Abstract
単層での哺乳動物細胞の培養は、広く様々な生理学的および分子プロセスを研究するために使用されます。しかし、成長細胞を研究するために、このアプローチは、多くの場合、不要なアーティファクトを生成します。したがって、多くの場合、細胞外マトリックス成 分を用いた3次元（3D）環境内での細胞培養は、によりインビボ組織または臓器において天然にその近い類似に興味深い代替として登場しました。我々は、フィブリンゲルからなる疑似一次macrospherical腫瘍および（ii）の周辺の無細胞区画としてコラーゲンゲル作用に埋め込 まれた癌細胞を含む中心コンパートメント、二つの区画、すなわち（i）を用いて、三次元細胞培養システムを開発しましたすなわち、中心部に使用されるものとは異なる細胞外マトリックス成 分は、ここで癌細胞が遊走する（浸潤フロント）および/ または第二またはサテライト腫瘍を表す微小球腫瘍を形成することができます。末梢コンパートメント内の衛星腫瘍の形成であります著しく、この3D培養系は、ユニークなネイティブの腫瘍細胞の既知の攻撃性または転移性の起源、と相関。この細胞培養アプローチは、癌細胞の浸潤性および運動性、細胞 - 細胞外マトリックス相互作用と抗がん剤の特性を評価する方法としてを評価するために考慮されるかもしれません。
Introduction
癌細胞の浸潤/遊走およびその後の転移の確立の基本的および生物医学的特性を調査することは熱心な研究1,2の主題です。転移は、がんの究極の段階であり、その臨床管理はとらえどころのないままになります。細胞および分子レベルでの転移のより良い理解は、より効率的な治療法3の開発を可能にします。
転移性細胞のいくつかの特性は、それらの幹細胞性と移行し、内と原発腫瘍5から侵入する遷移状態（ 例えば 、類上皮間葉移行）を取得する可能性を含む試験管 4 で検討することができます。それは事実上の血液/リンパ循環の寄与を除外しかし、浸潤/転移過程のin vitro評価は、課題でした。コラーゲンゲルに腫瘍断片を埋め込む器官培養物previou有しますずる癌の攻撃性をモニターするために使用されて。腫瘍の複雑さ（ 例えば 、非癌性細胞の存在）を保持しているが、腫瘍断片を、制限された培地の拡散にさらされている、サンプリング変化、および間質細胞6の異常増殖です。別の方法は、三次元（3D）細胞環境を模倣する細胞外マトリックス（ECM）の構成要素内の癌細胞を成長させることにあります。コラーゲンゲルおよび/または基底膜由来のマトリックス中の乳癌細胞株の増殖は、3次元細胞培養物の最もよく特徴づけ実施例の中です。特定の三次元細胞培養環境を使用して、標準的な条件下で増殖させた乳癌細胞について観察された無秩序なアセンブリは、乳腺腺房と管状構造7-10の自発的形成を逆転させることができます。また、腺癌細胞由来の多腫瘍スフェロイドの形成は、（別の技術を使用して集まっ例えば、滴、浮遊スフェロイド、寒天埋め込 み）を吊りは現在最も一般的に使用される三次元細胞培養アッセイ11-13を構成しています。しかし、このアッセイは、スフェロイドを形成することができる癌細胞株の制限されたセットによってこれらの条件で細胞を研究するために利用可能な短い期間によって制限されます。
この視覚化技術では、我々は、本明細書中に関心の癌細胞は、代わりに基底膜由来のマトリックスで被覆することができる擬似原発腫瘍のインビトロ形成を可能にするために、コラーゲンゲル中に包埋された洗練された三次元細胞培養アッセイ法を導入します。一旦形成されると、擬似原発腫瘍はその後、癌細胞は、2つの行列の区画との間の界面を横断することを可能にする無細胞マトリックス（ここでフィブリンゲル）に挟まれている（ 図1参照）。興味深いことに、攻撃的な癌細胞と共に擬似原発腫瘍に由来する二次性腫瘍のような構造は、で表示されフィブリンゲル。このような三次元培養系は、例えば、抗癌剤、遺伝子発現および細胞-細胞および/ または細胞-ECM相互作用14-16、調査に必要な柔軟性を提供します。
図1： メソッドの概要癌研究のためのモデルとして、3D細胞培養系を生成するための方法の概略要約この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
注：いいえ倫理考慮動物およびヒトの癌細胞が購入または親切に私たちに提供されたので。
1.コラーゲンプラグ（擬似原発腫瘍）の作成
- コラーゲン分散液を準備します。以前に17を報告した 、または購入として私は、ラットの尾の腱（RTT）から型コラーゲンを抽出し、滅菌することができるのいずれか。 （; 5 2分の実行高速設定）均一な混合のために凍結乾燥したRTTコラーゲン（0.02 N酢酸で3.25から3.50 mg / mlで）ブレンダーを使用して分散させます。
- ハーベスト（トリプシン-EDTA、通常）とは、血球計数器を使用して生細胞をカウントするためのトリパンブルー排除を使用します。所望の細胞密度（プラグあたり5×10 4細胞）に調整します。
- 無菌条件下で別々に全ての溶液（NaOHを、ウシ胎児血清、DMEM 5倍、 炭酸水素ナトリウム）（ 表1）を準備し、氷上で冷やしておきます。注：種々の溶液の添加の順序は、細胞内の浸透圧または酸性ショックを防止することが重要です。
- 可能な限り迅速に最終コラーゲン溶液（5ミリリットル）に細胞分散（1.25×10 6細胞）を実行します。気泡を避けながら（上下にピペッティングすることによって）十分に混合し、その後すぐに96ウェルプレートの各ウェルにすぐに使用できる溶液200μlを分配します。穏やかに気泡を除去するために、ウェルの内部に均一に溶液を広げるために、細胞培養フードの作業領域表面上のマルチウェルプレートに衝突します。
- （このステップは96ウェルプレート当たり約15〜20分かかります）すべてのウェルを充填した後、インキュベーターに格納します。
- 一晩に2時間から37℃でプレートをインキュベートします。コラーゲンゲル化（ すなわち 、原線維）は30分以内に起こります。一晩のインキュベーションを行うために培養し（100μl/ウェル）、培地を追加します。
フィブリンゲルの2第一層
- フィブリノーゲン溶液の調製。
注：フィブリンゲルの同じバッチは、理想的には、より再現resulのために使用されるべきですフィブリンゲル形成などのTSは、商業的な凍結乾燥フィブリノーゲンの異なるバッチ間で変化してもよいです。- 常に新たに調製したフィブリノゲン溶液を使用します。水和物結晶の形成を回避するために、バイアルを開く前に室温に凍結乾燥したフィブリノーゲンを持参してください。
- 徐々に（最低限必要な最終容量の15％超過を調製考える3 mg / mlでの作業濃度での Ca 2+ / Mgの2+ハンクス平衡塩溶液（HBSSに）予め温めた（37℃）でフィブリノゲンを溶解： 例えば 、5ミリリットルソリューションの5.75ミリリットルで17.25 mg）を。
- フィブリノゲン断片を可溶化するために最初に予め温めたHBSSの滴下を追加します。ビーカー内のへらでより大きなフラグメントを打破します。混合を容易にするために、随時ビーカーを攪拌します。手順中の攪拌プレートを使用しないでください。サスペンションの上下にピペッティングすることによって、残りの粉末を溶かします。
- steriながら生ぬるいフィブリノゲン溶液を保ちます0.22μmのフィルターを通すことにより、溶液をlizing。注：HBSSが十分に暖かいではないか、フィブリノゲンが完全に溶解していない場合は、解決策は、フィルターを詰まらせることがあります。該当する場合は、フィブリノーゲン濃度を低下させ、ひいてはフィブリン血餅剛性もよく、一度か二度フィルターを交換してください。
- 別の方法として、その最終的な音量を調整しながら、すぐに使用できるフィブリノーゲン溶液に、目的とする細胞（ 例えば 、内皮細胞）をサスペンド。
- トロンビン溶液を準備します。
- ddH 2 O（50 NIH単位/ ml）の原液を調製し、その後、0.22μmのフィルターを使用して滅菌します。
- フィブリンゲルを生成するために0.0075（V / V）：フィブリノーゲン/トロンビン比≥1使用。
- フィブリンゲルを生成します。
- 無菌フィブリノゲンを維持し、すべての次のステップの間、氷上でストック溶液をトロンビン。フィブリンゲルは、24ウェルプレート中に形成させました。
- 速やかにオーバーレイ番目フィブリノゲン溶液（200μL/ウェル）で各ウェルのE面の気泡の形成を回避しつつ。一度に6ウエルを処理します。
- フィブリノゲン溶液は、完全に、ウェルの表面を覆って、45°の角度でプレートを傾け、ウェルの中心にトロンビンをドロップすることにより、第1のウェルにトロンビン溶液の1.5μlを添加し、その後緩やかにするために、水平プレートを旋回したら1-2秒。
- 層流フード（5〜10分）、ゲル化/凝固プロセスが完了するまで下に安定した位置にプレートを残す（NB：重合プロセスは、インキュベーターにプレートを輸送することにより、 例えば 、邪魔してはいけません）。
- 最初の6ウェルを重合した後、全てのウェルが処理されるまで、次の6ウェルについて同じ配列（ すなわち 3前の手順）を繰り返します。
フィブリンゲルとに挟まれたコラーゲンプラグの3第2層
- オプションA：（すぐにコラーゲンプラグを使用）。
- フィブリンゲルの第1層は微妙にプレートを傾けることによって、すべてのウェル中で重合していることを確認します。コラーゲンプラグの移動を容易にする（フィブリンゲルを含む）を24ウェルプレートで並んでコラーゲンゲルプラグの側面を含む96ウェルプレートを置き。
- コラーゲンプラグを含むプレートの各ウェルにHBSSの1滴を追加します。
- 薄い（ハンドルとして使用）、注射器に取り付けられた針または（ビデオを見る）マイクロスプーンを使用してウェルから各コラーゲンプラグを取り外します。コラーゲンプラグがウェルにセンタリングされ、その無菌性が良好に維持されていることを確認しながら、1または2つのマイクロスプーンを使用して第1のフィブリンゲル層の上に、各コラーゲンプラグを転送します。
- フィブリノゲン溶液の第二の層と、以前に形成されたフィブリンゲルをオーバーレイ（300μL/ウェル）、2.3で説明したようにトロンビンを導入し、最小限の1を維持：一度に0.0075比と6ウェルのシーケンスを</李>
- オプションB（成長因子低減基底膜（GFRBM）の薄層でコラーゲンプラグをコーティング）。
- 事前にすべての準備ソリューションや楽器を冷却し、GFRBMの凍結アリコートを解凍中に過度の加熱速度に非常に敏感であるため、取り扱い時に（ 例えば 、ピペット、チップ、試験管）4℃または氷上で保管してください（メーカーの指示に従ってください） 。
- プレートのウェルから除去した後、純粋なGRFBM溶液100μlを含む氷上で1.5 mlの遠心管中で2分間、各コラーゲンプラグを浸します。
- 前述したように、それは、よく中心で確保しつつ、第1のフィブリン層の上にそれぞれコーティングされたプラグを転送します。 GRFBMがゲルを形成することができるように5分間37℃で、プラグを含むプレートをインキュベート。ステップ3.1.4でのように、第2のフィブリン層を追加します。
4.細胞培養培地条件
- 4（培養液で各ウェルを充填00μl）を。培地および補充物は、細胞株および実験条件に基づいて選択されます。
- 100カリクレイン阻害剤単位（KIU）/ mlの最終濃度で培養培地へのアプロチニン、抗線維素溶解剤を追加します。
注：試験した細胞株に使用される条件の下で細胞培養インキュベーターでプレートを保管してください。 - 一日おきに新鮮な培地で培養液を補充するか、実験的なスケジュールに従って、およびアプロチニンを追加します。新鮮な培地を追加する前に、わずかに（30-35°の角度で）プレートを傾け、慎重に一定の観察下に馴化培地を吸引しながら、ウェルの側面にピペットを傾け。
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Representative Results
前述したように、この三次元細胞培養アッセイの興味深い特徴は、癌細胞は、隣接するフィブリンゲルにコラーゲンプラグからの移行だけでなく、二次性腫瘍（ 例えば 、衛星腫瘍様構造）を確立することができないだけです。これは、直接、特に長い作動距離コンデンサ（ 図2）を用いて、ゲルの厚さを通って低及び高倍率で倒立位相差顕微鏡を用いて観察することができます。この三次元細胞培養法を用いて、既知の転移細胞の挙動を容易に、異なる実験セットアップ15で繰り返し示されているように、非転移性細胞において見られるものと比較することができます。例えば、多数の衛星腫瘍はごく少数の小さなサテライト腫瘍がそうその非転移性の対応、B16F0細胞株（ 図2を用いて検出することができるが、ランダムに転移性細胞株B16F10を有するフィブリンゲル中に分散していています）。
図2：3次元細胞培養系におけるマウスメラノーマB16F10（A）及びB16F0（B）の動作は細胞 B16F10及びB16F0細胞株を、それぞれ、弱い転移転移することが知られています。複合ゲルの上面図は、24ウェルプレートでの培養で15日後に示されています。コラーゲンプラグ（*）は、細胞が（矢印）移行し、高倍率で見た衛星の腫瘍を形成しているフィブリンゲル層に隣接しています。非常に便利に、これらの細胞株（ すなわち染色なし）の直接可視化を可能にするメラニンの高レベルを発現している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
移行のフロント、衛星腫瘍の形状は、FUNCとして異なる場合があります細胞株の特性化。例えば、転移性の不十分であるが、局所的に非常に侵襲的であり、マウス乳腺癌4T07細胞は、フィブリンゲル（ 図3A）内に半径方向に延びる移行面を形成します。培養14日後、これらの細胞が密接に乳腺構造（ 図 3B-D）を似た恒星状の構造を形成する渡り鳥正面から引き離されています。
図3： マウス乳腺癌の4T07細胞 。これらの細胞は、フィブリンゲル（A）に移行する強力な能力を示します。破線は、コラーゲンプラグを描く、矢印は移行正面の方向を示しています。細胞が均等にフィブリンマトリックス（A）に侵入し、よく組織、恒星状の管状構造は、3D（B ANで観察することができますDのC）。位相差顕微鏡下での再生回数（ - C）、ヘマトキシリンおよびエオシン（D）によって染色された組織切片が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
この3D培養システム、特に衛星の腫瘍で観察されたセル構造は、先16に示すようにメチレンブルー溶液でゲルを染色した後、平面投影することによって定量することができます。細胞培養の様々な段階でヘキスト33258でのゲルのサンプルを染色すると、エピ蛍光倒立顕微鏡（図4）の下で細胞核を可視化することができます。
図4： ホルモン応答性乳癌細胞。ヒト乳房癌MCF-7細胞を、タモキシフェンの異なる濃度に暴露した。フィブリンゲル（ 上段 ）でサテライト腫瘍は位相差顕微鏡で観察しました。 （擬一次腫瘍の細胞の存在を示す）コラーゲンゲルからのDNA（下段）、ヘキスト33258で染色し、落射蛍光顕微鏡を用いて可視化しました。予想通り、タモキシフェンは、アポトーシスの結果として、DNA断片化を誘導した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 試薬 | ボリューム |
| DMEM 5倍（無炭酸）粉末から準備 | 1ミリリットル |
| FBS | 0.5ミリリットル |
| 0.26 MのNaHCO 3 | 0.5ミリリットル |
| 1NのNaOH | 20μlの |
| ddH 2 O | 100μlの |
| 氷の上でこのソリューションをキープ | |
| 細胞懸濁液 | 880μlの |
| まあ追加迅速に氷の上で、最後に混ぜます。 | |
| RTTコラーゲン（3.5 mg / mlで） | 2ミリリットル |
| 全容積 | 5ミリリットル |
表1： コラーゲンプラグ必要な試薬および18-19プラグ用コラーゲン溶液の調製。 気泡を回避しながら、（上下の容器を反転させて）コラーゲンを添加した後、直ちによく混合し、その後速やかに各ウェルに200μlずつ配布します。
| ステップ | | 考えられる理由 | ソリューション | |
| ステップ1。 コラーゲンプラグ | 気泡 | 不適切なピペッティング* | 過度の泡を避けながらよく混ぜます。 |
| すべての方法ダウンピペットピストンで各200μLを描き、（ピペット操作を逆方向）のみに200μlをリリース。* | |||
| コラーゲンプラグ収縮 | 一晩インキュベートしたとき、コラーゲンプラグは、特に、特定の細胞株で収縮します。 | 細胞は、実験を開始する前に、コラーゲンの収縮を誘発するかどうかを確認してください。数日かけて収縮を監視することをお勧めします。それ以外の場合は、プラグが挟まれたゲルに収縮することができます。 | |
| ゲル化は発生しません | 鮮度、モル濃度、pH値、等）のための試薬を確認してください。何の試薬が省略されていないことを確認してください。 | BEGからやり直しイニング。 | |
| ステップ2。 フィブリンゲルの第一層 | 気泡 | 同じコメント*;練習が必要。 | 同じ溶液。*気泡がフィブリンゲル中に残っているかもしれないが、彼らは通常、37℃で時間をかけて消えます。 |
| ゲル化は発生しません | 使用フィブリノゲンの間違った量。トロンビン濃度または分解をチェックしてください。 | もう一度最初から開始します。 | |
| トロンビン溶液が不十分であると仮定する。わずかに（2回、 例えば ）濃度および/ またはトロンビンの量を増やします。 | |||
| ゲル化後の残留液相 | フィブリノゲン溶液とトロンビンよく混合しません。 | もう一度最初から開始します。 | |
| フィブリンが均質でない（ すなわち線維状の構造、凝集体） | トロンビンは不十分ゲル中に拡散しています。元cessiveまたは不十分な攪拌 | 練習が必要。最初からやり直してください。 | |
| ステップ3。 サンドイッチ/ 2のフィブリン層 | ステップ2と同じコメント。 | ||
| コラーゲンプラグは急速に（数時間）、フィブリンに空き領域に囲まれて | フィブリンは、コラーゲンゲルと接触して十分に重合していません | 最初からやり直します | |
| コラーゲンプラグは次第に（日週）フィブリンに空き領域によって囲まれていてもよいです | 地元の溶解; | それはプラグ周りのいくつかの場所に制限されている場合、実験は上に行くことができます。それ以外の場合は最初から開始することを検討してください。プラスミノーゲン活性化因子を過剰に分泌する細胞が原因である可能性があります。 | |
| 抗線維素溶解薬を忘れてはいけません！ | |||
| ステップ4と5。 セルリットルの文化とフォローアップ | 線維素溶解 | 抗線維素溶解剤を通報します（劣化、準最適用量、 など 。）。 | 衛星腫瘍または侵入の大規模な量ならば、抗線維素溶解剤の投与量を増加させます。 |
| 酸性化 | 過剰な細胞増殖。 | 細胞培養培地は、より頻繁に変化します。 | |
表2：トラブルシューティング考えられる問題点と提案されたソリューション。
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Discussion
重要な技術脚注として、ギャップは、中枢および末梢ゲルとの間の界面に存在しないことが必須です。それ以外の場合は、フィブリンゲルに侵入/移行する細胞の能力を低下させる可能性があります。トロンビンは、適切に希釈されていない場合、コラーゲンとフィブリンゲルとの間の空間は、培養の最初の24時間の間に形成してもよいです。試験した細胞株は、それによって両方のゲルの間に形成するために、比較的大きなスペースを引き起こし、培養中に収縮したコラーゲンゲルを導くかもしれないことも可能です。これは、間質細胞は、筋線維芽細胞様活性18による癌細胞と共にコラーゲンゲル内で混合される場合に特に期待されている。このアーチファクトを回避するために、コラーゲンプラグはより長い期間、37℃でインキュベートされるべきである（≥48時間）フィブリンサンドイッチを組み立てる前に、ゲルの収縮を誘導します。
また、アッセイで遭遇する問題は存在でありますフィブリン原線維または凝集体の識別可能。これは、癌細胞の遊走経路の摂動にデータの解釈を複雑にフィブリンゲルに曇っの代わりに半透明の側面を与えます。このような問題は、培養プレート中で、重合プロセスの間にフィブリノーゲン溶液の不十分なまたは過剰な振とうから生じ得ます。また、フィブリノゲン溶液（ステップ2.3）にトロンビンの不適切な付加に起因する可能性があります。不適切に形成されるか、または曇ったフィブリンゲルは、一度固化し固定することができません。コラーゲンまたはフィブリンゲルは、多くの場合、自然インキュベータで数日後に解放される気泡を含有してもよいです。それにもかかわらず、適切なピペッティングは、その発生を最小限に抑えます。細胞培養期間の開始時に抗線維素溶解剤を導入することをお勧めします。線維素溶解が原因細胞活性及びc内のタンパク質分解酵素（ すなわち 、プラスミノーゲン活性化因子）の活性化に細胞培養の長い期間の後に発生する可能性がありますプレートの下にollagenプラグ、衛星腫瘍、癌細胞の種類に応じて、分解フィブリンゲルと細胞付着からコラーゲンプラグの彼らの攻撃性19【選択解除は、過剰な線維素溶解の2つの結果である（ 表でトラブルシューティングの項を参照してください2）。本技術の限界は、それが困難なゲル全体を通して細胞を観察することができるフィブリンゲルの厚さです。しかし、長い作動距離コンデンサで使用顕微鏡がこの制限を回避するために、全体のZ軸に沿って細胞をモニターするために役立ちます。共焦点または生体顕微鏡はまた、フィブリンゲル中の細胞を可視化するための代替手段を提供することができます。
この三次元細胞培養モデルを開発するための主要な目的の1つは、癌細胞が自由に移動して開発することができ、それを通して、細胞外マトリックスのコンパートメントを提供することでした。フィブリンがあるため腫瘍におけるその存在を選択して、これは、炎症、壊死、変更血管形成により誘導される血管透過性の増加を負う、およびフィブリンはまた、腫瘍細胞浸潤20,21を容易にするために知られているからです。それは腫瘍で、そのようなフィブリンとして、新たな支えとマトリックスの生産を模倣するように、2つのコンパートメントとの間のインタフェースは、多くの関心を示しています。また、酸素および栄養素の拡散は、より長い実行し、pH安定性で、おそらく拡散が促進されている周辺フィブリン区画に比べコラーゲン区画に異常調節されます。最初に中央のコラーゲンプラグに集約癌細胞の数が多いために、壊死/アポトーシスの兆候が患者22内の原発腫瘍の拡張中に観察される現象をシミュレートし、培養中の原発腫瘍内で観察されています。また、サテライト腫瘍の形成が顕著に癌細胞の攻撃性ならびにそれらの転移挙動に関連しています。細胞株とO型に応じて、Fの実験では、関連する転移過程を観察するために必要なインキュベーション期間は30日限りとすることができます。これは、他の3Dアッセイのためのより通常長いですが、追加された遅延は、その場腫瘍内のモデルより代表を研究することの利点をもたらします。
よく三次元培養モデル中で増殖した細胞は、単層細胞培養5,23と比較して、細胞シグナル伝達および遺伝子発現の差を表示することが認識されます。 3Dで癌細胞を成長させることも化学療法剤24-26への感受性に影響を与えます。この三次元細胞培養モデルの重要かつ魅力的な特徴は、このようにECMの濃度、及び細胞 - 細胞および細胞 - ECMの生体力学的特性で作業者に関心のあるゲルの剛性を変更する可能性に常駐します相互作用、ならびに細胞浸潤/遊走上にマトリックスのプロパティの効果27を処理します 。ここに提示された3D細胞培養アッセイを適合させることができます異なる設定および/または実験条件に合わせて編。例えば、アッセイは、多数の細胞を必要とする研究を収容するためにスケールアップすることができます。材料の量と細胞の数を2倍にすることにより、コラーゲンプラグは、48ウェルプレート中で調製することができ、6ウェルプレート中にフィブリンゲルに重層。一方、ハイスループット試験及びためフィブリンゲルの一貫性のない均一性の測定のための培養系を小型化することが困難な場合があります。
2ゲル区画の非癌性細胞の導入は、癌細胞の挙動を変更することができます。前立腺癌細胞株PC3は、線維芽細胞および内皮細胞14と混合される場合、例えば、衛星腫瘍の形成が悪化します。あるいは、蛍光標識された細胞株は、細胞 - 細胞相互作用を調査するために、及び/又は培養期間中に細胞を追跡するために、ゲル区画に導入することができます。さらに、こんにちはstologicalのセクションでは、ゲル固定後に調製することができます。フィブリンとの交差反応が起こり得るので、免疫組織化学結果の質は、抗体間で変化してもよいです。このようなヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と同様に組織切片のルーチン染色は、ゲルマトリックス（ 図3D）の内側の細胞組織を明らかにすることができます。
（ガラスピペットを用いてプラグを抜くことで、 例えば ）フィブリンゲルからコラーゲンプラグを削除することは比較的容易です。従って、フィブリンゲル中に存在する細胞およびサテライト腫瘍は、コラーゲンプラグに見られるものとは別個に成長させることができます。サテライトコロニーからの細胞は、外科的ハサミやメスでコロニーを抽出し、フィブリンゲルから自由セルにアプロチニンない培養培地中で成長させることによって収穫することができます。複合ゲルの異なる区画から細胞を収集することは、遺伝子およびタンパク質発現解析を含む種々のさらなる研究を、許可することができます。できる他にもさらに、in vitroまたはin vivo試験で積極的な表現型を有する細胞集団を単離するために使用することができます。例えば、この三次元培養モデルは、黒色腫転移16に関与する遺伝子を同定するために使用しました。すべてのこれらの代表的なアプリケーションは、明らかに細胞の共培養を行うことが可能な二区画三次元細胞培養システムで許可され、柔軟性を示します。
結論として、我々の3D培養システムの設計は柔軟であり、癌細胞のアポトーシス、遊走および転移の間、ならびに抗癌剤の評価のための生物学的および分子的事象を研究するための新しい手段を提供することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
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