Abstract
mono tabakaları memeli hücre kültürü çok çeşitli fizyolojik ve moleküler süreçleri incelemek için kullanılır. Ancak, artan hücrelerin incelemek için bu yaklaşım, genellikle istenmeyen eserler üretir. Bu nedenle, genellikle hücre-dışı matris bileşenlerini kullanarak üç boyutlu (3D) bir ortamda, hücre kültürü, in vivo bağlı doku veya organ nativ yakından benzerlik için ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Bir fibrin jel yapılmış bir sözde primer macrospherical tümör ve (ii) bir çevresel hücresiz bölme bir kollajen jel hareket gömülü kanser hücrelerini ihtiva eden bir merkez bölme iki bölme, yani: (i) ile 3 boyutlu bir hücre kültür sistemi geliştirmiştir örneğin, merkezi kullanılandan farklı bir hücre dışı matris bileşeni, burada kanser hücrelerinin göç (yayılma ön) ve / veya ikincil veya uydu tümörler temsil mikroküresel tümörler oluşturabilir. periferal bölme uydu tümör oluşumuoldukça bu 3D kültür sistemi benzersiz kılan doğal tümör hücrelerinin bilinen saldırganlık veya metastatik kökenli korelasyon. Bu hücre kültürü Kanserin hücre istilası ve motilite, hücre-hücre üstü matris etkileşimlerini ve anti-kanser ilaç özelliklerini değerlendirmek için bir yöntem olarak değerlendirilmesi için kabul edilebilir.
Introduction
Kanser hücre işgali / göç ve sonraki metastaz kurulması temel ve biyomedikal özelliklerini inceleyen yoğun araştırma 1,2 konusudur. Metastaz kanser nihai aşamasıdır ve klinik yönetim belirsizliğini koruyor. Hücresel ve moleküler düzeyde metastaz daha iyi anlaşılması daha etkin tedavilerin 3 gelişmesini sağlayacaktır.
Metastatik hücrelerin çeşitli özellikleri kendi stemness ve göç içinde ve primer tümörün 5'ten işgal etmeye bir geçiş durumu (örneğin, epiteloid-mezenkimal geçiş) elde etmek için potansiyeli de dahil olmak üzere in vitro 4 keşfedilebilir. Neredeyse kan / lenfatik dolaşımı katkısını hariç çünkü Ancak, işgali / metastaz süreçlerinde in vitro değerlendirilmesi bir meydan okuma olmuştur. kollajen jel tümör fragmanları gömmek organotipik kültürlerinin Previou bilgisisinsi kanser saldırganlık izlemek için kullanılmaktadır. Tümörlerin karmaşıklığı korunmuş olsa da (örneğin, kanserli olmayan hücrelerin varlığı), tümör fragmanları örnekleme varyasyonuna, sınırlı orta difüzyon maruz ve stromal hücrelerinin 6 aşırı büyümesi için vardır. Alternatif bir yöntem, üç boyutlu (3D) hücre ortamı taklit eden hücre dışı matris (ECM) bileşenleri içinde mevcut kanser hücrelerinin büyüyen oluşur. kollajen jel ve / veya bir bazal membran türetilen matriks içinde meme kanseri hücre çizgilerinin proliferasyonu 3D hücre kültürünün en iyi karakterize örnekleri arasındadır. Belirli bir 3D hücre kültür ortamları kullanılarak standart koşullar altında yetiştirilen göğüs kanseri hücreleri için gözlemlenen dağınık düzeneği meme asinüs ve boru şeklindeki yapılar 7-10 kendiliğinden oluşumuna ters çevrilebilir. Ayrıca, adenokarsinom kanser hücrelerinden türetilen çok-hücreli tümör parçacıklarının oluşumunun (başka teknikler kullanılarak toplanmışÖrneğin, şu anda en yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü tahlil 11-13 oluşturmaktadır) gömme ağar, sferoidler yüzen, damla asılı. Bununla birlikte, bu deney, parçacıklarının oluşturabilen kanseri hücre çizgilerinin sınırlı dizi ve bu koşullarda hücrelerin çalışma süresinin kısalığı ile sınırlıdır.
