Abstract
a cultura de células de mamífero em monocamadas é amplamente utilizado para estudar vários processos fisiológicos e moleculares. No entanto, esta abordagem para estudar as células que crescem frequentemente gera artefactos indesejados. Portanto, a cultura de células em um ambiente tridimensional (3D), muitas vezes o uso de componentes da matriz extracelular, surgiu como uma alternativa interessante devido à sua estreita semelhança com o nativo no tecido vivo ou órgão. Foi desenvolvido um sistema de cultura celular 3D utilizando dois compartimentos, a saber, (i) um compartimento central contendo células cancerosas embebidas numa actuação gel de colagénio como um tumor macrospherical pseudo-primário e (ii) um compartimento livre de células periférica feita de um gel de fibrina, isto é, um componente de matriz extracelular diferente do utilizado no centro, no qual as células cancerígenas podem migrar (invasão frente) e / ou formar microparticulas tumores representam tumores secundários ou satélite. A formação de tumores satélite no compartimento periférico énotavelmente correlacionados com a agressividade conhecido ou origem metastático das células tumorais nativas, que faz com que este sistema de cultura 3D original. Esta abordagem de cultura de células pode ser considerada para avaliar a capacidade de invasão de células do cancro e a motilidade, as interacções célula-matriz extracelular e como um método para avaliar as propriedades de drogas anti-cancro.
Introduction
Investigando as características fundamentais e biomédicas de invasão da célula cancerosa / migração e subsequente criação metástase é objecto de um 1,2 intensa pesquisa. A metástase é o último estágio do câncer e seu manejo clínico permanece indefinida. Uma melhor compreensão de metástases nos níveis celulares e moleculares permitirá o desenvolvimento de terapias mais eficazes 3.
Várias propriedades de células metastáticas pode ser explorada in vitro, incluindo a sua stemness 4 e potencial para adquirir um estado de transição (por exemplo, a transição epitelióide-mesenquimal) para migrar e invadem dentro e a partir do tumor primário 5. No entanto, a avaliação in vitro de processos / metástase de invasão tem sido um desafio, uma vez que praticamente exclui a contribuição da circulação de sangue / linfático. culturas organotípicas que incorporam fragmentos de tumor em géis de colagénio têm Previously sido utilizada para monitorizar a agressividade do cancro. Embora a complexidade dos tumores é preservada (por exemplo, a presença de células não-cancerosas), fragmentos tumorais são expostas a difusão forma limitada, a variação de amostragem, e a um crescimento excessivo de células estromais 6. Um método alternativo consiste em crescer as células cancerosas no interior de componentes da matriz extracelular (ECM), que imita o ambiente celular tridimensional (3D). A proliferação de linhas celulares de cancro da mama num gel de colagénio e / ou uma matriz de membrana basal é derivada entre os exemplos mais bem caracterizados de cultura de células 3D. Através da utilização de ambientes de cultura de células específicas 3D, o conjunto desorganizado observado para as células de cancro da mama cultivadas sob condições padrão pode ser revertida para a formação espontânea de ácinos mamaria e estruturas tubulares 7-10. Além disso, a formação de esferóides multicelulares de tumores derivados de células de cancro de adenocarcinoma congregados utilizando técnicas diferentes (por exemplo, pendurado gotas, esferóides flutuante, agar embedment) constitui agora o ensaio de cultura de células 3D mais utilizada 11-13. No entanto, este ensaio é limitado pelo conjunto restrito de linhas celulares de cancro que podem formar esferóides e pela curto período disponível para estudar células nestas condições.
Nesta técnica visualizada, que aqui se introduzir um ensaio de cultura de células 3D sofisticado, onde as células cancerosas de interesse são incorporados num gel de colagénio para permitir a formação in vitro de um tumor pseudo-primário que pode ser alternativamente revestido com uma matriz derivada de membrana basal. Uma vez formado, o tumor pseudo-primário é, em seguida, colada em uma matriz acelular (gel de fibrina, no presente caso), o que permite que as células cancerosas para atravessar a interface entre os dois compartimentos da matriz (ver Figura 1). Curiosamente, as estruturas semelhantes a tumores, secundárias provenientes do tumor pseudo-primário, juntamente com as células cancerosas agressivas aparecem nagel de fibrina. Um tal sistema de cultura 3D oferece a flexibilidade necessária para investigar, por exemplo, fármacos anti-cancerígenos, de expressão de genes e célula-célula e / ou interacções célula-ECM 14-16.
