סידן הדמיה ב Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54311

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Christopher J. Derrick*¹, Anna H. York-Andersen*¹, Timothy T. Weil¹

¹Department of Zoology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca ²⁺ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

Introduction

שינוי Ca ^{2 +} ריכוז התאי על הפעלת ביצה (ביצית) הוא מרכיב משומר של כל היצורים שנחקרו ^1,2. אירוע זה יוזם מגוון רחב של התהליכים התלויים ²⁺ Ca, כולל חידוש של מחזור התא ותרגום של mRNAs מאוחסן. בשל דרישה זו עבור Ca ^{2 +,} לדמיין את השינויים החולפים בריכוזים תאיים Ca ^{2 +} כבר עניין מפתח.

מבחינה היסטורית, אורגניזמים מודל נבחרו מחקרים על הפעלת ביצה בהתבסס על גודל וזמינות של ביציהן. גישות להדמיה שונות כבר נוצלו לעקוב ולכמת שינויים התאי Ca ^{2 +} ריכוזים במערכות אלה, ובכלל זה: aequorin photoprotein בדגי medaka ^3; Ca צבעי ניאון ^{2 +} רגישים כגון פורעה-2 ב קיפוד ים ו אוגר ^4,5; וסידן ירוק-1-dextran ב Xenopus ^6.

הדור ושיפור אינדיקטורים סידן מקודדים הגנטי (GECIs) שינה את היכולת לדמיין Ca ²⁺ דינמיקת in vivo ^7. הבונה הגנטית אלה באים לידי ביטוי ברקמות ספציפיות ולהגביל את צורך הכנות רקמות פולשנית ^8.

GCaMPs הוא חלבון פלואורסצנטי ירוקה (GFP) בכיתה מבוססת של GECIs שהיה מאוד יעיל, בשל הזיקה הגבוהה Ca ²⁺ שלהם, יחס אות לרעש ואת היכולת להיות מותאם אישית ^9-11. בנוכחות של Ca ^{2 +,} במתחם GCaMP עובר סדרה של שינויים מרחביים, החל עקידת Ca ²⁺ כדי calmodulin, שתוצאתה היא עוצמת פלורסנט מוגברת של רכיב ה- GFP ^9.

GCaMPs נעשה שימוש נרחב במחקר על נוירונים תסיסנית לדמיין שינויי סידן התאי ^12. Applicati האחרונהעל הטכנולוגיה GCaMP לדמיין Ca ^{2 +} ביצים תסיסנית בוגרת גילה גל יחיד Ca ^{2 +} חולף על הפעלת ביצה ^13,14. גל Ca ²⁺ ניתן דמיין בהגדלה נמוכה בזמן ביוץ in vivo ¹³ או בהגדלה גבוהה יותר באמצעות assay הפעלת vivo לשעבר ^13,14. ב assay vivo לשעבר, ביציות בוגרות בודדות מבודדות מן השחלות והופעלו באמצעות פתרון hypotonic, המכונה חיץ הפעלה, אשר הוכח לשחזר את אירועי in vivo הפעלת ^15-17.

Assay vivo לשעבר זו מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה הקלה של גל Ca ²⁺ תחת תנאי ניסויים שונים כולל שיבוש תרופתי, מניפולציות פיסיות מוטציות גנטיות. מאמר זה מדגים הכנת ביצים תסיסנית בוגרת vivo לשעבר הפעלה הדואר עוקבת מיקרוסקופיה רגילה לחזות גל Ca ²⁺ באמצעות GCaMP. גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את החניכה ובקר על גל Ca ^{2 +} ו לחקור תוצאות במורד זרם.

Protocol

הערה: ביצוע כל הצעדים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

1. הכנה לנתיחה

הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם E. Gavis, אוניברסיטת פרינסטון & וייל et. al. ^18. בצע את השלבים הבאים יומיים לפני הדמיה.

