Summary
Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila.
Introduction
Uma alteração na concentração intracelular de Ca 2+ em ovo (oócitos) de activação é um componente conservado de todos os organismos estudados 1,2. Este evento inicia uma vasta gama de processos dependentes de Ca 2+, incluindo retomada do ciclo celular e a tradução de mRNAs armazenados. Devido a esta exigência de Ca 2+, visualizando as alterações transitórias em concentrações intracelulares de Ca 2+ tem sido de interesse chave.
Historicamente, foram seleccionados organismos modelo para estudos de activação de ovo com base no tamanho e disponibilidade dos seus ovos. Várias abordagens de visualização têm sido utilizadas para seguir e quantificar as alterações na concentração de Ca2 + intracelular em tais sistemas, incluindo: a aequorina fotoprote�a em medaka peixes 3; Ca 2+ corantes fluorescentes sensíveis, tais como Fura-2 em ouriço-do-mar e hamster 4,5; e cálcio verde-1-dextrano em Xenopus 6.
A geração e melhoria de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIS) transformou a capacidade de visualizar de Ca2 + dinâmica in vivo 7. Estas construções genéticas são expressas em tecidos específicos e limitar a necessidade de preparações de tecidos invasivos 8.
GCaMPs são uma proteína fluorescente (GFP) classe baseado verde da Gecis que têm sido muito eficaz devido à sua elevada afinidade de Ca2 +, razão e capacidade de sinal-ruído para ser personalizado 9-11. Na presença de Ca2 +, o complexo GCaMP sofre uma série de alterações conformacionais, que começa com a ligação de Ca 2+ para a calmodulina, que resulta em um aumento da intensidade de fluorescência da GFP componente 9.
GCaMPs têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre neurônios Drosophila visualize as alterações de cálcio intracelular 12. Os applicati recenteson da tecnologia GCaMP para visualizar Ca 2+ em ovos de Drosophila maduros revelou uma única transiente de Ca2 + onda de activação de ovo 13,14. A onda de Ca2 + pode ser visualizada a baixa ampliação durante a ovulação in vivo 13 ou em maior ampliação usando um ensaio de activação ex vivo 13,14. No ensaio ex vivo, os oócitos maduros individuais são isolados a partir dos ovários e activado usando uma solução hipotónica, referido como tampão de activação, o que foi mostrado para recapitular eventos de activação in vivo, em 15-17.
Este ensaio ex vivo permite a visualização de alta resolução fácil da onda de Ca2 +, sob diferentes condições experimentais, incluindo perturbação farmacológica, manipulações físicas e mutantes genéticos. Este artigo demonstra a preparação de ovos de Drosophila maduras para a activação ex vivo e The subsequente microscopia usado para visualizar a onda de Ca2 + utilizando GCaMP. Esta abordagem pode ser utilizada para testar a iniciação e controlo da onda de Ca2 + e a sonda resultados jusante.
Protocol
Nota: Realizar todas as medidas à temperatura ambiente, salvo indicação contrária.
1. Preparação para Dissection
Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com E. gavis, Universidade de Princeton & Weil et. al. 18. Execute os seguintes passos dois dias antes de imagem.
- Aqui fly um frasco contendo aproximadamente 10 ml de comida sólida e adicionar uma pequena quantidade de fermento seco para um canto, inferior a 1 g é suficiente.
Nota: Para obter informações sobre frascos de voar ou de alimentos ver 'Drosophila Manutenção' 19. - Adicionar 1 - 3 gotas de água para hidratar a levedura.
- Definir o frasco de lado em um ângulo de 45 ° e permitir 3-5 min para a levedura para assumir a água.
- Enquanto a levedura é a absorção de água, seleccionar uma garrafa de moscas que expressam GCaMP5 MYR UASt- 20 impulsionado por banheira-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que surgiram recentemente (um myristoyforma lada do GCaMP5 foi escolhido para fornecer um sinal de alta-ruído através de amarrar o GECI à membrana dentro do ovo).
- Anestesiar as moscas na garrafa com gás CO2. Certifique-se de manter a garrafa invertida de modo a não perder moscas na comida húmida.
- Dica as moscas anestesiados em uma almofada de CO 2 e tipo 10 - 15 mulheres e 5 homens usando um pincel sob um microscópio de dissecação. Nota: É padrão para incluir machos para fornecer fêmeas saudáveis para dissecção.
- Quando o frasco do passo 1.3 está pronto, adicione as moscas selecionados para o frasco. Tome cuidado para manter a horizontal frasco até que as moscas se tornar ativo.
- Colocar o frasco a 25 ° C durante aproximadamente 36 h.
- Retornar as moscas remanescentes do CO 2 pad para a garrafa ou descarte.
2. Dissecting Drosophila Ovário
Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com Weil et. ai. 3. Isolando Individual óvulos maduros 4. Preparar for Imaging 5. Activação de imagem Ex Vivo ovo 6. Pós-aquisição de Processamento de Imagem
Nota: A adição de CO 2 Nota: óvulos maduros são susceptíveis de separar facilmente a partir de tecido conjuntivo de ovário.