Figura 1:.. Visão Geral do Método resumo esquemático do método para gerar o sistema de cultura celular 3D como um modelo para estudos de câncer Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
NOTA: Não ética consideração, pois as células cancerosas em animais e humanos foram adquiridos ou gentilmente cedido para nós.
1. Fazendo Collagen Plugs (Tumor Pseudo-primário)
- Prepara-se uma dispersão de colagénio. Colágeno tipo I de tendões da cauda de rato (RTT) podem ser extraídos e esterilizados conforme relatado anteriormente 17, ou comprada. Dispersar colagénio liofilizado RTT (3,25-3,50 mg / ml em 0,02 N de ácido acético) usando um misturador (ajuste de alta velocidade; cinco mínimo de duas vezes), para uma mistura uniforme.
- Colheita (tripsina-EDTA, geralmente) e usar a exclusão de azul de tripano para a contagem de células viáveis utilizando um hemacitómetro. Ajustar a densidade celular desejada (5 x 10 4 culas por tampão).
- Preparar todas as soluções (NaOH, soro de bovino fetal, meio DMEM 5x, NaHCO3) separadamente (Tabela 1) sob condições estéreis e mantê arrefecida em gelo. Nota: A ordem de adição dos vários soluções é importante para evitar choques osmóticos ou ácidas em células.
- Realizar dispersão de células (1,25 x 10 6 células) na solução de colagénio final (5 ml) tão rapidamente quanto possível. Misture bem (por pipetagem para cima e para baixo), evitando bolhas de ar, e, em seguida, distribuir rapidamente 200 pi da solução pronta para uso, em cada poço de uma placa de 96 poços. Suavemente atacar a placa multi-poços na superfície da capa de cultura de célula a área de trabalho para remover as bolhas de ar e para espalhar a solução uniformemente dentro dos poços.
- Depois de preencher todos os poços (esta etapa leva cerca de 15-20 minutos por placa de 96 poços), armazená-lo para a incubadora.
- Incubar a placa a 37 ° C a partir de 2 horas até durante a noite. O colagénio de gelificação (ou seja, a fibrilogénese) ocorre dentro de 30 min. Adicionar meio de cultura (100 ul / cavidade) à cultura para realizar uma incubação de um dia para o outro.
2. primeira camada de fibrina Gel
- Fibrinogênio Preparação Solution.
NOTA: O mesmo lote de gel de fibrina devem, idealmente, ser utilizado para Resul mais reprodutívelTS, como formação de gel de fibrina pode variar entre os diferentes lotes de fibrinogénio liofilizado comercial.- Sempre use uma solução de fibrinogénio preparados na hora. Traga o fibrinogénio liofilizado até à temperatura ambiente antes de abrir o frasco para evitar a formação de cristais de hidrato.
- Progressivamente dissolver o fibrinogénio em pré-aquecido (37 ° C) Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) com Ca2 + / Mg2 + a uma concentração de trabalho de 3 mg / ml (considerar a preparação de um excesso de 15% do volume final mínima necessária : por exemplo, 17,25 mg em 5,75 ml de uma solução 5 ml).
- Adicionar pré-aquecido, gota a gota HBSS em primeiro lugar para solubilizar fragmentos de fibrinogénio. Quebrar fragmentos maiores com uma espátula no copo. Agitar o recipiente de tempos a tempos para facilitar a mistura. Não use um disco de agitação durante o procedimento. Dissolver o pó restante pipetando a suspensão para cima e para baixo.