Bu görsel teknik olarak, bu tarifnamede ilgi kanser hücrelerinin alternatif olarak bir bazal membran türetilmiş matris ile kaplanabilir sözde primer tümörün in vitro oluşumunu sağlamak için, bir kollajen jel gömülü gelişmiş bir 3D hücre kültürü analizinde getirmektedir. Oluştuktan sonra, psödo-primer tümör sonra kanser hücrelerinin, iki matris bölme arasında bir arayüz çapraz sağlayan bir hücresel olmayan matris (mevcut durumda fibrin jel) içinde sandviç (Şekil 1 e bakınız). İlginç bir şekilde, agresif kanser hücreleri ile sözde primer tümörden kaynaklanan sekonder tümör benzeri yapılar görünürfibrin jel. Bu 3 boyutlu bir kültür sistemi, örneğin, anti-kanser ilaçları, gen ifadesi ve hücre-hücre ve / veya hücre-ECM etkileşimleri 14-16 için araştırmak için gerekli esnekliği sunmaktadır.
Şekil 1:.. Yöntem bakış kanser çalışmaları için bir model olarak 3D hücre kültür sistemi oluşturmak için yöntemin şematik özeti bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: insan ve hayvan kanser hücreleri satın alınabilir veya lütfen bize sağlanan beri yok etik dikkate.
Yapma 1. Kollajen Fiş (Sözde birincil Tümör)
- Bir kollajen dağılımını hazırlayın. Daha önce 17 ya da satın bildirdiği gibi ben de ayıklanır ve sterilize edilebilir sıçan kuyruğu tendonları (RTT) den kollajen yazın. (Beşi 2 dakika çalışır yüksek hız) üniform bir karışımı için dondurularak kurutulmuştur RTT kollajen (0.02 N, asetik asit içinde 3.25-3.50 mg / ml), bir karıştırıcı kullanılarak dağıtılır.
- Hasat (tripsin-EDTA, genellikle) ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak için tripan mavisi dışlama kullanın. İstenilen hücre yoğunluğu (fiş başına 5 x 10 4 hücreler) ayarlayın.
- Steril koşullar altında tüm çözümler (NaOH, fetal sığır serumu, DMEM 5x, NaHCO3) Bileşen (Tablo 1) Hazırlama ve buz üzerinde soğutulmuş tutun. Not: çeşitli çözümler eklenme sırası hücreleri ozmotik veya asidik şokları önlemek için önemlidir.
- Olabildiğince hızlı bir şekilde son kolajen çözeltisi (5 mi) içine hücre dispersiyonu (1.25 x 10 6 hücre) uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek ve daha sonra hızlı bir şekilde 96 oyuklu plakanın her bir hazır kullanımlı çözeltisi 200 ul dağıtma ise (aşağı yukarı pipetleme) tarafından iyice karıştırın. Yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için hücre kültürü kaput çalışma alanı yüzeyinde çoklu plaka grev ve kuyuların içinde eşit çözüm yaymak için.
- Tüm oyuklara doldurduktan sonra inkübatör içine saklamak, (bu adım 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 15-20 dakika sürer).
- gece boyunca 2 saat 37 ° C'de inkübe plakası. Kollajen jelasyon (yani, fibrillogenesis), 30 dakika içinde meydana gelir. Bir gecelik inkübasyondan gerçekleştirmek için kültür kültür ortamı (100 uL / oyuk) ilave edin.
Fibrin Gel 2. İlk Katman
- Fibrinojen solüsyonu hazırlanması.
Not: fibrin jel aynı parti, ideal daha tekrarlanabilir Resul için kullanılmalıdırts, fibrin jel oluşumu, ticari dondurularak kurutulmuş fibrinojen farklı yükleri arasında değişebilir.- Her zaman taze hazırlanmış fibrinojen çözümü kullanın. Hidrat kristal oluşumunu önlemek için, şişeyi açarken, oda sıcaklığına kadar dondurularak kurutuldu fibrinojen getirin.