Nota: Para obter os melhores resultados, a sonda de correr suavemente ao longo do lado dos ovos.
Nota: Evite puxando os apêndices dorsais, pois isso pode danificar o óvulo.
Nota: Dependendo do futuro imaging set-up, alinhe os ovos cerca de 200 mm além perpendicular à lamela para a área máxima de imagem.
Nota: tampão de activação é um tampão hipotónico: 3,3 mM de NaH 2 PO 4, 16,6 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5% de polietileno glicol 8000, CaCl2 2 mM, levada a pH 6,4 com uma mistura 1: 5 proporção de NaOH: KOH.Para mais informações ver Mahowald, 1983 15. Alíquotas de tampão de activação pode ser armazenado a -20 ° C durante meses e a 4 ° C durante até 2 semanas.
Nota: Uma de campo amplo, confocal, de disco rotativo ou folha microscópio de luz pode ser utilizado. Recomendamos o uso de um microscópio invertido. Os resultados representativos foram obtidos utilizando um microscópio confocal.
Nota: Para obter etapas 4.6 - 4.7, comandos de software irá variar dependendo do microscópio e fabricante.
Nota: Isto irá aparecem pela primeira vez como uma sombra devido à pipeta quebra do caminho do feixe, mas também irá resultar no aparecimento de gotas de óleo pequenas. Algumas gotas de óleo pode permanecer associado com o óvulo maduro que irá afectar os resultados experimentais e a qualidade da imagem.
Nota: Devido ao inchaço dos oócitos em ativação, algumas câmaras de ovo irá mover drasticamente fora do plano focal ou campo de visão após a adição de tampão de activação. Nesta situação, pare a aquisição e montagem da próxima lamela.
Nota A taxa de quadros a partir do software de imagem será obrigado a dar uma data e hora na imagem.
Representative Results
Aqui demonstramos como preparar ovos de Drosophila maduros para a activação ex vivo. Ovos expressam um GECI permitir imagens de Ca 2+ dinâmica na activação de ovo e o início do desenvolvimento embrionário (Figura 1). Deve notar-se que, dependendo da GCaMP usado, especificamente a presença de um grupo miristoílo, os resultados podem ter pequenas diferenças qualitativas 13 14. Nós também têm demonstrado um papel para a actina funcional durante a activação do ovo por meio da adição de um inibidor de polimerização de actina, citocalasina D, para o tampão de activação (Figura 2) 14.
Um requisito para o citoesqueleto na activação do ovo é conservada. Em C. elegans, após a fertilização, os componentes do citoesqueleto são reorganizados para preparar o embrião de uma célula para a primeira divisão assimétrica 21,22. Em ouriço do mar, a perturbação dos cytoskeleTal re-organização após activação foi mostrado para afectar o ciclo celular, prevenindo a formação do anel 23 contráctil. O papel da actina na mediação de uma onda de Ca2 + e sua função jusante para ativação ovo em Drosophila continua a ser totalmente elucidado.
Em Drosophila, o co-visualização da onda do citoesqueleto de actina e de Ca2 + pode ser conseguida utilizando este ensaio de activação ex vivo. Séries temporais de vários canais podem ser adquiridas e dinâmica do Ca2 + intracelular pode ser combinado com mudanças na organização da actina no oócito (Figura 3).
Figura 1:. A Single Ca 2+ onda em série Drosophila Egg Activation Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 seguindo a umddition de tampão de activação (AH). O aumento no Ca 2+ citoplasmático origina-se no polo posterior (B) e propaga (BF) com uma velocidade média de cerca de 1,5 um / seg. Iniciação da onda é tipicamente observada dentro de 3 minutos da adição de tampão de activação. Após a activação, os níveis de cálcio intracelular do óvulo maduro retorna aos níveis (G, H) de pré-activação. Veja o filme suplementar 1 (tempo total de 33 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A adição de citocalasina D da Activação: Tampão perturba Ca2+ Propagação de Ondas. A série da ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 após a adição de tampão de activação contendo / ml concentração final citocalasina D 10 mg (AH). Embora a onda 2+ Ca é iniciada no pólo posterior (A), que é comprometida e não atinge o anterior do ovo (F) (setas brancas indicam a frente da onda). Nenhuma outra Ca 2+ foram observadas alterações ao longo de 30 min). Veja o filme suplementar 2 (total de tempo de 30 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Co-visualização de actina e Ca 2+ em EAtivação gg em série Drosophila. Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 (ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) após a adição de tampão de activação (AH). O Ca 2+ onda inicia a partir do pólo posterior e recupera como na Figura 1. Actina parece estar mudando ao longo do tempo, as setas brancas (A vs H). A falta de detecção do sinal de Ca2 + no centro do óvulo maduro é devido ao movimento da amostra durante a captura de imagem. Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Somos gratos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya para a assistência durante a preparação deste manuscrito; Mariana Wolfner para discussões sobre a ativação do ovo; Matt Wayland para suporte de imagem; e Nan Hu para apoio geral em laboratório.
Este trabalho foi financiado pela Universidade de Cambridge, ISSF para TTW [número de concessão 097.814].
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
- Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).