- Manter a solução de fibrinogénio morna enquanto SteriLIZING a solução por passagem através de um filtro de 0,22 um. Nota: Se o HBSS não está suficientemente quente ou o fibrinogênio não completamente dissolvido, a solução pode obstruir o filtro. Se for o caso, substituir o filtro de uma ou duas vezes, o que pode diminuir a concentração de fibrinogênio e rigidez, assim, coágulo de fibrina.
- Suspender as células de interesse (por exemplo, células endoteliais) em solução de fibrinogénio pronto-para-uso durante o ajuste do seu volume final, tal como um procedimento alternativo.
- Preparar as soluções de trombina.
- Prepara-se uma solução estoque em ddH2O (50 NIH unidades / ml), em seguida, esterilizá-lo utilizando um filtro de 0,22 um.
- Usar uma proporção / trombina do fibrinogénio ≥1: 0,0075 (v / v), a fim de gerar o gel de fibrina.
- Gerando o gel de fibrina.
- Mantenha o fibrinogênio estéril e trombina soluções estoque em gelo durante todas as etapas seguintes. Os geles de fibrina são permitidos para formar em placas de 24 poços.
- th prontamente sobreposiçãoe a superfície de cada cavidade com a solução de fibrinogénio (200 ul / poço), evitando a formação de bolhas de ar. Processo 6 poços a uma hora.
- Uma vez que a solução de fibrinogénio cobre completamente a superfície dos poços, inclinar a placa a um ângulo de 45 ° e adicionar 1,5 ml de solução de trombina para o primeiro poço soltando a trombina para o centro do poço, e em seguida rodar suavemente a placa horizontalmente para 1-2 seg.
- Deixar a placa numa posição estável sob a câmara de fluxo laminar (5-10 minutos) até que o processo de gelificação / coagulação foi concluída (NB: o processo de polimerização não deve ser perturbado, por exemplo, através do transporte da placa para a incubadora).
- Uma vez que os primeiros seis poços polimerizado, repetir a mesma sequência (ou seja, as 3 etapas anteriores) para os próximos seis poços até que todos os poços foram processadas.
3. segunda camada de fibrina Gel e imprensado Collagen plug
- OpçãoA: (A utilização do colágeno Ligue imediatamente).
- Certifique-se de que a primeira camada de gel de fibrina polimerizada em todos os poços por delicadamente da inclinação da placa. Colocar a placa de 96 poços contendo lado os tampões de gel de colagénio a lado com a placa de 24 cavidades (contendo os geles de fibrina) para facilitar a transferência das fichas de colagénio.
- Adicionar uma gota de HBSS a cada poço da placa contendo as fichas de colagénio.
- Remover cada vela de colagénio do poço com uma agulha fina montado numa seringa (usado como um identificador) ou usando um micro-colher (veja o vídeo). Transfira cada vela de colágeno para a primeira camada de gel de fibrina usando um ou dois micro-colheres, assegurando ao mesmo tempo que a ficha colágeno é bem centrado no poço e que a esterilidade é bem conservado.
- Overlay o gel de fibrina previamente formada com a segunda camada de solução de fibrinogénio (300 ul / poço) e introduzir a trombina como descrito em 2.3, mantendo um mínimo de 1:. Relação de 0,0075 e uma sequência de seis poços de cada vez </ Li>
- Opção B (Revestimento do Collagen Plug com uma fina camada de Fator de Crescimento reduzido membrana basal (GFRBM)).
- Frescos todas as soluções preparadas e instrumentos de antemão e mantê-los a 4 ° C ou em gelo (por exemplo, pipetas, pontas, tubos de ensaio) durante o manuseio desde alíquotas congeladas de GFRBM são muito sensíveis à taxa de aquecimento excessivo durante a descongelação (siga as instruções do fabricante) .
- Após a remoção a partir dos poços da placa, mergulhar cada vela de colagénio durante 2 min num tubo de centrífuga de 1,5 ml em gelo contendo 100 uL de uma solução GRFBM puro.