- Kademeli önceden ısıtılmış (37 ° C), Ca2 + ile Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) / 3 mg / ml çalışma konsantrasyonunda Mg2 + (en az son hacminin% 15 fazlalık hazırlanması düşünülebilir gerekli fibrinojeni çözülür : örneğin, 5 ml çözelti için 5.75 ml 17.25 mg) verdi.
- fibrinojen parçaları çözmek için ilk başta önceden ısıtılmış HBSS damla damla ekleyin. beher bir spatula ile büyük parçaları yıkmak. zaman ve karıştırma işleminin kolaylaştırılması için zaman beher çalkalayın. İşlem sırasında bir karıştırıcı plaka kullanmayın. yukarı ve aşağı süspansiyon pipetleme kalan tozu eritin.
- Steri ise ılık fibrinojen çözüm tutun0.22 um'lik bir filtreden geçirilerek çözelti lizing. Not: HBSS yeterince sıcak değil veya fibrinojen tamamen çözülmüş değilse, çözüm filtreyi tıkayabilir. Varsa, fibrinojen konsantrasyonunu azaltmak ve böylece fibrin pıhtı sertliği olabilir, bir veya iki kez filtreyi değiştirin.
- Bir alternatif prosedür olarak, son hacmi ayarlarken hazır kullanım fibrinojen çözeltisi içine ilgi hücreleri (örneğin, endotel hücreleri) süspanse edin.
- Trombin Çözümleri hazırlanması.
- GKD 2 O (50 NIH birim / mi) içinde bir stok çözelti hazırlayın, daha sonra bir 0.22 mikron filtre kullanılarak sterilize edin.
- bir fibrinojen / trombin oranı ≥1 kullanın: 0.0075 (h / h), fibrin jel oluşturmak için.
- Fibrin Jel oluşturuluyor.
- Steril fibrinojen tutmak ve tüm sonraki adımlar boyunca buz üzerinde stok solüsyonları trombin. fibrin jel 24 oyuklu plakalar içinde oluşturmak üzere izin verilir.
- Derhal bindirme inciHer bir E yüzeyi de hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek fibrinojen solüsyonu (200 ul / oyuk). Bir seferde 6 kuyu işleyin.
- fibrinojen çözüm tamamen kuyu yüzeyini kaplayan sonra, bir 45 ° açıyla plaka yatırmak ve iyi merkezi haline trombini bırakarak ilk kuyuya trombin çözeltisi 1.5 ul ekleyin ve sonra yavaşça için yatay plaka girdap 1-2 sn.
- Laminer akış kaputu (5-10 dk) jelleşme / pıhtılaşma işlemi tamamlanıncaya kadar altında stabil pozisyonda plaka bırakın (Not: polimerizasyon işlemi inkübatör plaka taşıyarak, örneğin, rahatsız edilmemelidir).
- İlk altı kuyu polimerize sonra tüm kuyular işlendikten kadar, önümüzdeki altı kuyuları için aynı diziyi (yani 3 Önceki adımlar) tekrarlayın.
Fibrin Gel ve sandviç Kollajen Plug 3. İkinci Kat
- seçenekA: (hemen Kollajen Tak Kullanarak).
- fibrin jel ilk kat ince plaka eğerek bütün kuyularda polimerize emin olun. kolajen fişleri transferini kolaylaştırmak için (fibrin jeller ihtiva eden), 24 oyuklu bir plaka ile yan kollajen jel fişler yan ihtiva eden 96 oyuklu plaka koyun.
- kolajen fişleri ihtiva eden plakanın her oyuğuna HBSS bir damla ekleyin.
