Protocol
모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 발표 한 "실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"에 설명 된 지침을 기관 동물 관리 및 텍사스 테크 대학 보건 과학 센터의 사용위원회의 승인을 이어왔다. 상업적으로 사용할 수있는 팔주 십이 세 여성 BALB / c 마우스를 사용합니다. 주사 1 × 10 5 4T1 또는 1 × 유방 지방 패드로 다양한 업체에서 구입할 수 있습니다 GFP를 표현하는 10 5 4T1 세포.
1. 4T1의 문화와 4T1-GFP 세포 및 주사 (14)에 대한 종양 세포 현탁액의 준비
- 4T1 및 4T1-GFP 세포 배양
참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.- RPMI 배지에서 4T1 및 4T1-GFP 세포는 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린를 유지한다G 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염.
주 : 셀의 모든 트립신 처리 및 도금을 계산하여 통로 번호를 확인합니다. 통로의 수는 세포의 발암 및 전이성 전위 영향으로는, 모든 마우스 실험 동일한 통로 번호 세포를 사용하는 것이 중요하다. - 세포 주입에 앞서 인큐베이터 및 흡 배지에서 80 % 컨 플루 언시에 종양 세포를 함유하는 상기 2 cm T75 플라스크를 제거한다. PBS의 10 ML을 추가하고 나머지 매체를 씻어 부드럽게 플라스크를 회전 한 후 PBS를 대기음.
- 플라스크에 EDTA와 0.25 % 트립신 2 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2로 37 ℃에서 3 분 동안 습한 인큐베이터에서 표면에 균일 용액을 분산 및 배양 기울.
- 세포의 분리를 용이하게하고 신선한 매체의 8 ml에 추가 할 수있는 플라스크를 누릅니다. 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다.
- 5 분 동안 원심 분리기 세포. 실온에서 500 XG에.뜨는을 기음과 PBS 10ml에 세포를 씻는다.
- 최대 피펫 아래로 여러 번 덩어리를 중단하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 세포 현탁액 100 ㎕를 취하여 제조자의 지시에 따라 세포 생존력 분석을 이용하여 세포 수를 계산.
- 실험에 사용 된 마우스의 마우스 X 번호 당 10 5 세포 (항상 안전을 위해 여분의 세포를 준비) : 공식을 사용하여 모든 주사에 필요한 세포의 수를 계산합니다.
- 1.1.5에서와 같이 원심 분리기 세포. 신선한 PBS의 양 흡입 재현 탁하고 세포를 통해 상청액을 제거하여 1 × 106 세포 / ml의 최종 세포 농도를 얻기 위해 필요한. 주입을위한 준비가 될 때까지 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
- RPMI 배지에서 4T1 및 4T1-GFP 세포는 10 % 열 불 활성화 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린를 유지한다G 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염.
- 4T1 또는 4T1-GFP 세포 주입 마우스 절차
- 종양 세포 주입 전날, 3 % 이소 플루 란 유도 챔버 마우스 마취. 마우스가 잠 정기적으로 호흡하면, 장소 t그는 코 콘 내부 코 수술 패드 마우스와 이소 플루 란 기화기에 연결합니다. 2.5 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다. 마우스가 마취되어 있는지 확인하기 위해 마우스 발가락을 꼬집어.
- 주사 부위에 면봉 (오른쪽 가슴 유방 지방 패드)를 사용하여 제모 크림을 적용하고 2 분 동안 기다립니다. 젖은 종이 타월을 사용하여 사이트를 청소, 다시 케이지에 마우스를 놓고는 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 주사 당일 1.2.2과 쥐를 마취하고 수술 용 패드 위에 놓는다.
- 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 종양 세포를 함유하는 튜브를 소용돌이. 대기음 0.5 ml의 인슐린 주사기에 1 × 105 개 종양 세포를 함유하는 세포 현탁액 100 ㎕ (29 G 12.7 mm 바늘 길이).
- 2 차 및 3 차 젖꼭지 근처에 엄지 손가락 인덱스를 사용하여 피부를 들어 올려 mammar에 주사기의 바늘을 삽입Y 지방 그냥 손가락 사이의 피부 아래에 세 번째 젖꼭지 아래 패드와 주입 세포는 천천히 거품 (피하 주사)을 형성한다.
- 다시 주입 후 케이지에 마우스를 놓고 1.2.2에서와 같이 모니터링 할 수 있습니다.
- 모니터링 종양 성장
- 캘리퍼스 측정 (14)
참고 : 4T1 주조 또는 4T1-GFP 세포는 공격적인 유방 종양을 형성한다. 세포 접종 후 5 - 일반적으로 만져서 알 수있는 종양은 4 일에서 ~ 나타납니다. 4T1-GFP 세포는 느리게 성장하고 나중에 전이를 제공 종양을 형성한다. 종양을 2 ~ 3 배 일주일을 측정합니다. 동물의 임상 적 상태가 악화되면 동물 종양 체중의 10 %를 초과하거나 즉시 마우스를 안락사, 궤양되고, 10 % 이상의 체중을 잃는다.- . 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취 수술 패드 장소 무게와 70 % 에탄올로 영역을 적시고.
- (- 오일 세포 접종 후 4) 주사 부위에 종양이 만져. <리> 캘리퍼와 가장 큰 직경 (D) 및 작은 직경 (D1)을 측정한다.
- 식 볼륨 = (DX (D1)의 X의 D1) / 2mm 3를 사용하여 종양 체적을 계산합니다. 1.2.2에서와 같이 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다.
- 캘리퍼스 측정 (14)
- 이미징 (전용에 대한 4T1 GFP 세포)
- 1.2.1와 같이 마우스를 마취. 이미징 기기 내부의 가동 단계에 마우스를 놓습니다. 코 콘을 통해 마취를 유지한다.
- 이미징 기기 및 제조업체의 지침에 따라 광원을 켭니다.
- 탭 "취득"에서 "조명"으로 이동하여 백색광의 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 빛 엔진이 켜져 있는지 확인하고 라이트 테이블에 '트랜스'를 선택합니다.
- 탭 "현미경"에서 "지우기"배출 필터와 0.5X 배율을 선택합니다. "카메라"탭에서 캡처 비닝하는 '1 × 1'미리보기 '는 4 × 4'인지 확인하십시오. 흰색 빛 종양의 위치를 미리보기를 클릭 선명한 영상을 얻을 수 초점을 캡처을 클릭합니다.
- 1 (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터링 "취득"탭을 변경 조명으로 이동합니다. 은 "현미경"탭에서 "20분의 530의 GF"에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다.
- 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더 (그림 1)에 저장합니다.
리포좀 10 2. 비강 관리
참고 : 달리 명시하지 않는 한 층류 (LAF) 생물 안전 캐비닛에 멸균 솔루션을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.
- 종양 세포 주입 후 6 일째 1.2.1에서와 같이 마우스 마취.
- 제조업체에서 얻은 클로드 또는 제어 (PBS) 리포좀 현탁액을 소용돌이. 리포좀의 μL (60)를 타고uspension 멸균 피펫 팁을 사용.
- 천천히, 마우스 용액에 숨을 쉴 수 있도록 콧 구멍 근처 (5 ㎕를 각 시간) 리포좀 솔루션을 출시 60 μL의 전체 용량이 투여 될 때까지 반복합니다.
- 마우스가 케이지에 다시 배치하기 전에 의식을 회복하자.
- 반복 리포좀 관리는 마우스까지 3 일마다 희생된다. 희생의 날에 리포좀을 관리하지 마십시오.
3. 마우스의 희생과 조직 컬렉션
참고 : 사용 멸균 및 마우스 해부에 대한 무균 악기. 동안 중요한 장기의 방혈 및 제거를 통해 마취 쥐를 안락사.
- 일 22 또는 일 (4T1 셀) (26) 종양 세포 주입 후 (4T1-GFP 세포) 1.2.1에서와 같이 마우스를 마취. 그리고, 기화기에 연결된 코 콘 수술 패드에 배치 1.2.1에서와 같이 마취를 유지한다. m 개의 않도록 발가락 중 하나를 꼬집어여러개 의식이다.
- 해부 보드에 바늘을 사용하여 발가락을 고정. 마우스 피부에 에탄올을 스프레이.
- 집게를 사용하여 피부를 들어 올려 수술 가위로 절개를합니다. 천천히 복막을 노출하고 목까지 흉부 피부를 통해 절단을 계속합니다.
- 수술 가위를 사용하여 복막에 절개를하고, 혈관의 손상을 방지면 팁 신중 장기 노출.
- 한쪽으로 장기를 이동하고 하대 정맥을 노출. 정맥에 구멍과 29 G 인슐린 주사기로 피를 수집합니다. 튜브에 수집 된 혈액을 놓고 추가 처리를 위해 얼음에 둡니다.
- 흉곽, 폐와 심장을 노출 다이어프램을 잘라. 천천히 뼈 커터를 사용하여 양쪽의 갈비뼈를 잘라 흉곽의 상단을 들어 올립니다. 집게로 마음을 잡고 흉강에 심장과 폐를 연결하는 결합 조직을 잘라.
- 60 mm 단위 PBS 소량의 폐 배치면역 형광 현미경 또는 [헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 포함] 루틴 조직학에 대한 동결 절편에 이미징 및 추가 처리를 위해 준비 될 때까지 얼음에 페트리 접시.
4. 폐 전이 평가
- 표면 전이 계산 및 채점
- 해부 현미경으로 폐와 페트리 접시를 놓습니다. 폐 표면의 밝은 전망을 얻기 위해 초점을 맞 춥니 다.
- 해부 현미경을 사용하여 폐 표면을 관찰한다. 모두 폐의 전방 및 후방 측면에 전이를 계산합니다.
주 : 정상적인 폐는 약간 흰 또는 분홍빛 및 다공성 구조와 같은 스폰지가 있습니다. 4T1 전이 종종 액체 (도 2A) 한 방울과 유사하게 나타나, 단단하고 비 다공성이다.
- 폐 영상
- 이미징 기기 내부의 이동식 무대에서 폐와 페트리 접시를 놓습니다.
- 악기와 켭니다멀티 스펙트럼 소스를 biolite. 소프트웨어를 엽니 다. 탭에서, "취득", "조명"로 이동하여 백색광 빈 위치 (아무 필터)로 전환합니다. 라이트 엔진 -> ON, 라이트 테이블 -> 에피. 탭 '현미경'에서 '지우기'방출 필터와 1.66X 배율을 선택합니다. "카메라"탭에서 캡처 비닝하는 '1 × 1'미리보기 '는 4 × 4'인지 확인하십시오.
- 미리보기를 클릭하고 흰색 빛 폐의 명확한 그림을 얻을 캡처를 클릭하여 초점을 맞 춥니 다.
- (제조업체의 지시에 따라 GFP에 대한 필터) 필터 1 "취득"탭과 변화에 이동합니다. 은 "현미경"탭에서 "20분의 530의 GF"에 방출 필터를 변경합니다. 녹색 채널의 미리보기 및 캡처 이미지. 적절한 밝기를 얻을 노출 시간을 조정합니다.
- 이미지에 사색을 적용하고 해당 폴더에 저장합니다.
- 유사한 방식으로, 다른 쪽의 화상을 얻기 위해 폐 플립. 이 PROCedure 더 적절한 소프트웨어 (그림 2B) (14)를 사용하여 정량화 할 수있다 GFP 양성 전이의 이미지를 생성합니다.
- 면역 형광 현미경
- 어두운 곳에서 4 시간 동안 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 폐 수정.
- 완전히 정착을 제거하기 위해 5 분 동안 10 ml의 PBS로 두 번 조직을 씻으십시오. PBS의 18 % 자당에 전송하고 4 ℃에서 O / N을 품어.
- 자당에서 조직을 제거하고 초과를 줘봐.
- cryomold을 가지고, 간섭 단층 매체와 바닥 층을 커버한다. 간섭 단층 매체에 조직을 놓습니다. 완전히 드라이 아이스의 조직과 장소를 커버하는 간섭 단층 매체와 금형을 입력합니다.
- 절편 때까지 -80 ° C에서 보관 블록.
- 충전 슬라이드에 저온 유지 장치와 장소 5 μm의 두께 섹션을 준비합니다.
- 또한 사용 때까지 -80 ° C에서 사용되지 않는 슬라이드를 저장합니다.
- 공기는 7 분 동안 슬라이드를 건조. 및 OCT를 제거하는 PBS로 세척. WIP전자 조직이나 종이 타월로 슬라이드 물을 초과를 제거 DAPI를 포함하는 매체를 장착하여 커버 슬립을 탑재하고 현미경으로 GFP 필터를 시각화한다.
- 적절한 소프트웨어 (14)의 사용과 GFP 전이 (도 3A)을 정량화.
- 조직학 및 디지털 병리학
- 시작 탭에서 수동로드 버튼을 클릭하고 스캐너에서 배출 랙을 들고 슬라이드를 기다립니다.
- 의 H & E 염색 조직 절편을 가지고있는 먼지를 제거 티슈로 청소하고, 슬라이드 들고 랙에 안전하게 배치합니다.
- 팝 업 창에서 슬라이드 설명을 입력합니다.
- 친위대 영상 콘솔 창에서 스캔 영역 탭을 선택하고 관심 (ROI)의 영역 스캔 할을 정의 할 수있는 녹색 사각형을 조정합니다.
- 조직이 투자 수익 (ROI) 내에서, 그러나, 결석 슬라이드의 명확한 부분에 푸른 교정 다이아몬드를 드래그합니다.
- 다음으로, 초점 P를 선택oints 탭은 ROI의 조직에 여러 개의 초점 포인트를 얻을 수있는 자동 선택 버튼 (노란색 더하기 기호)를 클릭합니다.
- 필요한 경우, 투자 수익 (ROI) 내에서 두 번 클릭하여 수동으로 추가 초점 포인트를 놓습니다.
- 교정 탭으로 이동하고 푸른 교정 다이아몬드 포인트에서 슬라이드 교정을 시작하기 위해 보정 버튼을 선택합니다. 교정이 완료된 후, 교정 포인트의 이미지가 표시된다.
- 이 명확하고 먼지 나 유물이 없는지 확인하기 위해이 이미지를 검사합니다.
- 스캔 탭으로 이동하고, 투자 수익 (ROI)의 스캔을 시작하기 위해 스캔 시작을 선택합니다. 스캔 조직 학적 섹션은 디지털 슬라이드로 변환된다 (그림 3B 및 4A)
- 이전에 (그림 4B) (14) 설명에 따라 전이성 부담을 정량화.
폐의 폐포 대 식세포 5. 유동 세포 계측법 (FACS) 분석
- 단일 셀 Suspensi의 준비...에
- 이미징 및 전이 계산 한 후, 멸균 PBS로 폐를 씻어 페트리 접시에 놓습니다. 수술 가위와 집게를 사용하여 폐의 2mm 조각 - 1을 확인합니다.
- (3) 1 ㎎ / ㎖의 콜라게나 P, 0.04mg / ㎖의 DNase I을 함유하는 분해 완충액 ㎖, 10 μg의 / ㎖ 트립신 용해 억제제 RPMI 배지 (멸균)과 15ml의 원뿔형 튜브에 폐 조각을 전송.
- 40 분 동안 37 ° C의 배양기에서 회전 진탕 기에서 인큐베이션 원추형 튜브.
- 조직을 떼어 놓다 아래로 인큐베이터에서 튜브 원뿔을 제거하고 솔루션을 피펫합니다.
- 덩어리를 방지하고 단일 세포 현탁액을 얻을 수있는 40 μm의 여과기를 통해 솔루션을 전달합니다. 필요한 경우, 주사기 플런저의 도움으로 셀 스트레이너에 대해 더 잘 소화 조직 프레스 조직을 분해합니다.
- 단일 세포 현탁액이 달성되면, 원심 분리하여 세포를 수집하고으로 적혈구를 용해시키기RT에서 10 분 동안 ACK 완충액 2 ㎖. 그 후, RPMI 8 ml의 펠릿 두 번 세척 하였다.
- 전체 RPMI 배지 3 ㎖와에 재현 탁 전지는 제조업체의 지침에 따라 세포 생존 분석기를 사용하여 계산 셀로 진행합니다.
- 표면 마커에 대한 폐 세포의 염색
참고 : 4 ° C에서 모든 배양을 수행합니다. 500 XG, 4 ℃에서 원심 분리기 판.- 피펫 V 바닥 96 웰 플레이트의 각각의 웰을 FACS 완충액 (PBS에 1 % FBS) 100 ㎕에 1 × 106 세포. V 자 바닥 96 웰 플레이트를 사용하면 여러 샘플을 나눠을 용이하게한다.
- 1 μg의 마우스와 차단 된 Fc 세포 현탁액을 사전 부화 15 분 동안 FACS 완충액 100 ㎕의 CD32 / 항 - 마우스 CD16 정제. 세포 펠렛과 판을 뒤집기 및 솔루션 드레인을 시켜서 뜨는을 제거하는 V 바닥 96 웰 플레이트를 원심 분리기.
- 표면 얼룩의 경우, 사전에 murin에 대한 항체를 희석하나의 튜브 (마스터 믹스)에 전자 항원 : BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b를 (/ 70 M1), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7의 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / 된 Fc 블록 CD16 10 ㎍ / ml를 함유 FACS 완충액 중 2.5 ㎍ / ml의 최종 농도 I E (MHCII) (M5 / 114.152) PE CD80 (16-10A1) AF 647 CD86 (GL-1) / CD32 항독소.
참고 : 항체의이 세트는 식별 및 폐포 대 식세포와 수지상 세포의 기능 상태를 평가하는 데 유용합니다. - V 자 바닥 96 웰 플레이트에 희석 항체 (마스터 믹스) 100 μl를 추가하고 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다.
- 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거하기 위해 플레이트를 원심 분리기. 5 분 동안 500g에 FACS 버퍼 200 μL, 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거합니다. 및 PBS 200 ㎕의 세포를 재현 탁.
- PBS (1,000 일)에 희석 가능성 염료를 세포 펠렛을 추가 할 수있는 판을 원심 분리기. 4 ℃에서 20 분 동안 품어. </ 리>
- 세포 펠렛 및 5.2.2에서와 같이 뜨는을 제거 할 수있는 판을 원심 분리기. PBS 200 μL로 세척하고 다시 접시를 원심 분리기.
- FACS 악기에 의해 인수 될 때까지 4 ° C에서 1 % 파라 포름 알데히드 및 저장 100 ㎕에 재현 탁 세포. 폴리 프로필렌 FACS 튜브에 수집 전송 세포 현탁액에 앞서.
6. FACS 데이터의 분석 : 게이팅 전략과 세포의 부분 집단의 식별
- 이전에 (10)를보고 FACS 분석을 수행합니다. 게이트 셀 포워드 (FSC)을 기반으로 / 이벤트 및 측면 산란 (SSC)를 취득; 다음 라이브 게이트와 CD45 + 세포. 폐포 대 식세포 식별, 게이트 부정적인 CD11b를-다음의 CD11c + F4 / 80 + 세포. (도 5a).
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Representative Results
전이가 빠르게 폐 (도 2), 간, 뼈 형성으로 유방 지방 패드로 4T1-GFP 종양 세포의 주입은, 인간 유방암 전이 확산 요점을 되풀이 마우스 종양 (도 1a)의 형성을 유도 와 마우스 (11)의 뇌. GFP와 4T1 세포의 안정한 형질 감염은 종양 성장의 모니터링을 용이하게한다 (도 1B), 전이되는 종양 세포의 추적 및 전이성 부담 (도 2B, 3B)을 정량화. 또한, 종양의 영상은 종양 세포 사멸 및 종양 맥관 여러 병리학 적 특성에 관한 추가 정보를 제공한다. 밝은 녹색 형광 (그림 1B-중간 패널) 일반적으로 가능한 종양 실질과 연관된 높은 GFP 발현을 나타냅니다. 일부 종양 영역에서는 GFP의 부족 (종양 세포 사망을 나타낼 수있는 반면
폐 전이의 대부분이 폐 표면 상에 위치되기 때문에, 이들은 일반 해부 현미경으로 관찰 할 수있다. 전이성 병변은 분명 일반적으로 주변 실질 (그림 2A)와 구별된다. 육안 관찰을 확인하고 폐 실질 내 깊다 전이를 평가하기 위하여 폐의 형광 촬상을 행할 수있다 (도 2b), GFP 발현 세포 주입에 사용 된 경우. 폐 형광도가 이미지에 명확하게 볼 수 있지만, 밝은 GFP에서 파생 된 형광은 폐 실질을 주변에서 구별 전이를 용이하게한다. 대안 적으로, 디지털 병리학 알고리즘과 함께 루틴 조직학 (도 3a 및도 4a) ( 다색 FACS는 다극 세포 표면 및 / 또는 동시에 세포질 마커의 사용을 통하여 희귀 세포 집단을 특성화하는 기회를 제공한다. 폐포 대 식세포는 CD11b를 발현과 발현 F4 / 80과의 CD11c (그림 5)의 부족에 의해 특징입니다. 전방 및 측면 산란 특성에 의해 도시 형태에 따라 세포 인구의 (ⅰ) 선택, 실행 가능한 CD45 + CD11b를 음성 세포의 (ⅲ) 게이팅 다음 세포 (ⅱ) 선택 : 유동 세포 계측법 포함하여 일반적인 접근 방식은 이러한 세포를 식별 및 F4 / 80과의 CD11c를 coexpressing 셀 (IV)의 게이트 (도 5A, B). 
그림 1. 모니터링 종양 성장 Through 동물 이미징. (A) GFP은 종양 세포 주입 후 상이한 시점에서 유방 지방 패드로 발현 세포를 주입 한 마우스 백색광 이미지. (B) GFP 필터를 사용하여 얻은 형광 이미지를 대응. 점선은 종양 영역을 표시한다. 조직 괴사 또는 개발 neovasculature으로 인해 발생할 수있는 날 (26)에 대한 몇 가지 종양 분야에서 밝은 녹색 형광의 부족을합니다. 스케일 바, 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 2. 평가 폐의 전이성 부담. 표면 전이 (화살표)와 유방 지방 패드에 4T1 세포를 주입 한 쥐의 폐 (A) 이미지.(B) GFP + 폐 전이 (밝은 녹색 형광)의 이미지 영상 현미경의 사용을 통해 얻을. 스케일 바, 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
폐 전이의 이미지 그림 3. 디지털 조직 병리학 및 공 초점 현미경. (A) 유방 지방 패드에 4T1 세포를 주입 한 쥐에서 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 폐 부분의 스캔 (다크 블루 조직 전이). 스케일 바, 4mm. (B) GFP + 폐 전이의 공 초점 현미경 (밝은 녹색 형광). 스케일 바, 200 μm의. 더 큰 버전?을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 N. 
그림 4. 디지털 조직 병리학에 의해 폐 전이성 부담의 정량화. (A) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 폐 부 (다크 블루 조직 전이)의 스캔. (B) (A)에 도시 된 폐의 이미지에 의해 생성 훈련 가능한 histomorphology 이미지 분석 도구 (소프트웨어 - "니"). 붉은 색 전이로 "지니"에 의해 식별되는 폐 영역을 나타냅니다. 스케일 바, 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 5. 유동 세포 계측법 앱폐의 폐포 대 식세포를 식별 바퀴벌레. (A) CD45 + CD11b를 제외 F4 / 80 +하는 CD11c + 폐포 마크로파지를 식별 게이팅 전략 plotsillustrating cytometrydot representativeflow. (B) 주제 유동 세포 계측법 폐의 폐포의 대 식세포에 대한 제어 또는 클로드 리포좀의 plotsillustrating 효과를 점. 플롯의 숫자는 문이 세포의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 미국 육군이나 국방부 분들을 반영하지 않습니다 저자 (들)에 의해 뷰와의 의견 및 보증을 MMM하는 MK와 BC 111,038에 TSA 140,010을 부여 국방부에 의해 지원되고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
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