- Transferir cada vela revestida sobre a primeira camada de fibrina, enquanto assegurando que é bem centralizada, tal como descrito anteriormente. Incubar as placas contendo os plug a 37 ° C durante 5 min para permitir a GRFBM para formar um gel. Adicione a segunda camada de fibrina como no passo 3.1.4.
4. Cultura Celular condições do meio
- Encher cada poço com meio de cultura (quatro00 uL). Os meios de cultura e suplementos serão seleccionados com base na linha celular e as condições experimentais.
- Adicionar aprotinina, um agente antifibrinolítica, ao meio de cultura a uma concentração final de 100 unidades de inibidor de calicreína (KIU) / ml.
NOTA: Armazenar as placas numa incubadora de cultura de células de acordo com as condições utilizadas para a linha de células testada. - Reabastecer culturas com meio fresco a cada dois dias ou de acordo com o programa experimental, e adicionar aprotinina. Antes de adicionar meio fresco, inclinar ligeiramente a placa (com um ângulo de 30-35 °) e inclinar a pipeta contra o lado de aspiração do poço, enquanto cuidadosamente o meio condicionado sob observação constante.
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Representative Results
Como mencionado anteriormente, uma característica interessante deste ensaio de cultura de células 3D é que as células de cancro não só podem migrar a partir do bujão de colagénio para o gel de fibrina adjacente, mas também estabelecer tumores secundários (por exemplo, estruturas, por satélite tumoral). Isto pode ser directamente observado com um microscópio de contraste de fase invertida com ampliações de baixa e alta, através da espessura do gel, especialmente com um condensador de distância de funcionamento longo (Figura 2). Usando este método de cultura de células em 3D, o comportamento de células metastáticas conhecidos podem ser facilmente comparados ao encontrado em células não metastáticas, como demonstrado repetidamente com diferentes configurações experimentais 15. Por exemplo, numerosos tumores de satélite são encontrados dispersos aleatoriamente no gel de fibrina com o B16F10 linha celular metastático, enquanto apenas muito poucos minúsculos tumores de satélite pode então ser detectado com o seu homólogo não metastático, linha de células B16F0 (Figura 2).
Figura 2:. Comportamento do rato Melanoma B16F10 (A) e B16F0 Cells (B) no celular 3D Sistema de Cultura A B16F10 e celulares B16F0 linhas são conhecidos por serem metastático e fracamente metastático, respectivamente. Uma vista de cima do gel compósito é mostrada após 15 dias em cultura em placa de 24 poços. A ficha de colagénio (*) é adjacente a uma camada de gel de fibrina em que as células migraram (setas) e formaram tumores satélite como pode ser visto em maior ampliação. Muito convenientemente, estas linhas de células expressam um alto nível de melanina que permite a visualização direta (ou seja, sem coloração). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A forma dos tumores da frente e de satélite de migração podem variar como uma funcção das características da linha celular. Por exemplo, as células de carcinoma mamário murino 4T07 glândula, que são fracamente metastática, mas são muito invasivos localmente, formam uma frente de migração que se estende radialmente para o gel de fibrina (Figura 3A). Após 14 dias de cultura, as células têm puxado para longe da frente migratória para formar estruturas stellar-forma muito semelhantes estruturas da glândula mamária (Figura 3B-D).
Figura 3: Rato glândula mamária Carcinoma Cells 4T07. Estas células demonstram uma forte capacidade para migrar no gel de fibrina (A). A linha a tracejado delineia o bujão de colagénio e as setas indicam a direcção da frente de migração. As células invadir uniformemente a matriz de fibrina (A), e bem organizado, estruturas tubulares estelar-forma pode ser observada em 3D (a Bd C). Vistas à microscopia de contraste de fase. (A - C) e cortes histológicos corados pelo HE (D) são mostradas Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As estruturas celulares observados com este sistema de cultura 3D, em particular os tumores de satélite, pode ser quantificado por projecção planar após coloração dos géis com uma solução de azul de metileno como se mostra anteriormente 16. A coloração do gel com amostras de Hoechst 33258 em vários estádios da cultura celular permite visualizar os núcleos das células ao microscópio de epifluorescência invertida (Figura 4).
Figura 4: cancro da mama células sensíveis a hormônios. mama humanoCancro MCF-7 As células foram expostas a diferentes concentrações de tamoxifeno. Tumores satélite em geles de fibrina (linha superior) foram observadas por microscopia de contraste de fase. ADN a partir dos géis de colagénio (que indicam a presença de células em tumores pseudo-primário) (linha de baixo), foi corado com Hoechst 33258 e visualizado utilizando microscopia de epifluorescência. Como esperado, o tamoxifeno fragmentação do DNA induzida como resultado da apoptose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| reagentes | Volume |
| 5x DMEM (sem bicarbonato) Preparar a partir de pó | 1 mL |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M de NaHCO3 | 0,5 ml |
| De NaOH 1 N | 20 ul |
| ddH2O | 100 ul |
| Conservar esta solução em gelo | |
| A suspensão de células | 880 ul |
| Bem misturam no gelo e, finalmente, adicionar rapidamente: | |
| RTT colagénio (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Volume total | 5 ml |
Tabela 1:. O colagénio Plugs Reagentes requeridos e preparação de uma solução de colagénio para 18-19 tampões. Misture bem imediatamente após a adição do colagénio (por inversão do recipiente cima e para baixo), evitando ao mesmo tempo as bolhas de ar, e, em seguida, distribuir imediatamente 200 uL a cada poço.
| Passos | | As possíveis razões | soluções | |
| Passo 1. plugue de colágeno | Bolhas de ar | pipetagem inadequado * | Misture bem, evitando bolhas excessivas. |
| Desenhar cada 200 mL com pistão pipeta toda maneira para baixo e solte a apenas 200 ul (reverse pipetagem). * | |||
| contração ficha de colágeno | tampão colagénio encolhe com certas linhas de células, particularmente quando incubadas durante a noite. | Verifique se as células induzem a contração de colágeno antes de iniciar o experimento. Recomenda-se a monitorização da contração durante alguns dias. Caso contrário, os plugues podem contrair-se no gel imprensado. | |
| A gelificação não ocorre | Verificar reagentes para a frescura, molaridade, pH, etc); garantir que nenhum reagente foi omitido. | Começar de novo do princípioinning. | |
| Passo 2. Primeira camada de gel de fibrina | Bolhas de ar | Mesmos comentários *; precisa de prática. | Mesma solução. * As bolhas de ar podem permanecer no gel de fibrina, mas em geral eles desaparecem ao longo do tempo a 37 ° C. |
| A gelificação não ocorre | quantidade errada de fibrinogénio usado; verifique a concentração ou a degradação da trombina. | Começar de novo desde o início. | |
| Assumir a trombina solução é inadequada; aumentar ligeiramente a concentração e / ou o volume de trombina (por exemplo, duas vezes). | |||
| fase líquida residual após a gelificação | solução de fibrinogénio e a trombina não é bem misturado. | Começar de novo desde o início. | |
| A fibrina não é homogénea (isto é, estruturas fibrilares, aglomerados) | A trombina tem insuficientemente difundidos no gel; exagitação sucessivas ou insuficiente | Precisa de prática; recomeçar do início. | |
| Passo 3. Camada de fibrina / 2º Sandwich | Mesmos comentários como no passo 2. | ||
| plugue de colágeno é rapidamente (algumas horas) cercado por áreas vazias em fibrina | Fibrina não polimerizado adequadamente em contacto com gel de colágeno | Começar de novo desde o início | |
| plugs de colágeno pode ser progressivamente (dias-semanas) cercado por áreas vazias em fibrina | lise local; | Se for restrita a poucos lugares ao redor do plugue, o experimento pode continuar. Caso contrário, considerar que começar do início. Poderia ser devido às células que segregam uma quantidade excessiva do activador do plasminogénio. | |
| Não se esqueça do agente antifibrinolítico! | |||
| Passo 4 e 5. Cell cultura e acompanhamento | fibrinólise | Problema com o agente antifibrinolítico (degradação, a dose sub-óptima, etc.). | Se grande quantidade de tumores ou invasão de satélite, aumentar a dose do agente antifibrinolítica. |
| A acidificação | o crescimento celular excessivo. | Alterar meio de cultura celular com mais frequência. | |
Tabela 2: Resolução de problemas Possíveis problemas e soluções propostas..