- İnce (bir kolu olarak kullanılır) bir şırınga üzerine monte iğne veya (video) bir mikro-kaşık kullanarak iyi her kollajen fişini çıkartın. kollajen fiş de kuyuya merkezli ve kısırlık bakımlı olduğundan emin yaparken, bir veya iki mikro-kaşık kullanarak ilk fibrin jel tabakası üzerine her kollajen fiş aktarın.
- fibrinojen çözeltisi, ikinci tabaka ile daha önce oluşan fibrin jel Yerleşimi (300 ul / oyuk) ve 2.3 de tarif edildiği gibi en az 1 tutarak, trombin tanıtmak. seferinde 0.0075 oranı altı kuyu bir sekans </ Li>
- (Büyüme Faktörü-azaltılmış Bodrum Membran (GFRBM) ince bir tabaka ile Kollajen Tak Kaplama) Seçenek B.
- Serin, tüm Hazırlanan çözümler ve aletleri önceden ve GFRBM donmuş alikotları beri işlenmesi sırasında (örneğin, pipet, ipuçları, test tüpleri), 4 ° C'de veya buz üzerinde saklayın (üreticinin talimatlarına uyun) çözülme sırasında aşırı ısınma oranına çok duyarlı .
- plaka oyuklarından ayrılmasından sonra, saf GRFBM çözeltisi 100 ul buz ihtiva eden bir 1.5-ml santrifüj tüpü içinde 2 dakika boyunca her kollajen fiş ıslatın.
- Daha önce açıklandığı gibi sağlanması, iyi merkezli iken ilk fibrin tabakası üzerine her kaplanmış fişi aktarın. 5 dakika GRFBM bir jel oluşturmak için izin vermek için 37 ° C'de eklenti ihtiva inkübe edin. Adım 3.1.4 olarak ikinci fibrin katmanı ekleyin.
4. Hücre Kültürü Ortamı koşullar
- (Kültür ortamı ile de 4 her dolum00 ul). Kültür ortamları ve takviyeleri hücre çizgisi ve deneysel koşullara bağlı olarak seçilir.
- 100 kallikrein önleyici birim (KIU) / ml'lik bir son konsantrasyonda kültür ortamına aprotinin bir antifibrinolitik ekleyin.
NOT: test edilen hücre hattı için kullanılan şartlar altında, bir hücre kültürü inkübatöründe plakaları saklayın. - Her gün taze ortam ile kültürler doldurun veya deneysel şemasına göre ve aprotinin ekleyin. Taze orta eklemeden önce biraz (30-35 ° açıyla) plaka yatırın ve dikkatle sürekli gözlem altında klimalı ortam aspirasyon sırasında kuyunun kenarına pipet eğin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce de belirtildiği gibi, bu 3D hücre kültürü deneyinde ilginç bir özelliği, kanser hücreleri sadece bitişik fibrin jel kolajen fiş göç değil, aynı zamanda, ikincil tümörlerin (örneğin, uydu, tümör benzeri yapılar) tesis olup olmasıdır. Bu, doğrudan doğruya, özellikle uzun bir çalışma mesafesi kondansatör (Şekil 2) ile birlikte, jel kalınlığı boyunca düşük ve yüksek büyütmelerde bir ters faz kontrast mikroskop ile gözlenebilir. Farklı deney düzenekleri 15 ile tekrar tekrar gösterildiği gibi, bu 3D hücre kültür yöntemi kullanılarak, bilinen metastatik hücrelerinin davranışı kolaylıkla, metastatik olmayan hücrelerde bulunan edilene karşılaştırılabilir. Yalnızca çok az sayıda küçük uydu tümörler böylece onun metastatik olmayan muadili B16F0 hücre dizisi (Şekil 2 ile tespit edilebilir iken, örneğin, çok sayıda uydu tümörler rasgele metastatik hücre dizisi B16F10 olan fibrin jel içinde dağılmış bulunan).