1. קח בקבוקון זבוב המכיל כ 10 מיליליטר של מזון מוצק להוסיף כמות קטנה של שמרים יבשים לאחד בפינה, פחות מ 1 גרם מספיק.
   הערה: לקבלת מידע אודות בקבוקונים לטוס או מזון לראות "תסיסנית תחזוקה ^'19.
2. להוסיף 1 - 3 טיפות של מים כדי ללחלח את השמרים.
3. הגדר את הבקבוקון הצידה בזווית של 45 מעלות ולאפשר 3 - 5 דקות על השמרים כדי לקחת את המים.
4. בעוד שמרים סופג את המים, בחר בקבוק זבובים להביע GCaMP5 MYR UASt- ²⁰ מונע על ידי אמבט-VP16GAL4 (המכונה GCaMP5) שצצו לאחרונה (א myristoyטופס lated של GCaMP5 נבחר לספק אות גבוהה יחס רעש דרך קושר את Geci הקרום בתוך הביצה).
5. לטשטש את הזבובים בבקבוק עם גז CO _2. הקפד לשמור את הבקבוק הפוך כדי לא לאבד זבובים במזון הרטוב.
6. עצת הזבובים מורדמים על כרית CO ₂ ולמיין 10 - 15 נקבות ו 5 זכרים באמצעות מכחול תחת מיקרוסקופ לנתח. הערה: זהו תקן לכלול זכרים לספק נקבות בריאות לנתיחה.
7. כאשר את הבקבוקון משלב 1.3 מוכן, מוסיף את הזבובים שנבחרו כדי הבקבוקון. תשמור על עצמך כדי לשמור על אופקי הבקבוקון עד הזבובים להיות פעילים.
8. מניחים את הצנצנת על 25 מעלות צלזיוס למשך כ 36 שעות.
9. החזר את הזבובים הנותרים מפנקס CO ₂ על הבקבוק או שנזרק.

2. השחלות תסיסנית ביתור

הערה: השלבים המתוארים כאן הם בהתאם וייל et. אל.

1. לאחר 36 שעות, לטשטש הזבובים מבקבוקון yeasted עם ₂ CO.
2. לאחר הזבובים בתוך הבקבוקון מורדמים להטות אותם על כרית ₂ CO להיות מסודר עם מברשת צבע תחת מיקרוסקופ לנתח.
3. בחר נקבה.
4. לבודד שתי השחלות מן הנקבה. עבור פרוטוקול מפורט מלא לראות וייל et. al. ^18. לסיכום:
   1. מקום טיפה קטנה של שמן halocarbon מחומצן (סדרה 95) על מס '1.5, 22 x 40 מ"מ coverslip.
   2. אחוז הנשי עם מלקחיים על הקדמי של הבטן.
   3. החזקת הנקבה תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש בקבוצה השנייה של מלקחיים כדי להסיר את האחוריים של הנקבה בעדינות.
   4. נגב את הרקמה האחורית מן המלקחיים השניים.
   5. סוחט על חלל הבטן עם המלקחיים השניים מן הקדמי אל האחורי של הבטן. שתי ההשחלות האטומות צריכות לדבוק המלקחיים כשבחוץ של FEMAle.
   6. גע השחלות לתוך השמן.
   7. הסר את כל רקמה מן המלקחיים על ידי מנגב את המלקחיים.
   8. חזור על שלבים אלה (2.4.1 - 2.4.7) כדי להשיג שלוש coverslips, כל שחלות המכילות בין זבוב אחד.

