Protocol
Все исследования на животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Техасского университета Центра Наук Здоровья и следовали принципам, изложенным в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных", опубликованной Национальным институтом здравоохранения. Использование восьми до двенадцати недельных самок мышей BALB / C мышей, которые являются коммерчески доступными. Вводят 1 х 10 5 4T1 или 1 х 10 5 4T1 клетки , экспрессирующие GFP, который можно приобрести у различных поставщиков, в жировой ткани молочных желез.
1. Культура 4T1 и 4T1-GFP клетки и подготовка опухоли клеточной суспензии для инъекций 14
- 4T1 и 4T1-GFP Культура клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги с использованием стерильных растворов в ламинарном потоке воздуха (LAF) биологической безопасности кабинета, если не указано иное.- Поддерживать 4Т1 и 4Т1-GFP клетки в RPMI среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка и 100 ед / мл пенициллинаG и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата.
Примечание: Определить количество проходов путем подсчета каждый трипсинизации и покрытие клеток. Важно, чтобы использовать клетки с тем же самым числом пассажей всех экспериментах мышей, поскольку число проходов влияет клеток онкогенность и метастатический потенциал. - Перед инъекциями клеток удалить T75 см 2 колбы, содержащей опухолевые клетки на 80% сплошности, из инкубатора и аспирата среды. Добавьте 10 мл PBS и вращать колбу осторожно, чтобы промыть оставшийся носитель, а затем аспирация PBS.
- Добавляют 2 мл 0,25% трипсина с ЭДТА в колбу и наклонить его , чтобы распределить раствор равномерно на поверхности и инкубировать в увлажненном инкубаторе в течение 3 мин при 37 ° С с 5% CO 2.
- Нажмите колбу, чтобы облегчить отделение клеток и добавить 8 мл свежей среды. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить комки и получить клеточную суспензию.
- Центрифуга клетки в течение 5 мин. при 500g при комнатной температуре.Аспирируйте супернатант и промыть клетки в 10 мл PBS.
- Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить комки и получить клеточную суспензию. Возьмите 100 мкл суспензии клеток и подсчета клеток с использованием анализатора жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Подсчитайте количество клеток , необходимых для всех инъекций по формуле: 10 5 клеток на мышь х # мышей , используемых в эксперименте (всегда готовятся дополнительные ячейки , чтобы быть на безопасной стороне).
- Центрифуга клетки, как в 1.1.5. Удалить супернатант через аспирацией и ресуспендируют клеток в количестве свежего PBS , необходимое для получения конечной концентрации клеток 1 × 10 6 клеток / мл. Держите клеточной суспензии на льду до готовности к инъекции.
- Поддерживать 4Т1 и 4Т1-GFP клетки в RPMI среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка и 100 ед / мл пенициллинаG и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата.
- Процедуры инъекции мыши 4Т1 клеток или 4T1-GFP
- За день до инъекции опухолевых клеток, обезболить мышей в индукционной камере с 3% изофлуран. После того, как мыши спят и регулярно дышать, место тон мыши на хирургическом площадку с носом внутри носового конуса, и подключить его к изофлурановым испарителем. Поддержание анестезии с 2,5% изофлуран. Сожмите палец мыши, чтобы гарантировать, что мышь находится под наркозом.
- Нанесите крем для удаления волос с помощью ватного тампона на месте инъекции (правая грудная молочной жировой ткани) и подождать в течение 2 мин. Очистите участок, используя влажное бумажное полотенце, положите мышь обратно в клетку и контролировать животное, пока он не восстановит достаточное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее.
- В день инъекции, анестезию мышей, как в пункте 1.2.2 и поместить на хирургическом площадку.
- Vortex трубки, содержащей опухолевые клетки, чтобы получить однородную суспензию клеток. Отберите по 100 мкл клеточной суспензии, содержащих от 1 х 10 5 опухолевых клеток в инсулиновый шприц объемом 0,5 мл (29 г, 12,7 мм длина иглы).
- Подтяжка кожи с помощью индекса большим и указательным пальцем возле 2 - й и 3 - й сосок, вставьте иглу шприца в Mammarу жировой ткани чуть ниже третьего соска под кожу между пальцами и инъекционные клетки медленно с образованием пузырьков (подкожной инъекции).
- Поместите мышь обратно в клетку после инъекции и контролировать, как и в пункте 1.2.2.
- Рост опухоли Мониторинг
- Суппорт Измерения 14
Примечание: Введенный 4T1 или 4T1-GFP клетки образуют агрессивную опухоль молочной железы. Обычно ощутимой опухоли появляются ~ в 4-й день - 5 после инокуляции клеток. 4T1-GFP клетки образуют опухоли, которые растут медленнее и дают метастазы позже. Мера опухоль в два-три раза в неделю. Если клиническое состояние животных ухудшается, животные теряют более 10% массы тела, опухоли превышает 10% от массы тела или стать изъязвление, усыпить мышей немедленно.- Обезболить мышь, как и в пункте 1.2.1., Вес, место на хирургическом площадку и намочить область с 70% этанола.
- Пропальпируйте опухоль в месте инъекции (4 - 5 дней после того, как инокуляции клеток). <Li> Измерьте наибольший диаметр (D) и меньший диаметр (D1) с суппортом.
- Рассчитать объем опухоли , используя формулу Volume = (DX X d1 d1) / 2 мм 3. Монитор восстановления мыши от анестезии, как и в пункте 1.2.2.
- Суппорт Измерения 14
- Обработки изображений (только для 4Т1 GFP клетки)
- Обезболить мышь, как и в разделе 1.2.1. Поместите мышь на подвижной стадии внутри прибора визуализации. Поддержание анестезии через носовой конус.
- Включите прибор формирования изображения и источника света в соответствии с инструкциями изготовителя.
- На вкладке "Приобретение" перейти к "Lighting" и переключиться на пустой позиции (без фильтра) для белого света. Убедитесь, что индикатор работы двигателя и выберите 'Trans' в световом столе.
- На вкладке "Микроскоп", выберите "Очистить" эмиссионный фильтр и 0.5x увеличение. На вкладке "Camera", убедитесь, что биннинг для захвата '1 х 1' и предварительный просмотр "4 х 4 '. Нажмите на превью, чтобы найти опухоль в белом свете, фокус, чтобы получить четкое изображение, и нажмите кнопку захвата.
- Перейти к разделу "Приобретение" на вкладке и изменения освещения для фильтрации 1 (фильтр для GFP в соответствии с инструкцией завода-изготовителя). На вкладке "Микроскоп", изменить эмиссионный фильтр на "530/20 GF". Предварительный просмотр и захват изображения в зеленом канале. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы получить соответствующую яркость.
- Применить псевдоцвете к изображению и сохранить в соответствующей папке (рисунок 1).
2. интраназальное введение липосом 10
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги с использованием стерильных растворов в ламинарном потоке воздуха (LAF) Биобезопасность шкафа, если не указано иное.
- На 6-й день после инъекции опухолевых клеток обезболить мышей, как в 1.2.1.
- Vortex клодроната или контроля (PBS), полученную суспензию липосом от производителя. Возьмите 60 мкл липосомная suspension с использованием стерильной пипетки.
- Медленно отпустите липосом раствор (5 мкл каждый раз) вблизи ноздри, позволяя мышь дышать в растворе, повторяют до тех пор, вся доза 60 мкл не вводят.
- Пусть мышь очнуться перед установкой его обратно в клетку.
- Повторное введение липосомная каждые 3 дня до мышей умерщвляли. Не управлять липосом в день жертвоприношения.
3. Жертвоприношение мышь и тканей Коллекция
Примечание: Используйте автоклавированы и стерильные инструменты для рассечения мыши. Эвтаназии мышей под наркозом через обескровливание и удаление жизненно важных органов.
- В день 22 (Для 4Т1 клеток) или день 26 (для 4Т1-GFP клеток) после инъекции опухолевых клеток анестезию мыши, как в 1.2.1. и место на хирургическом площадку с конусообразной, соединенного с испарителем, поддержания анестезии, как и в разделе 1.2.1. Зажмите один из пальцев ноги, чтобы гарантировать, что в мУз находится в бессознательном состоянии.
- Закрепление пальцы с помощью иглы к рассечение борту. Спрей этанол на кожу мыши.
- Подтяжка кожи с помощью пинцета и сделать надрез с хирургическими ножницами. Медленно подвергать брюшины и продолжать резки кожи через грудную клетку до шеи.
- Используя хирургические ножницы сделать разрез в брюшине и тщательно подвергать органы с хлопковыми наконечниками исключается опасность повреждения кровеносных сосудов.
- Перемещение органов в одну сторону и выставить нижнюю полую вену. Прокол вены и собирают кровь с 29 G инсулина шприц. Поместите собранную кровь в пробирку и оставляют на льду для дальнейшей обработки.
- Вырезать диафрагму, чтобы выставить грудную клетку, легкие и сердце. Медленно разрезать грудную клетку с обеих сторон с помощью резака кости и поднимите верхнюю часть грудной клетки. Возьмите сердце с пинцетом и вырезать соединительной ткани, соединяющей сердце и легкие в грудной полости.
- Поместите в легкие в небольшом количестве PBS в 60 ммПетри на льду до готовности для обработки изображений и дальнейшей обработки замороженных срезов для иммунофлуоресцентного микроскопии или рутинной гистологии [в том числе гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание].
4. Метастазы легких Оценка
- Подсчет и Забив Surface метастазами
- Поместите чашку Петри с легкими под микроскопом рассечение. Фокус, чтобы получить четкое представление о поверхности легких.
- С помощью микроскопа рассечение наблюдения за поверхностью легких. Граф метастаз на передней и задней сторонах обоих легких.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальное легкое беловатые или розоватые и пористым и имеет губку, как структура. 4T1 Метастазы являются твердыми и непористой, иногда , как представляется, похожи на капли жидкости (фиг.2А).
- томография легких
- Поместите чашку Петри с легких на подвижной стадии внутри прибора визуализации.
- Включите прибор и набиотит мультиспектральных источник. Откройте программное обеспечение. На вкладке "Приобретение", перейдите в раздел "Освещение", и переключиться на пустой позиции (без фильтра) для белого света. Light Engine -> ON, свет стола -> Epi. На вкладке "Микроскоп" Выберите "Очистить" эмиссионный фильтр и 1.66X увеличение. На вкладке "Camera", убедитесь, что биннинг для захвата '1 х 1' и предварительный просмотр "4 х 4 '.
- Нажмите на превью и фокус, чтобы получить четкую картину легких в белом свете и нажмите кнопку захвата.
- Перейдите на вкладку "Приобретение" и изменение фильтра 1 (фильтр для GFP в соответствии с инструкцией завода-изготовителя). На вкладке "Микроскоп", изменить эмиссионный фильтр на "530/20 GF". Предварительный просмотр и захват изображения в зеленом канале. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы получить соответствующую яркость.
- Применить псевдоцвете к изображению и сохранить в соответствующей папке.
- Флип легкие, чтобы получить изображение с другой стороны таким же образом. Это Procedure создает образы GFP-положительных метастазов , которые могут быть дополнительно определены количественно с помощью соответствующего программного обеспечения (Рисунок 2B) 14.
- иммунофлуоресцентного Микроскопия
- Закрепить легкие в 4% параформальдегид, при 4 ° С в течение 4 часов в темноте.
- Промыть ткань в два раза с 10 мл PBS в течение 5 мин, чтобы полностью удалить закрепитель. Переход к 18% сахарозы в PBS и инкубировать O / N при температуре 4 ° С.
- Удалите ткань из сахарозы и промокните излишки.
- Возьмите cryomold, покрывают нижний слой ОКТ среды. Поместите ткань на ОКТ среде. Заполните форму с ОКТ среды, чтобы полностью покрыть ткань и место на сухом льду.
- блок Хранить при температуре -80 ° C до секционирования.
- Подготовьте 5 мкм толщиной секций с криостата и место на заряженных горками.
- Храните неиспользуемые слайды -80 ° С до дальнейшего использования.
- Воздух сухой слайдов в течение 7 мин. и промывают PBS для удаления развертывания Office. Wipе слайд с тканью или бумажным полотенцем, чтобы удалить избыток воды, крепление крышки слипы с монтажной средой, содержащей DAPI и визуализации с фильтром GFP под микроскопом.
- Количественно GFP метастаз (рис 3А) с использованием соответствующего программного обеспечения 14.
- Гистологии и Digital Патология
- Нажмите кнопку ручной загрузки на вкладке запуска и ждать слайд холдинга стойку, чтобы извлечь из сканера.
- Возьмите раздел H & E окрашивали ткани, очистить его с тканью, чтобы удалить грязь, и поместить его надежно в слайд держа стойку.
- Введите описание слайд в появившемся окне.
- Выберите вкладку Область сканирования в окне консоли изображения SS и отрегулируйте зеленый квадрат, чтобы определить область интереса (ROI) для сканирования.
- Перетащите синий калибровочный алмаз на прозрачную часть слайда, где ткань отсутствует, однако, в пределах ROI.
- Далее, выберите Фокус Points вкладку и нажмите на кнопку Auto Select, чтобы получить несколько точек фокусировки (желтый плюс знаки) на ткани в ROI.
- При необходимости, установите дополнительные точки фокусировки вручную с помощью двойного щелчка внутри ROI.
- Перейдите на вкладку калибровать и нажмите кнопку калибровки, чтобы начать калибровку слайд в синей точке калибровки алмаза. После завершения калибровки будет отображаться изображение с точки калибровки.