Şekil 2:. 3B hücre kültürü sisteminde fare melanoma B16F10 (A) ve B16F0 (B) Hücreleri Davranış B16F10 ve B16F0 hücre çizgileri metastatik ve zayıf metastatik sırasıyla olduğu bilinmektedir. Kompozit jel bir üstten görünüşüdür, 24 oyuklu bir plaka içerisinde kültürde 15 gün sonra gösterilir. kollajen fişi (*) daha yüksek bir büyütmede görüldüğü gibi hücreler, uydu tümörleri (oklar) göç oluşmuş olan bir fibrin jel tabakası bitişiktir. Oldukça elverişli, bu hücre hatları (boyama olmadan yani) Doğrudan görselleştirme sağlar melanin yüksek düzeyde ifade ediyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
göç ön ve uydu tümörlerin şekli fonksiyon olarak değişebilirhücre çizgisi karakteristikleri tion. Örneğin, metastatik zayıf ama yerel olarak çok invaziv murin meme bezi karsinomu 4T07 hücreleri, fibrin jel (Şekil 3A) radyal olarak uzanan bir geçiş ön oluşturur. Kültür 14 gün sonra, söz konusu hücreler, yakın meme bezi yapıları (Şekil 3B-B) benzer yıldız-şekilli yapıları oluşturmak üzere göç eden ön uzak çekti.
Şekil 3: fare meme bezi karsinoması 4T07 hücreler. Bu hücreler fibrin jel (A) taşımak için güçlü bir kapasite göstermiştir. kesikli çizgi kollajen fiş delineates ve oklar göç ön yönünü gösterir. Hücreler eşit fibrin matrisi (A) işgal ve yıldız şekilli boru şeklinde yapılar 3D görülebilir, iyi organize (B bird C). Faz kontrast mikroskopta Gösterim. (A - C) ve hematoksilen ve eozin (D) ile boyanan histolojik kesitler gösterilmektedir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu 3D kültür sistemi, özellikle de uydu tümörlerde gözlenen hücre yapıları, daha önce 16 gösterilen bir metilen mavisi çözeltisi ile jeller boyandıktan sonra düzlemsel çıkıntı tarafından tayin edilebilir. Hücre kültürünün çeşitli aşamalarında Hoechst 33258 ile jel örnekleri Boyanma Epifloresans ters mikroskobu (Şekil 4) altında hücre çekirdekleri görselleştirmek sağlar.
Şekil 4: Hormon-Duyarlı Meme Kanseri Hücreleri. İnsan GöğüsKanser MCF-7 hücreleri Tamoksifen Farklı yoğunluklara maruz bulundu. Fibrin jel (üst sıra) Uydu tümörleri, faz kontrast mikroskobu ile izlendi. (Alt sıra) (yalancı primer tümörlerde hücrelerin varlığını gösteren) kollajen jel DNA, Hoechst 33258 ile boyanmış ve epifloresans mikroskopi kullanılarak görselleştirildi. Beklendiği gibi, apoptoz sonucu uyarılan DNA parçalanması tamoksifen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Reaktifler | hacim |
| DMEM 5x (yok bikarbonat) toz hazırlayın | 1 mi |
| FBS | 0.5 mi |
| 0.26 M NaHCO 3 | 0.5 mi |
| 1 N NaOH | 20 ul |
| ddH2O | 100 ul |
| Buz üzerinde, bu çözüm tutun | |
| Hücre süspansiyonu | 880 ul |
| Peki buz üzerinde ve eklemek hızla sonunda karıştırın: | |
| RTT Kollajen (3.5 mg / ml) | 2 mi |
| Toplam ses | 5 mi |
Tablo 1:. Kollajen Fişler Reaktifler gerekli ve 18-19 fişler için bir kollajen çözüm hazırlanması. kollajen eklenmesinden sonra hava kabarcıkları kaçınarak, ve sonra derhal her kuyuya 200 ul dağıtmak iken, (yukarı ve aşağı kabı tersini) de hemen karıştırın.
