncentration på 2,5 ug / ml i FACS-buffer indeholdende 10 ug / ml Fc blok CD16 / CD32 antistof.
BEMÆRK: Denne sæt antistoffer er nyttig til identifikation og evaluering af en funktionel status for alveolære makrofager og dendritiske celler. - Tilsæt 100 pi fortyndede antistoffer (master mix) til brøndene af V-bund plade med 96 brønde og inkuber ved 4 ° C i 30 minutter.
- Centrifugeres pladen for at pelletere celler og fjern supernatanten som i 5.2.2. Vask cellerne med 200 pi FACS buffer, centrifugeres ved 500 g i 5 min. Fjern supernatanten som i 5.2.2. og resuspender cellerne i 200 pi PBS.
- Centrifugeres pladen for at pelletere celler og tilføj viabilitetsfarvestoffet fortyndet i PBS (1: 1.000). Inkuber i 20 min ved 4 ° C. </ Li>
- Centrifugeres pladen for at pelletere celler og fjern supernatanten som i 5.2.2. Vask med 200 pi PBS og centrifugeres pladen igen.
- Resuspender celler i 100 pi 1% paraformaldehyd og opbevares ved 4 ° C indtil overtagelsen ved FACS instrument. Forud for overtagelsen overføre cellesuspensioner til polypropylen FACS rør.
6. Analyse af FACS Data: gating Strategier og Identifikation af cellesubpopulationer
- Udfør FACS-analyse som tidligere rapporteret 10. Gate erhvervede celler / begivenheder baseret på fremadrettede (FSC) og side-scatter (SSC); og derefter gate levende og CD45 + celler. For alveolær makrofag identifikation, gate CD11-negative og derefter CD11c + F4 / 80 + celler. (Figur 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektionen af 4T1-GFP tumorceller i den brystfedtpuden fører til dannelsen af muse tumorer (figur 1A), der rekapitulere metastatisk spredning af human brystcancer, som metastaser er hurtigt dannet i lungerne (figur 2), lever, knogler og hjerne af mus 11. Den stabile transfektion af 4T1-celler med GFP letter overvågning af tumorvækst (figur 1B), sporing metastaserende tumorceller og kvantificere den metastatiske byrde (figur 2B, 3B). Desuden billeddannelse af tumorer giver yderligere oplysninger om adskillige patologiske funktioner såsom tumorcelledød og tumorvaskulatur. Den lyse grøn fluorescens (Figur 1B-de midterste paneler) angiver den høje GFP udtryk, som er normalt forbundet med den levedygtige tumor parenkym. Henviser den manglende GFP i nogle tumorområder kan indikere tumorcelledød (
Da hovedparten af lungemetastaser er placeret på lungeoverfladen, kan de observeret under den regelmæssige dissektion mikroskop. De metastatiske læsioner er normalt tydeligt adskiller sig fra den omgivende parenkym (figur 2A). At verificere grove observationer og evaluere metastaser, der er dybere i lungeparenkymet, kan udføres fluorescerende billeddannelse af lunger (figur 2B), hvis GFP udtrykkende celler blev anvendt til injektion. Selvom lunge autofluorescens er klart synlig på billederne, lyse GFP-afledte fluorescens letter skelne metastaser fra omgivende lungeparenkym. Alternativt rutinemæssig histologi (figur 3A og 4A), sammenholdt med digital patologi algoritmer ( Flerfarvet FACS giver mulighed for at karakterisere selv sjældne cellepopulationer ved anvendelse af flerpolede celleoverfladen og / eller cytoplasmatiske markører samtidigt. Alveolære makrofager er kendetegnet ved manglen på CD11b-ekspression og ekspression af F4 / 80 og CD11c (figur 5). Den typiske fremgangsmåde til at identificere disse celler ved flowcytometri involverer: (i) udvælgelse af cellepopulation baseret på morfologi afbildet ved fremadrettet og sideværts spredningsegenskaber, (ii) udvælgelse af levedygtige CD45 + celler efterfulgt af (iii) gating af CD11b negative celler, og (iv) gating af celler med coekspression F4 / 80 og CD11c (figur 5A, B). 
Figur 1. Overvågning tumorvækst Through Animal Imaging. (A) Hvidt lys billeder af musen injiceret med GFP-udtrykkende celler i brystfedtpuden på forskellige tidspunkter efter tumorcelleinjektion. (B) Tilsvarende fluorescerende billeder opnået ved anvendelse af GFP-filter. Stiplede linjer markerer tumor område. Bemærk manglen på lys grøn fluorescens i nogle tumor områder på dag 26 der kan skyldes vævsnekrose eller udvikle neovaskulatur. Scale bar, 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2. Evaluering af Lung Metastatisk Burden. (A) Billeder af lungerne af mus injiceret med 4T1-celler i brystfedtpuden med overfladen metastaser (pile).(B) Billeder af GFP + lungemetastaser (lysegrønne fluorescens) opnået ved brug af imaging mikroskop. Scale bar, 10 mm. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3. Digital Histopatologi og konfokal mikroskopi i Billeddannelse af lungemetastaser. (A) scanning af hematoxylin og eosin (H & E) farvet lunge sektion fra mus injiceret med 4T1-celler i brystfedtpuden (mørkeblå tissue-metastaser). Scale bar, 4 mm. (B) Konfokal mikroskopi af GFP + lungemetastaser (lys grøn fluorescens). Scale bar, 200 um. Klik her for at se et større version af dette tal. 
Figur 4. Kvantificering af Lung Metastatisk Burden af Digital histopatologi. (A) Scanningen af hematoxylin og eosin (H & E) farvet lunge sektion (mørkeblå tissue-metastaser). (B) Billedet af lungerne vist i (A) dannet af en trainable histomorphology billedanalyse værktøj (software- "Genie"). Rød farve angiver lunge områder, som "Genie" som metastaser. Scale bar, 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 5. flowcytometri Approaches til Identifikation alveolære makrofager i lungerne. (A) Det representativeflow cytometrydot plotsillustrating gating strategi til at identificere CD45 + CD11b negative F4 / 80 + CD11c + alveolære makrofager. (B) repræsentant flowcytometri dot plotsillustrating effekt af kontrol eller clodronatpræparater liposomer på lunge alveolære makrofager. Tal i plots repræsenterer procentdele af gated celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning er støttet af Department of Defense giver TSA 140.010 til MK og BC 111.038 til MMM holdninger og meninger af, og påtegninger af forfatteren (e) ikke afspejler de den amerikanske hær eller det amerikanske forsvarsministerium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
