Summary
この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa 2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。
Introduction
卵（卵母細胞）の活性化における細胞内Caの変化2+濃度は、全ての研究生物1,2の保存コンポーネントです。このイベントは、細胞周期の再開と、記憶されたmRNAの翻訳などのCa 2+依存性プロセスの広い範囲を、開始します。細胞内Ca 2+濃度の一過性の変化を可視化するのCa 2+のためのこの要件にキー注目されています。
歴史的に、モデル生物は、その卵の大きさと可用性に基づいて卵活性化の研究のために選択しました。様々な可視化手法では、次のようにシステム内の細胞内Ca 2+濃度の変化に従って、定量化するために利用されてきた：メダカ3における発光タンパク質エクオリンを、このようなフラ-2ウニとハムスター4,5のようにの Ca 2+感受性蛍光色素;そして、カルシウムグリーン1デキストランアフリカツメガエル 6インチ
遺伝的にコードされたカルシウム指標（GECIs）の生成および改良は、in vivo 7 中の Ca 2+動態を可視化する能力を変えてきました。これらの遺伝子構築物は、特定の組織で発現し、侵襲性の組織標本8の必要性を制限しています。
GCaMPsは、それらの高い親和性の Ca 2+、信号対雑音比及び9-11をカスタマイズするための能力に非常に有効であった緑色蛍光タンパク質（GFP）GECIsのベースクラスです。 Ca 2+の存在下では、GCaMP複合体は、カルモジュリンへのCa 2+の結合を開始し、コンフォメーション変化のシリーズを受けることGFP部品9の蛍光強度の増加をもたらします。
GCaMPsは広く、細胞内カルシウム12の変化を可視化するために、 ショウジョウバエの神経細胞の研究に使用されています。最近のアプリケーションシート成熟したショウジョウバエの卵中のCa 2+を可視化するGCaMP技術の上で卵活性化13,14で単一の一過性のCa 2+波を明らかにしました。 Ca 2+波は、ex vivoで活性化アッセイ13,14を用いてインビボ 13 またはより高い倍率で排卵時低倍率で視覚化することができます。 ex vivoでのアッセイでは、個々の成熟した卵母細胞を卵巣から単離し、低張溶液を用いて活性化され、in vivoで活性化15-17のイベントを再現することが示されている活性化緩衝液と呼ばれます。
このex vivoのアッセイは、薬理学的破壊、物理的な操作と遺伝的変異体を含む、異なる実験条件の下でのCa 2+波の容易な高解像度の可視化を可能にします。この記事では、ex vivo活性化及び目のための成熟したショウジョウバエの卵の調製を示しますGCaMPを使用してのCa 2+波を可視化するために使用する電子その後の顕微鏡。このアプローチは、Ca 2+波の開始と制御をテストし、下流の結果を調べるために使用することができます。
Protocol
注：特に明記しない限り、室温ですべてのステップを実行します。
1.解剖の準備
注：ここで説明する手順は、E Gavis、プリンストン大学＆ワイルらに従っています。アル。18。 2日間の撮影前に、次の手順を実行します。
- 固形食品の約10ミリリットルを含むフライバイアルを取り、1コーナーに乾燥酵母の少量を追加し、1g未満で十分です。
注：フライバイアルまたは食品に関する情報は、「 ショウジョウバエのメンテナンス」19を参照してください。 - 酵母を水和するために3滴の水 - 1を追加します。
- 45°の角度で脇バイアルを設定し、3許可 - 水を取るために酵母のための5分。
- 酵母は水を吸収している間に、最近（myristoyを浮上している浴槽-VP16GAL4（GCaMP5と呼ばれる）によって駆動UASt- マイア GCaMP5 20を発現しているハエのボトルを選択GCaMP5のされた関連の形）が卵に膜にGECIをテザリングを介して、高い信号対雑音比を提供するために選ばれました。
- CO 2ガスを瓶の中にハエをAnaesthetize。ウェットフードでハエを失わないように、倒立ボトルを保つようにしてください。
- CO 2パッドの上に麻酔ハエヒントとソート10から15人の女性と解剖顕微鏡下で絵筆を使用して5人の男性。注：解剖のための健康的なメスを提供するために、男性を含めるための規格です。
- ステップ1.3からのバイアルの準備ができたら、バイアルに選択されたハエを追加します。ハエがアクティブになるまでバイアル水平を保つように注意してください。
- 約36時間、25℃でバイアルを置きます。
- ボトルや廃棄にCO 2パッドから残りのハエを返します。
2.解剖ショウジョウバエ卵巣
注：ここで説明する手順は、ワイルらに従っています。アル。 3.単離個々の熟卵 4.イメージングのための準備 5.イメージングex vivoで卵活性化 6.買収後の画像処理
注：CO 2の追加注：成熟卵は卵巣結合組織から容易に分離する可能性があります。
注：最良の結果を得るために、穏やかに卵の側面に沿ってプローブを実行します。
注：これは卵に損傷を与えることができるよう背付属を引っ張ることは避けてください。
注：将来のイメージングセットアップに応じて、最大撮影領域のためのカバーガラスに垂直に200μm程度離れて卵を合わせます。
注：活性化緩衝液は低張性緩衝液である：3.3ミリモルのNaH 2 PO 4、16.6 mMのKH 2 PO 4、10mMの塩化ナトリウム、50mMのKClを、5％のポリエチレングリコール8,000は、2mMのCaCl 2を 、1を用いてpHを6.4にしました。 NaOHを5比：KOH。詳細についてはMahowald、1983年15を参照してください。活性化緩衝液のアリコートを2週間までヶ月と4℃で-20℃で保存することができます。
注：広視野共焦点、スピニングディスク又は光学シート用顕微鏡を使用することができます。私たちは、倒立顕微鏡を使用することをお勧めします。私たちの代表的な結果は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。
注意：手順4.6について - 4.7、ソフトウェアコマンドは、顕微鏡やメーカーによって異なります。
注：これは、最初のビーム経路を壊すピペットによる影として表示されますが、また、小さな油滴の外観になります。一部の油滴は、実験の結果および画像品質に影響を与える成熟した卵子に関連付けられたままにすることができます。
注：これにより起動時の卵母細胞の膨潤に、いくつかの卵室は、活性化緩衝液を添加すると、ビューの焦点面またはフィールドの外に劇的に移動します。この状況では、取得を停止し、次のカバースリップをマウントします。
イメージングソフトウェアからフレームレートが画像にタイムスタンプを付与するために必要とされることに注意してください。
Representative Results
ここでは、ex vivoでの活性化のために成熟したショウジョウバエの卵を準備する方法を実証しています。 GECIを発現している卵は、卵の活性化および胚発生の始まり（ 図1）でのCa 2+動態のイメージングを可能にします。ミリストイル基の存在は特に、使用GCaMPによって、結果がわずかに質的な違い13 14を有してもよいことに留意すべきである。我々はまた、アクチン重合の阻害剤を添加することによって卵の活性化の間の機能的アクチンの役割を実証しています、活性化緩衝液（ 図2）14サイトカラシンD、。
卵活性化における細胞骨格のための要件が保存されています。 C.でエレガンスは、受精後、細胞骨格の構成要素は、第一の非対称分裂21,22のための一細胞胚を作製するために再編成されています。ウニ、cytoskeleの破壊でTALの再編成次の活性化は、収縮環の形成23を防止することにより、細胞周期に影響を与えることが示されています。 ショウジョウバエの卵活性化時の Ca 2+波とその下流の機能を媒介する際のアクチンの役割は完全には解明されないままです。
ショウジョウバエでは、 の Ca 2+波とアクチン細胞骨格の同時可視化は、このエクスビボ活性化アッセイを用いて達成することができます。複数のチャンネルの時系列を取得することができ、細胞内Ca 2+の動態を、卵母細胞（ 図3）におけるアクチンの組織の変化に一致させることができます。
図1：ex vivoでのショウジョウバエの卵活性化時系列でのシングルの Ca 2+波は、a。次UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します活性化緩衝液（AH）のddition。細胞質のCaの上昇は約1.5ミクロン/秒の平均速度で2+後極（B）に由来し、伝搬する（BF）。波の開始は、典型的には、活性化緩衝液の添加の3分以内に観察されます。活性化に続いて、成熟した卵の細胞内カルシウムレベルは、レベル（G、H）活性化の事前に戻ります。補足ムービー1（合計時間33分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：アクティベーションバッファ摂動CAにサイトカラシンDの追加2+ ex vivoでの波動伝播。時系列を10μg/ mlのサイトカラシンDの最終濃度（AH）を含む活性化緩衝液を添加した後UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca 2+波は後極（A）で開始される一方で、それが危険にさらされていると卵（F）の前方に到達していない（白矢じりは、波の前面を表します）。それ以上の Ca 2+の変化）を30分間にわたって観察されませんでした。補足ムービー2（合計時間30分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：EでのアクチンおよびCa 2+の同時可視化ショウジョウバエのGGのアクティベーションex vivoでの。時系列は、活性化バッファー（AH）の添加後UASt- myrGCaMP5（シアン）とUASP -F-Tractin.tdTomato（マゼンタ）を発現するショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca 2+波は後極から開始し、 図1のように回復します。アクチンが白矢頭（H 対 A）、時間の経過とともに変化しているように見えます。成熟卵の中心での Ca 2+シグナルの検出の欠如は、画像キャプチャ中にサンプルの移動によるものです。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は、この原稿の準備中に支援するためのローラ・バンプトン、アレックス・デビッドソン、リチャード・パートン、有田Acharyaさんに感謝しています。卵活性化の議論のためのマリアナWolfner。イメージングのサポートのためのマット・ウェイランド。実験室での一般的なサポートのためのナン胡。
この作品は、TTWにケンブリッジ、ISSFの大学[認可番号097814]によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
| Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
| Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
| Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
| Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
| Solvadis (GMBH) | |||
| Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
| Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
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