3. בידוד פרט ביציות בשלות

1. תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי עם ההגדלה מוגדרת 4X, על coverslip הראשון משלב 2.4, להפריד בין שתי שחלות ידי קריעת oviduct.
2. להציג זוג מלקחיים סגורים למרכז בשחלה אחת, נזהר שלא לנקב כל תאי ביצה.
3. כנס חללי לנתח סטנדרטי למרכז השחלה ליד המלקחיים הסגורים.
4. בעדינות לגרור החללית לנתח דרך השחלה לכיוון בקוטב האחורי, שבו הביציות הבשלות (שלב 14 תאי ביצה) ממוקמות.
5. חזור על שלבים 3.1 - 3.4 2 - 5 פעמים בהתאם לגודל של השחלה ומספר הביצים.
   הערה: תוספת של CO ₂ הערה: ביציות בשלות צפויות להפריד בקלות מן הרקמה החיבורית שחלות.
6. אם אין ביציות בשלות גלויות מחוץ השחלה, להמשיך מתגרה בעדינות עם החללית לנתח.
7. לאחר הביציות הבשלות גלויות על coverslip מחוץ השחלה, לתמרן 3 - 5 בשורה במרכז coverslip.
   הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפעל את החללית בעדינות לאורך הצד של הביצים.
   הערה: הימנע משיכת הנספחים הגבי כמו זה יכול לגרום נזק ביצה.
   הערה: בהתאם הגדרת הדמיה בעתיד, ליישר את הביצים כ 200 מיקרומטר בנפרד בניצב coverslip לאזור הדמיה מקסימלית.
8. לאחר מיושר, להסיר את שאר רקמת השחלה על ידי גרירתו מן הביצים מיושר באמצעות forceps.
9. הסר עודף שמן בטופחו עם הפינה של רפואי לנגב. היזהר שלא לגעת ביציות בשלות עם רפואי לנגב ביציות בשלות כמו כי הם פנו יאבדו.
10. צייר crosshair על coverslip בטוש לפשט איתור המדגם תחת מיקרוסקופ.
11. הגדר את coverslip במקום בטוח ולהשאיר את תאי ביצה המוכנים על coverslip לנוח 5 - 10 דקות. זה מאפשר את הביצה להתיישב שמן. דוגמאות ניתן להשתמש עד 1 שעות שלאחר הניתוח.
12. חזור על שלבים 3.1 - 3.11 עבור שאר coverslips עם שחלות עליהם.

4. הכנות לקראת הדמיה

1. תביא חיץ הפעלה מוכן ¹⁵ לטמפרטורת חדר.
   הערה: חיץ ההפעלה היא חיץ hypotonic: 3.3 מ"מ לאא _{2 4} PO, 16.6 מ"מ KH _{2 4} PO, 10 mM NaCl, 50 מ"מ KCl, 5% פוליאתילן גליקול 8000, 2 מ"מ CaCl _2, הביא 6.4 pH עם 1: יחס 5 של NaOH: KOH.לפרטים נוספים, ראה Mahowald, 1983 ^15. Aliquots של חיץ הפעלה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
2. בזהירות להעביר coverslips מוכן, חיץ הפעלה טפטפות זכוכית למתקן הדמיה.
   הערה: שדה רחב, confocal, דיסק מסתובב או מיקרוסקופ גיליון האור יכול לשמש. אנו ממליצים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. תוצאות הנציג שלנו התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal.
3. אובייקטיבי מתאים הדמיה ביצית בשלה כולו צריך להיבחר (כאן: 20X 0.7 NA).
4. הר coverslip המוכן הראשון על במת מיקרוסקופ. יש להיזהר שלא לשבור את coverslips על הבמה.
5. איכותי לבחור שדה הראייה עם תא ביצית בשלה עבור הפעלה. האם לא תאי ביצה נקבה תמונה או בעלי blebbing בקרום.
   הערה: צעדים 4.6 - 4.7, פקודות תוכנה תשתנינה בהתאם מיקרוסקופ ויצרן.
6. פסק הדמית גדרמטרים עבור עירור GFP רגיל (488 ננומטר) ופליטה (500 - 580 ננומטר). גם הקים נוף שדה בהיר כדי לחזות להתמצא הביצה הבוגרת ושמן עקור.
7. בחר את Z-המטוס הנמוך ביותר שבו ביציות בשלות גלויות ולהגדיר Z-מחסנית מלאה להילקח עבור 40 מיקרומטר בכ 2 מיקרומטר לכל צעד. הגדר את הפרמטרים כך שאין עיכוב בין רכישת מחסנית Z. הגדר את סדרת הזמן לתפוס כ -30 דקות.