- Проверьте это изображение, чтобы убедиться, что это чистой и свободной от грязи или артефактов.
- Перейдите на вкладку Scan и выберите Начать сканирование, чтобы начать сканирование ROI. Отсканированное гистологический срез преобразуется в цифровой слайд (рис 3B и 4A)
- Количественно метастатического нагрузку , как описано ранее (рисунок 4б) 14.
5. Проточная цитометрия (FACS) Анализ альвеолярных макрофагах в Легких
- Получение одноклеточ- Suspensiна
- После визуализации и подсчета метастазов, промойте легкие стерильной PBS и поместить в чашку Петри. Сделать 1 - 2 мм кусочки легких с помощью хирургических ножниц и щипцов.
- Передача части легких к 15 мл коническую пробирку с 3 мл буферного раствора, содержащего сбраживания 1 мг / мл коллагеназы P, 0.04mg / мл ДНКазы I, и 10 мкг мл трипсин ингибитора растворенной среды / RPMI (стерильный).
- Выдержите в конической трубе на вращающемся шейкере в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 40 мин.
- Снимите коническую трубку из инкубатора и пипеткой решение вверх и вниз, чтобы отделить ткани.
- Пропускают раствор через сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы избежать комков и получить суспензию единичных клеток. При необходимости, чтобы разложить лучше переваренной ткани пресс ткани против ситом клеток с помощью поршня шприца.
- Когда одноклеточной суспензии было достигнуто, собирают клетки центрифугированием и лизировали эритроциты с2 мл буфера ACK в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем моют гранулу два раза в 8 мл RPMI.
- Ресуспендируют клетки в 3 мл полной среды RPMI и перейти к ячейке подсчета с использованием анализатора жизнеспособности клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Окрашивание клетки легких для поверхностных маркеров
Примечание: Выполнить все инкубацию при 4 ° С. Центрифуга пластины при 500g и 4 ° C.- Пипетка 1 х 10 6 клеток в 100 мкл FACS буфера (1% FBS в PBS) в отдельные лунки V-дно 96-луночного планшета. Использование V-дно 96-луночного планшета облегчает сдачу нескольких образцов.
- Инкубировать клеточной суспензии с 1 мкг Fc мыши Block очищенные анти-CD16 мыши / CD32 в 100 мкл буфера FACS в течение 15 мин. Центрифуга V-дно 96-луночного планшета для осаждения клеток и удалить супернатант, переворачивая тарелку и дать утечку раствора.
- Для поверхностного окрашивания, заранее, разбавить антитела к Муринае антигены в одной пробирке (мастер - микс): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (М1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (М5 / 114,152), ПЭ CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) до конечной концентрации 2,5 мкг / мл в буфере FACS , содержащих 10 мкг / мл Fc блока CD16 / CD32 антитело.
Примечание: Этот набор антител полезен для идентификации и оценки функционального состояния альвеолярных макрофагов и дендритных клеток. - Добавляют 100 мкл разбавленных антител (мастер-смесь) до лунки V-дно 96-луночного планшета и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
- Центрифуга пластину для осаждения клеток и удаления надосадочной жидкости, как в 5.2.2. Промыть клетки с 200 мкл буфера FACS, центрифуге при 500 г в течение 5 мин. Удалить супернатант, как в 5.2.2. и ресуспендирования клеток в 200 мкл PBS.
- Центрифуга пластину для осаждения клеток и добавить жизнеспособность красителя, разбавленного в PBS (1: 1000). Инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С. </ Li>
- Центрифуга пластину, чтобы осадить клетки и удалить супернатант, как в 5.2.2. Промыть 200 мкл PBS и центрифугировать планшет снова.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1% параформальдегидом и хранят при температуре 4 ° С до приобретения FACS инструмента. До переноса сбора суспензии клеток к полипропилену FACS труб.
6. Анализ FACS данных: Gating Стратегии и идентификация клеточных субпопуляциях
- Выполнить анализ FACS , как сообщалось ранее 10. Gate приобрела клеток / события, основанные на прогнозных (FSC) и бокового разброса (SSC); а затем ворота жить и CD45 + клетки. Для альвеолярного макрофага идентификации, ворота CD11b-отрицательные , а затем CD11c + F4 / 80 + клеток. (Рисунок 5А).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инъекции опухолевых клеток 4T1-GFP в молочной жировой ткани приводит к образованию опухолей мышей (Рисунок 1А) , что Повторим метастазирования рака молочной железы человека, так как метастазы быстро образуются в легких (рисунок 2), печень, кости и мозг мышей 11. Стабильной трансфекции клеток 4Т1 с GFP облегчает контроль роста опухоли (Фигура 1В), отслеживание метастазированием опухолевых клеток и количественной оценки метастатического нагрузку (Фигура 2В, 3В). Кроме того, изображение опухолей дает дополнительную информацию относительно нескольких патологических признаков, таких как гибель опухолевых клеток и сосудистой сети опухоли. Ярко - зеленая флуоресценция (Фигура 1В-средние панели) указывают на высокий уровень экспрессии GFP, который обычно ассоциируется с жизнеспособной паренхимы опухоли. Принимая во внимание отсутствие GFP в некоторых опухолевых областей может указывать на гибель опухолевых клеток (
Так как большинство метастазов в легких находятся на поверхности легких, их можно наблюдать под микроскопом рассечение регулярным. Метастатические поражения, как правило , явно отличаются от окружающей паренхимы (фиг.2А). Для проверки грубых наблюдений и оценки метастазов, которые глубже в легочной паренхимы, флуоресцентная томография легких может быть выполнена (рис 2В), если GFP экспрессирующие клетки были использованы для инъекций. Хотя аутофлуоресценция легких отчетливо видно на изображениях, яркие GFP полученных флуоресценции облегчает отличительные метастазов от окружающих паренхимы легких. В качестве альтернативы, подпрограмма гистологию (Фигура 3А и 4А) в сочетании с алгоритмами цифровой микроскопии ( Многоцветный FACS дает возможность охарактеризовать популяции даже редкие клетки путем использования мультипольном клеточной поверхности и / или цитоплазматических маркеров одновременно. Альвеолярные макрофаги характеризуются отсутствием экспрессии CD11b и выражения F4 / 80 и CD11c (рисунок 5). Типичный подход к идентификации этих клеток с помощью проточной цитометрии , включает в себя: (I) , выбор популяции клеток , основанный на морфологии , изображаемой вперед и свойства бокового рассеяния, (II) отбор жизнеспособных CD45 + клеток с последующим (III) стробирования CD11b отрицательных клеток, и (IV) стробирование клеток F4 / совместной экспрессии 80 и CD11c (рис 5А, в). 
Рисунок 1. Мониторинг роста опухоли Through изображений животных. (А) Белые светлые изображения мыши , инъецированных GFP - экспрессирующих клеток в жировой ткани молочных желез в различные моменты времени после инъекции опухолевых клеток. (В) Сообразно флуоресцентные изображения , полученные посредством использования фильтра GFP. Пунктирные линии обозначают зону опухоли. Обратите внимание на отсутствие ярко-зеленой флуоресценции в некоторых опухолевых областях на 26 день, которые могут возникнуть в результате некроза тканей или развивающихся сосудистую. Шкала бар, 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 2. Оценка Lung Метастатической Бёрден. (A) Изображения легких мышей , которым вводили клетки 4Т1 в жировой ткани молочных желез с поверхностными метастазами (стрелки).(B) Изображения GFP + метастазов в легких (ярко - зеленая флуоресценция) , полученный за счет использования визуализации микроскопа. Шкала бар, 10 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 3. Цифровой гистопатология и конфокальной микроскопии в визуализации легочных метастаз. (A) сканирование гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных секции легких мышей , которым вводили 4Т1 клеток в молочной жировой ткани (темно - синие ткани метастазы). Шкала бар, 4 мм. (B) конфокальной микроскопии GFP + метастазов в легких (ярко - зеленая флуоресценция). Масштаб бар, 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versioп этой фигуры. 
Рисунок 4. Количественное легких метастатического Burden цифровыми гистопатологией. (A) скан гематоксилином и эозином (H & E) секции окрашивают легких (темно - синяя ткань метастаз). (В) Образ легких , показанных на (A) , порожденную обучаемый инструмент анализа histomorphology изображения (Software- "Genie"). Красный цвет указывает на участки легких, идентифицированные "Genie", как метастазы. Шкала бар, 5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 5. Проточная цитометрия Appтараканы для идентификации альвеолярными макрофагами в легких. (А) representativeflow cytometrydot plotsillustrating стратегию стробирования для выявления CD45 + CD11b отрицательный F4 / 80 + CD11c + альвеолярные макрофаги. (B) цитометрии представитель потока точка plotsillustrating эффект управления или клодроната липосом на альвеол легких макрофагов. Числа в участках представляют собой процент закрытого типа клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Министерством обороны предоставить АСП 140010 МК и BC 111038 в МММ Взгляды и мнения, а также одобрения от автора (ов) не отражают армии США или Министерства обороны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