| adımlar | | olası nedenler | Çözümler | |
| Aşama 1. kollajen fiş | Hava balonları | Uygunsuz pipetleme * | Aşırı kabarcıklar kaçınarak iyi iken karıştırın. |
| tüm yol aşağı pipet pistonlu her 200 ul çizin ve sadece 200 ul (ters pipetleme) bırakın. * | |||
| Kollajen fiş daralma | gece boyunca inkübe zaman Kollajen fişi özellikle, bazı hücre hatları ile küçülür. | Hücreler deney başlamadan önce kolajen daralma neden olmadığını kontrol edin. Birkaç gün içinde daralma izlemek için tavsiye edilir. Aksi takdirde, fişler sandviç jel anlaşma yapabilir. | |
| Jelleşme oluşmaz | tazelik, molarite, pH, vs.) için reaktifler kontrol edin; Hiçbir reaktif çıkarılmıştır emin olun. | beg tekrar başlatınatış. | |
| Adım 2. Fibrin jel Birinci tabaka | Hava balonları | Aynı yorumlar *; uygulama gerekir. | Aynı çözelti. * Hava kabarcıkları fibrin jel kalabilir, ancak bunlar genellikle, 37 ° C'de, zaman içinde kaybolur. |
| Jelleşme oluşmaz | kullanılan fibrinojen yanlış miktarı; trombin konsantrasyonu veya bozulmasını kontrol edin. | baştan tekrar başlatın. | |
| çözüm yetersizdir trombini varsayalım; hafif konsantrasyonu ve / veya trombin hacmi (örneğin, iki kez) artar. | |||
| jelleşme sonrası kalan sıvı faz | Fibrinojen çözüm ve trombin değil iyice karıştırılır. | baştan tekrar başlatın. | |
| Fibrin homojen değildir (yani fibriler yapıları, topaklar) | Trombin yetersiz jel yayılmış olan; eskiaşır veya yetersiz ajitasyon | pratiğe ihtiyacım var; baştan başlatın. | |
| Aşama 3. Sandviç / 2. fibrin tabakası | 2. adımda aynı yorumlar. | ||
| Kolajen fişi hızla bir (birkaç saat) fibrin boş alanlar ile çevrili | Fibrin kollajen jel ile temas içinde yeterli polimerize henüz | baştan başlayın | |
| Kollajen fişler aşamalı olabilir (gün-hafta) fibrin boş alanlar ile çevrili | Yerel lizis; | o fişi etrafında birkaç yerde sınırlı ise, deney gidebilirsiniz. Aksi takdirde baştan başlamak düşünün. plazminojen aktivatör aşırı miktarda salgılayan hücrelere bağlı olabilir. | |
| antifibrinolitik unutmayın! | |||
| Adım 4 ve 5. cell kültür ve takip | fibrinoliz | Antifibrinolitik ajan sorun (bozulma, optimal doz, vb.). | uydu tümörler veya işgalin geniş miktarda varsa, antifibrinolitik ajan dozunu artırmak. |
| asitleştirme | Aşırı hücre büyümesi. | daha sık hücre kültür ortamı değiştirin. | |
Tablo 2: giderme Olası sorunlar ve çözüm önerileri..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
önemli bir teknik dipnot olarak, bir boşluk, merkezi ve periferik jeller arasındaki ara yüzeyde mevcut olması gereklidir. Aksi takdirde, / göç fibrin jel işgal hücrelerin kapasitesini azaltabilir. Trombin uygun seyreltilmiş edilmemiş ise, kollajen ve fibrin jel arasındaki boşluk kültür ilk 24 saat içinde meydana gelebilir. Kollajen jel neden olabilir test edilen hücre hattı, böylece, her iki jeller arasındaki oluşturmak için göreceli olarak büyük bir alan neden kültür sırasında sözleşme olması da mümkündür. Stromal hücrelerin bağlı miyofibroblastik benzeri aktivitesi 18 kanser hücreleri ile birlikte kollajen jel ile karıştırılır, bu durum özellikle beklenir. Bu yapıyı önlemek için, kollajen fişi daha uzun bir süre için 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilmelidir (≥48 saat ) fibrin sandviç montaj öncesinde jel daralma ikna etmek.