5. הפעלת ביצת גופיים הדמיה

1. התחל לכידת תמונה.
2. חכו 1 - מלא 2 Z- ערימות להירכש. זו מציגה את הביצית בשלה לפני ההפעלה.
3. למשוך כ 300 μl של חיץ ההפעלה לתוך פיפטה מזכוכית.
4. מיצוב קצה פיפטה זכוכית המכיל חיץ ההפעלה בזווית של 45 מעלות מעל coverslip, לאט להזיז את פיפטה לתוך נתיב קרן עד שהוא ממש מעל להיות הדמיה ביצית בשלה. פיפטה הזכוכית צריכה2 ס"מ מעל שמן - 1 להיות.
5. להוסיף 1 - 2 טיפות של חיץ ההפעלה בתוך פחות מ -5 שניות מן פיפטה מזכוכית. זה אמור לתפוס את השמן. להימנע מהוספת חיץ הפעלה עודפת או נגיעת הביצה עם פיפטה הזכוכית כפי שהוא יכול לגרום לעקירה של הביצית בשלה. יש להיזהר שלא לגעת coverslip עם פיפטה כמו זה יכול לגרום לשינוי בועות מטוס או אוויר מוקדי להיווצר שמן טבילה בין המטרה לבין coverslip.
6. תוך הוספת חיץ הפעלה במהלך רכישת תמונה, בדוק את הערוץ בהיר שדה כדי להבטיח שהשמן הוחלף על ידי חיץ ההפעלה.
   הערה: זה יהיה ראשון להופיע כצל בשל פיפטה שבירה נתיב הקרן אלא גם יגרום להופעת טיפות שמן זעירות. כמה טיפות שמן יכול להישאר הקשורים ביצית בשלה שישפיע תוצאות הניסוי ואיכות תמונה.
7. אם השמן לא שנעקר מהתוספת הראשונית של חוזרי חיץ הפעלת צעדי 5.4 - 5.6.
8. לאחר השמן הוא עקור בהצלחה, לאפשר הסדרת הזמן לרוץ עד לסיום.
   הערה: בשל נפיחות של ביציות בכל הפעלה, כמה תאי ביצה יעברו בדרמתיות מעל מישור המוקד או שדה הראייה על תוספת של חיץ הפעלה. במצב זה, להפסיק את הרכישה ואת הר coverslip הבא.
9. לאחר רצף התמונה השלים רכישה, לשמור את הנתונים.

6. לאחר רכישת עיבוד תמונה

1. פתח את מערך הנתונים באמצעות פיג'י (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), או תוכנת עיבוד תמונה שווה ערך, ובחר את הקבצים הרלוונטיים לניתוח.
2. כדי לבנות השלכה של הנתונים רכשו לבחור: תמונה> סטאקס> Z-פרויקט.
3. בחר פרוסה-Z התחלת א-פרוסת Z תחנה, בדרך כלל הקטע השלם. בחר סוג הקרנה, בדרך כלל מוגדר 'מקס עוצמה ". בדוק תיבת הסימון 'בכל הזמנים Frames' כדי להחיל את ההגדרות שנבחרו לסדרה כולה.
4. אםיותר מערוץ ניאון אחד כבר צילמו, השתמש בכלי ערוצים לאפשר תנועה בין צבעים, לבצע מרוכבים, או להפוך את גווני האפור בתמונה. כלי תמונה> צבעים בוחרים> ערוצים.
5. כדי להתאים את בהירות התמונה ו בניגוד תמונה בחר> התאם> בהירות / ניגודיות.
6. כדי לייצא תמונה אחת, להעביר מחוון זמנים למסגרת רלוונטית בחר File> Save As> Jpeg, או כל פורמט מועדף.
7. בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור.
   הערת קצב הפריימים מתוכנת ההדמיה יידרש לתת חותמת זמן על התמונה.
8. כדי לייצא את סדרת הזמן כסרט לבחור: File> Save As> AVI, ולאחר מכן בוחר קצב פריימים (~ 7 פריימים לשניים).
9. בחר מיקום וכותרת עבור הקובץ המיוצא, ולאחר מכן שמור.
10. כדי לשמור את הקובץ המותאם בפורמט פיג'י, בחר File> Save.