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Discussion
Como uma nota importante técnica, é essencial que nenhum intervalo está presente na interface entre a central e os géis periféricos. Caso contrário, pode reduzir a capacidade das células para migrar / invadem o gel de fibrina. Um espaço entre o colagénio e os geles de fibrina podem formar durante as primeiras 24 h de cultura, se a trombina não foi apropriadamente diluído. É também possível que a linha de células testada pode levar o gel de colagénio para contrair durante a cultura, fazendo assim com que um espaço relativamente grande para formar entre os dois géis. Este é especialmente o esperado quando as células do estroma são misturadas no gel de colagénio, juntamente com as células cancerosas devido à actividade miofibroblástica semelhante 18. A fim de evitar esse artefacto, o bujão de colagénio deve ser incubada a 37 ° C durante um período mais longo (horas ≥48 ) para induzir a contracção de gel antes de montar o sanduíche de fibrina.
Um problema encontrado também com o ensaio consiste na presençadiscernível de fibrilas de fibrina ou aglomerados. Isto confere um nublado em vez de aspecto translúcido para o gel de fibrina, o que dificulta a interpretação dos dados, devido à perturbação das vias migratórias de células de câncer. Tais problemas podem surgir a partir de agitação insuficiente ou excessiva da solução de fibrinogénio durante o processo de polimerização nas placas de cultura. Pode também ser devido à adição de trombina imprópria para a solução de fibrinogénio (passo 2.3). Um gel de fibrina formados de maneira inadequada ou nublado não pode ser fixada uma vez solidificado. Colagénio ou fibrina géis podem conter bolhas de ar que, na maioria dos casos, serão libertados espontaneamente após alguns dias de incubação; no entanto, pipetagem adequada minimiza a sua ocorrência. Recomenda-se para introduzir um agente anti-fibrinolítico no início do período de cultura de células. A fibrinólise pode ocorrer depois de um longo período de cultura de células devido à actividade celular e a activação de enzimas proteolíticas (por exemplo, activador do plasminogénio) dentro do collagen bujão e os tumores de satélite, dependendo dos tipos de células de cancro e a sua agressividade 19 .A libertação do tampão de colagénio a partir do gel de fibrina degradada e a fixação de células ao fundo dos pratos são duas consequências da fibrinólise excessiva (ver secção de resolução de problemas na Tabela 2). Uma limitação da presente técnica é a espessura do gel de fibrina, o que pode tornar difícil observar as células através de todo o gel. No entanto, a utilização de um microscópio com um condensador de longa distância de trabalho ajuda a contornar esta limitação e para monitorar as células ao longo de todo o eixo-Z. A microscopia confocal ou intravital também pode fornecer uma alternativa para visualizar as células no gel de fibrina.
Um dos objectivos principais para o desenvolvimento deste modelo de cultura celular foi 3D para proporcionar um compartimento de matriz extracelular através dos quais as células cancerígenas são capazes de migrar livremente e desenvolver. Fibrina foi escolhido por causa de sua presença em tumores,que deve ao aumento da permeabilidade vascular induzida por inflamação, necrose e angiogénese alterados, e uma vez que a fibrina é também conhecido para facilitar a invasão de células tumorais 20,21. A interface entre os dois compartimentos apresenta muito interesse, dado que imita a produção de nova matriz de suporte, tal como fibrina, em tumores. Além disso, a difusão de oxigénio e nutrientes, e, a longo prazo, a estabilidade do pH, são possivelmente desregulado no compartimento de colagénio em comparação com o compartimento periférico de fibrina em que a difusão seja facilitada. Devido ao grande número de células cancerosas inicialmente agregados em um tampão de colagénio central, sinais de necrose / apoptose são observados dentro do tumor primário durante a cultura, simulando o fenómeno observado durante a expansão de tumores primários em 22 pacientes. Além disso, a formação de tumores por satélite é notavelmente relacionados com a agressividade de células cancerosas, bem como o seu comportamento metastático. Dependendo da linha celular e tipo oexperimento f, o período de incubação para a observação de processos metastáticos relevantes podem ser tão longo quanto 30 dias. Este é geralmente mais longo do que para outros ensaios 3D, mas o atraso adicionado traz a vantagem de se estudar um modelo mais representativo de tumores in situ.
É bem reconhecido que as células cultivadas em modelos de cultura 3D mostrar diferenças na sinalização celular e a expressão do gene em comparação com culturas de células em monocamada 5,23. O crescimento de células cancerosas em 3D também afeta sua sensibilidade aos agentes quimioterápicos 24-26. Uma característica importante e atractiva deste modelo de cultura celular 3D reside na possibilidade de modificar a concentração de ECM, e, assim, a rigidez do gel, que pode ser de interesse para aqueles que trabalham nas propriedades biomecânicas da célula-célula e célula-ECM interacções, bem como o efeito das propriedades da matriz na invasão de células / 27 processa a migração. O ensaio de cultura de células em 3D aqui apresentado pode ser adaptared para atender às diferentes configurações e / ou em condições experimentais. Por exemplo, o ensaio pode ser dimensionado para acomodar estudos que necessitem de um grande número de células; , dobrando a quantidade de material e o número de células, tampões de colagénio pode ser preparado de uma placa de 48 poços e em camadas sobre um gel de fibrina numa placa de 6 poços. Por outro lado, pode ser difícil para miniaturizar o sistema de cultura para os estudos de alto rendimento e homogeneidade de medições porque inconsistente do gel de fibrina.
A introdução de células não-cancerosas em um dos dois compartimentos de gel pode modificar o comportamento das células cancerosas. Por exemplo, a formação de tumores por satélite é exacerbada quando a linha celular PC3 cancro da próstata é misturado com fibroblastos e células endoteliais 14. Alternativamente, as linhas celulares fluorescentemente marcadas podem ser introduzidas nos compartimentos de gel para investigar interacções célula-célula e / ou para rastrear as células durante o período de cultura. Além disso, oiseções stological pode ser preparado após a fixação gel; No entanto, a qualidade dos resultados imuno-histoquímica pode variar entre anticorpos uma vez que podem ocorrer reacções cruzadas com a fibrina. Coloração de rotina dos cortes histológicos, como com hematoxilina e eosina (H & E) pode revelar a organização das células no interior das matrizes de gel (Figura 3D).
É relativamente fácil de remover a tomada de colagénio a partir do gel de fibrina (por exemplo, puxando para fora o tampão com uma pipeta de vidro). Assim, as células e tumores de satélite presente no gel de fibrina podem ser cultivadas separadamente daquelas encontradas no tampão de colagénio. As células a partir das colónias de satélite podem ser colhidas por extracção das colónias com tesouras cirúrgicas ou um bisturi e crescendo-os em meio de cultura sem aprotinina para células livres a partir do gel de fibrina. Colheita de células a partir dos diferentes compartimentos do gel compósito pode permitir que vários outros estudos, incluindo genes e análise de expressão de proteína. Podetambém ser usada para isolar populações de células com o fenótipo agressivos para mais in vitro ou in vivo. Por exemplo, neste modelo de cultura 3D foi utilizado para identificar genes envolvidos em metástase do melanoma 16. Todas essas aplicações representativos demonstram claramente a flexibilidade permitida por um sistema de cultura celular 3D bi-compartimental em que células de co-cultura pode ser levada a cabo.
Em conclusão, o desenho do nosso sistema de cultura 3D é flexível e pode oferecer novas vias para investigar acontecimentos biológicos moleculares e durante a apoptose de células de cancro, migração e metástase, assim como para avaliação de drogas anti-cancro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
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