Ayrıca, tahlil karşılaşılan bir sorun varlığıfibrin fibrilleri ya da topakları ve fark edilebilir. Bunun nedeni kanser hücresi göç yollarının pertürbasyonuna veri yorumlama zorlaştırmaktadır fibrin jel, bir bulanık yerine saydam yönünü verir. Bu tür konularda kültürü plakaları polimerizasyon işlemi sırasında fibrinojen çözümünün yetersiz veya aşırı sallayarak kaynaklanabilir. Aynı zamanda fibrinojen solüsyonu (adım 2.3) içine trombin uygunsuz ek nedeniyle olabilir. Yanlış şekillendirilmiş veya bulutlu fibrin jel kez sabit katılaşmış edilemez. Kollajen veya fibrin jel, bir çok durumda, kendiliğinden inkübatör bir kaç gün sonra serbest kalacaktır hava kabarcıkları ihtiva edebilir; Bununla birlikte, uygun bir pipet ortaya çıkmasını en aza indirir. Hücre kültür periyodunun başlangıcında, bir anti-fibrinolitik madde tanıtmak için tavsiye edilir. Fibrinoliz bağlı hücresel aktivite ve C olan proteolitik enzimler (örneğin, plazminojen aktivatörü) aktivasyonu hücre kültürü uzun bir süre sonra ortaya çıkabilirollagen fiş ve kanser hücre tipleri ve plakaların altına bozulmuş fibrin jel ve hücre eki kolajen fişinin onların saldırganlık 19 hayranlarıyla sürümü bağlı uydu tümörleri, aşırı fibrinoliz iki sonuçları (Tablo sorun giderme bölümüne bakın vardır 2). Mevcut tekniğin bir sınırlama zor tüm jelden hücreleri gözlemlemek için yapabilirsiniz fibrin jel, kalınlığı. Ancak, uzun bir çalışma mesafesi kondansatör ile kullanımı bir mikroskop, bu sınırlama aşmak için ve tüm Z ekseni boyunca hücrelerin izlenmesi için yardımcı olur. Konfokal veya Intravital mikroskopi da fibrin jel hücreleri görselleştirmek için bir alternatif sunabilir.
Bu 3D hücre kültürü modeli geliştirmek için önemli amaçlarından biri kanser hücrelerinin serbestçe göç ve geliştirmek edebiliyoruz hangi aracılığıyla bir hücre dışı matris bölme sağlamak oldu. Fibrin nedeniyle tümörlerde varlığını seçildibu enflamasyon, nekrozu ve değişken anjiyogenez ile indüklenen vasküler geçirgenliğin artmasına borçlu, fibrin, tümör hücresi istilasını 20,21 kolaylaştırmak için bilindiğinden. bu tümörlerde, örneğin fibrin olarak, yeni destekleyici matris üretimini taklit olarak iki bölme arasındaki arayüz çok ilgi sunuyor. Ayrıca, oksijen ve besin difüzyon ve uzun vadede, pH stabilitesi, muhtemelen difüzyon kolaylaştırılmış olduğu periferal fibrin bölmesine göre kollajen bölmesine düzensiz edilir. Nedeniyle başlangıçta merkezi kollajen fiş toplanan kanser hücrelerinin çok sayıda, nekroz / apoptoz belirtileri hastanın 22 primer tümörlerinin büyümesi sırasında gözlemlenen fenomeni taklit kültür sırasında primer tümöre içinde gözlenir. Üstelik, uydu yayını tümör oluşumu önemli ölçüde kanser hücrelerinin saldırganlık gibi metastatik davranışı ile ilgilidir. hücre hattı ve tip o bağlı olarakf deney, sürece 30 gün olarak olabilir ilgili metastatik süreçleri gözlemlemek için gerekli kuluçka süresi. Bu diğer 3D deneyleri için genellikle daha uzundur, ancak ilave gecikme in situ tümörlerinde modeli daha temsilcisine okuyan avantajı getiriyor.
İyi 3D kültür modellerinde yetiştirilen hücreler, tek tabakalı hücre kültürleri 5,23 ile karşılaştırıldığında hücre sinyal iletimi ve gen ekspresyonu farklılıklarını gösterir olduğu kabul edilmektedir. 3D kanser hücrelerinin üretimi de kemoterapötik maddeler 24-26 duyarlılıklarını etkiler. Bu 3D hücre kültürü modelinin önemli ve çekici özelliği dolayısıyla ECM konsantrasyonu ve hücre-hücre ve hücre-ECM biyomekanik özellikleri üzerine çalışanların ilgisini çekebilecek jel sertliği, değiştirme imkanı bulunduğu etkileşimleri yanı sıra hücre işgali üzerine matriks özelliklerinin etkisi / göç 27 işler. Burada sunulan 3D hücre kültürü tahlil adapte edilebilired farklı ayarlar ve / veya deneysel koşullar uygun. Örneğin, tahlil hücrelerinin çok sayıda gerektiren bir çalışmayı barındıracak kadar ölçeklendirilebilir; malzeme miktarı ve hücre sayısının iki katına çıkararak, kollajen fişler 48 oyuklu bir plaka içerisinde hazırlanabilir ve 6 oyuklu plaka içerisinde bir fibrin jel üzerine katmanlı. Öte yandan, yüksek verimli çalışmalar nedeniyle fibrin jel tutarsız homojenlik ölçümü için kültür sistemi küçültmek için zor olabilir.
İki jel bölmelerin birinde kanserli olmayan hücrelerin, kanser hücrelerinin davranışını değiştirebilir. Prostat kanseri hücre hattı PC3 fibroblastlar ve endotel hücreleri 14 ile karıştırıldığında Örneğin, uydu tümör oluşumu artar. Seçenek olarak ise, floresan etiketli hücre çizgileri hücre-hücre etkileşimleri incelemek ve / veya kültür döneminde hücreleri izlemek için jel bölümlerinde sokulabilir. Ayrıca, selamstological bölümler jel fiksasyon sonra hazırlanabilir; fibrin ile çapraz reaksiyonlar oluşabilir çünkü ancak, immünhistokimya sonuçlarının kalite antikorlar arasında değişebilir. Böyle hematoksilen ve eozin (H & E) ile olduğu gibi histolojik kesitlerin rutin boyama jel matrisler (Şekil 3D) içindeki hücre organizasyonu ortaya çıkarabilir.
(Bir cam pipet ile fişi çekerek, örneğin) fibrin jel kolajen fişi çıkarmak nispeten kolaydır. Bu nedenle, hücreleri ve fibrin jel içinde mevcut uydu tümörleri kollajen fiş bulunanlara ayrı yetiştirilebilir. Uydu kolonilerden hücreler cerrahi makas veya bir bisturi ile koloniler ekstre edilmesi ve fibrin jel serbest hücrelere aprotinin olmayan bir kültür ortamı içine giderek artan hasat edilebilir. Kompozit jel farklı lokalizasyonlardan Toplama hücreler gen ve protein ifadesi analizi de dahil olmak üzere çeşitli ileri çalışmalar, izin verebilir. Bu olabilirAyrıca hakkında daha fazla in vitro ya da in vivo çalışmalar agresif fenotipleri ile hücre popülasyonlarının izole etmek için kullanılabilir. Örneğin, bu 3D kültür modeli melanom metastazı 16 katılan genleri tanımlamak için kullanıldı. Tüm bu Örnek uygulamalar açık hücresi eş-kültür yapılabilir olan bir iki bölmeli 3D hücre kültürü sistemine izin esneklik göstermektedir.
Sonuç olarak, 3D kültür sisteminin tasarımı esnek ve kanser hücresi apoptoz, göç ve metastaz sırasında yanı sıra antikanser ilaç değerlendirilmesi için biyolojik ve moleküler olayları araştırmak için yeni yollar sunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M.
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