Representative Results

כאן אנו מדגימים כיצד להכין ביצים תסיסנית בוגרת הפעלת vivo לשעבר. ביצים להביע הדמיה לאפשר Geci של Ca ^{2 +} הדינמיקה בבית ההפעלה ביצה ותחילת ההתפתחות העוברית (איור 1). יצוין כי בהתאם GCaMP בשימוש, במיוחד בנוכחות קבוצת myristoyl, תוצאות עשויות להיות הבדלים איכותיים קלים ^{13 14.} יש לנו גם הפגין תפקיד עבור אקטין תפקודי במהלך הפעלת ביצה על ידי התוספת של מעכב פילמור יקטין, cytochalasin D, למאגר ההפעלה (איור 2) ^14.

דרישת שלד התא ב הפעלת ביצה נשמרת. ב C. elegans, לאחר הפריה, רכיבי cytoskeletal הם מחדש להכין את העובר-תא אחד לחלוקת הסימטרית הראשונה ^21,22. בשנת קיפוד ים, שיבוש cytoskeletal-ארגון מחדש לאחר ההפעלה הוכח להשפיע על מחזור התא על ידי מניעת טבעת התכווצות היווצרות ^23. תפקידיו של תקטין בתיווך גל Ca ²⁺ ותפקוד ההמשך שלה ב הפעלת ביצת תסיסנית נשארו הובהרו באופן מלא.

ב תסיסנית, שיתוף להדמיה של שלד התא Ca ^{2 +} גל אקטין יכולה להיות מושגת באמצעות assay ההפעלה vivo לשעבר זה. סדרת זמן של ערוצים מרובים ניתן לרכוש ודינמיקה של Ca התאי ²⁺ ניתן להתאים עם שינויים בארגון יקטין הביצית (איור 3).

איור 1:. גל אחד Ca ^{2 +} ב תסיסנית ביצה הפעלת סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים אddition של חיץ ההפעלה (AH). העלייה Ca ציטופלסמית ²⁺ מקורו בקוטב האחורי (ב ') מתפשטת (BF) עם מהירות ממוצעת של כ -1.5 מיקרומטר / sec. ייזום של גל בדרך כלל הוא ציין בתוך 3 דקות של תוספת של חיץ ההפעלה. בעקבות ההפעלה, רמות סידן תאיים של ביצית בשלה חוזר טרום הפעלת רמות (G, H). ראה השלים סרט 1 (דקות בסה"כ זמן 33). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תוספת של Cytochalasin D כדי הפעלת מאגר מדאיג Ca^{2 +} גל רביה. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 הבאים תוספת של חיץ ההפעלה המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל cytochalasin D הריכוז הסופי (AH). בעוד גל Ca ²⁺ הוא יזם בקוטב האחורי (א), זה נפגע ואינו להגיע הקדמי של הביצה (F) (ראשי החץ לבנים מציינים חלק הקדמי של הגל). אין עוד שינויי Ca ^{2 +} נצפו למעלה מ -30 דקות). ראה השלים סרט 2 (דקות בסה"כ זמן 30). ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: Co-להדמיה של אקטין Ca ^{2 +} ב Eהפעלת gg תסיסנית. סדרת זמן של vivo לשעבר בוגרת ביצה תסיסנית להביע UASt- myrGCaMP5 (ציאן) ו UASp -f-Tractin.tdTomato (מגנטה) התוספת הבאה של חיץ ההפעלה (AH). גל Ca ²⁺ יוזם מהקוטב האחורי ומשחזר כמו באיור 1. תקטין נראה שינוי לאורך זמן, ראשי חץ לבנים (A נגד H). העדר זיהוי אותות Ca ^{2 +} במרכז ביצית בשלה הוא עקב תנועה של המדגם במהלך לכידת תמונה. ברי סולם = 50 מיקרומטר. מקס הקרנה = 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry active yeast	Fleischman’s	#2192
Dissecting microscope	Leica	MZ6	Various will work
Lamp	Mircotec Fibre optic	MF0-90	Various will work
Medical wipes	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
Marker pen	Stabilo	841/46	OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm	International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halocarbon oil, series 95	Halocarbon Products Corp.	Distributor in Europe:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps	Fine Science Tools	11252-00	Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe	Fine Science Tools	10140-01
Glass pipette	Fisherbrand,	FB50251	Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length
Vial	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm