Abstract
cultivo de células de mamíferos en monocapas se utiliza ampliamente para estudiar diversos procesos fisiológicos y moleculares. Sin embargo, este enfoque para estudiar las células en crecimiento a menudo genera artefactos no deseados. Por lo tanto, el cultivo de células en un entorno de tres dimensiones (3D), a menudo el uso de componentes de la matriz extracelular, surgió como una alternativa interesante debido a su estrecha similitud con el nativo en el tejido vivo o un órgano. Hemos desarrollado un sistema de cultivo celular 3D utilizando dos compartimentos, a saber, (i) un compartimiento central que contiene las células cancerosas embebidas en una actuación gel de colágeno como un tumor macrospherical pseudo-primaria y (ii) un compartimento libre de células periférica hecha de un gel de fibrina, es decir, un componente de la matriz extracelular diferente de la utilizada en el centro, en el que las células cancerosas pueden migrar (frente de invasión) y / o formar tumores microesféricas representan tumores secundarios o satélite. La formación de tumores de satélite en el compartimiento periférico esnotablemente correlacionada con la agresividad conocido u origen metastásico de las células tumorales nativas, lo que hace que este sistema de cultivo 3D único. Este enfoque de cultivo celular podría considerarse para evaluar la invasividad del cáncer celular y la motilidad, las interacciones célula-matriz extracelular y como un método para evaluar las propiedades de fármacos anti-cáncer.
Introduction
La investigación de las características fundamentales y biomédicas de la invasión de células de cáncer / migración y el posterior establecimiento de metástasis es objeto de una intensa investigación de 1,2. La metástasis es la última etapa del cáncer y su tratamiento clínico sigue siendo difícil de alcanzar. Una mejor comprensión de la metástasis en los niveles celular y molecular permitirá el desarrollo de terapias más eficientes 3.
Varias propiedades de las células metastásicas se pueden explorar in vitro 4 incluyendo su stemness y potencial de adquirir un estado de transición (por ejemplo, la transición epitelioide-mesenquimal) para migrar e invadir dentro y desde el tumor primario 5. Sin embargo, la evaluación in vitro de procesos / metástasis invasión ha sido un reto, ya que prácticamente elimina la contribución de la circulación de la sangre / linfático. Los cultivos organotípicos que incorporan fragmentos de tumor en geles de colágeno tienen Previouastuta ha utilizado para controlar la agresividad del cáncer. Aunque se preserva la complejidad de los tumores (por ejemplo, la presencia de células no cancerosas), fragmentos de tumor están expuestos a la difusión medio limitado, a la variación del muestreo, y a un crecimiento excesivo de las células del estroma 6. Un método alternativo consiste en el crecimiento de células de cáncer dentro de los componentes de la matriz extracelular (ECM), que imita el entorno celular en tres dimensiones (3D). La proliferación de líneas celulares de cáncer de mama en un gel de colágeno y / o una matriz derivada de la membrana basal es uno de los ejemplos mejor caracterizados de cultivo celular en 3D. Mediante el uso de entornos de cultivo de células 3D específicas, el conjunto desorganizado observado para las células de cáncer de mama cultivadas en condiciones estándar se puede invertir para la formación espontánea de acinos mamaria y estructuras tubulares 7-10. Además, la formación de esferoides de tumor multicelulares derivados de células de cáncer de adenocarcinoma congregó utilizando diferentes técnicas (por ejemplo, colgando gotas, esferoides flotante, agar empotramiento) constituye ahora el ensayo de cultivo celular 3D utilizado más comúnmente 11-13. Sin embargo, este ensayo está limitado por el conjunto restringido de líneas celulares de cáncer que pueden formar esferoides y por el corto período de tiempo disponible para estudiar las células en estas condiciones.
En esta técnica visualizado, que en el presente documento introduce un ensayo de cultivo celular 3D sofisticado donde las células de cáncer de interés están incrustadas en un gel de colágeno para permitir la formación in vitro de un tumor pseudo-primaria que puede ser, alternativamente, recubierta con una matriz de membrana derivada de sótano. Una vez formado, el tumor primario se pseudo-entonces intercalado en una matriz acelular (gel de fibrina en el presente caso), que permite a las células cancerosas para cruzar la interfaz entre los dos compartimentos de la matriz (véase la Figura 1). Curiosamente, las estructuras similares a tumores secundarios procedentes de la pseudo-tumor primario junto con células cancerosas agresivas aparecen en elgel de fibrina. Tal sistema de cultivo 3D ofrece la flexibilidad requerida para investigar, por ejemplo, medicamentos contra el cáncer, la expresión génica y la célula-célula y / o las interacciones célula-ECM 14-16.
Figura 1:.. Descripción general del método de resumen esquemático del método para generar el sistema de cultivo celular 3D como modelo para estudios de cáncer Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
NOTA: No se cuenta la ética ya que las células cancerosas humanas y animales fueron comprados o amablemente proporcionados a nosotros.
1. Realización de colágeno enchufes (Pseudo-Tumor primario)
- Preparar una dispersión de colágeno. Colágeno de tipo I de tendones de cola de rata (RTT) puede ser o bien extraídas y esterilizadas como se informó anteriormente 17, o comprar. Dispersar el colágeno liofilizado RTT (3,25 a 3,50 mg / ml en 0,02 N de ácido acético) usando un mezclador (ajuste de alta velocidad; cinco carreras 2 min) para una mezcla uniforme.
- Cosecha (tripsina-EDTA, por lo general) y utilizar la exclusión de azul de tripano para el recuento de células viables utilizando un hemocitómetro. Ajuste a la densidad celular deseada (5 x 10 4 células por enchufe).
- Preparar todas las soluciones (NaOH, suero fetal bovino, DMEM 5x, NaHCO 3) por separado (Tabla 1) bajo condiciones estériles y mantener refrigerados en hielo. Nota: El orden de adición de las diversas soluciones es importante para prevenir los choques osmóticos o ácidas en las células.
- Realizar dispersión celular (1,25 x 10 6 células) en la solución de colágeno final (5 ml) lo más rápidamente posible. Mezclar bien (pipeteando arriba y abajo), evitando burbujas de aire, y luego distribuir rápidamente 200 l de la solución lista para el uso en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. golpear suavemente la placa de múltiples pocillos en la superficie del área de trabajo de la campana de cultivo de células para eliminar las burbujas de aire y difundir la solución uniformemente en el interior de los pozos.
- Después de llenar todos los pocillos (este paso toma alrededor de 15-20 minutos por placa de 96 pocillos), almacenarlo en la incubadora.
- Incubar la placa a 37 ° C de 2 horas hasta toda la noche. La gelificación del colágeno (es decir, la fibrilogénesis) se produce dentro de 30 min. Añadir medio de cultivo (100 l / pocillo) al cultivo para realizar una incubación durante la noche.
2. La primera capa de fibrina Gel
- Preparación de soluciones de fibrinógeno.
NOTA: El mismo lote de gel de fibrina idealmente se debe utilizar para resul más reproduciblets, la formación de gel como la fibrina puede variar entre los diferentes lotes de fibrinógeno comercial liofilizado.- Siempre use una solución de fibrinógeno recién preparada. Llevar el fibrinógeno liofilizado a temperatura ambiente antes de abrir el vial para evitar la formación de cristales de hidrato.
- Progresivamente disolver el fibrinógeno en pre-calentado (37 ° C) solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con Ca2 + / Mg2 + a una concentración de trabajo de 3 mg / ml (considerar la preparación de un exceso de 15% del volumen final mínima requerida : por ejemplo, 17,25 mg en 5,75 ml de una solución de 5 ml).
- Añadir gota a gota pre-calentado HBSS en un primer momento para solubilizar fragmentos de fibrinógeno. Descomponer fragmentos más grandes con una espátula en el vaso de precipitados. Agitar el vaso de precipitados de vez en cuando para facilitar la mezcla. No utilice una placa de agitación durante el procedimiento. Disolver el polvo restante pipeteando la suspensión de arriba abajo.
- Mantenga la solución de fibrinógeno tibia mientras sterilizing la solución pasándola a través de un filtro de 0,22 micras. Nota: Si el HBSS no es lo suficientemente caliente o el fibrinógeno no se disuelve completamente, la solución puede obstruir el filtro. En su caso, reemplace el filtro de una o dos veces, lo que puede disminuir la concentración de fibrinógeno, y por lo tanto la rigidez del coágulo de fibrina.
- Suspender las células de interés (por ejemplo, células endoteliales) en solución de fibrinógeno-lista para usar mientras se ajusta su volumen final, como un procedimiento alternativo.
- Preparación de las soluciones de trombina.
- Preparar una solución madre en ddH 2 O (50 NIH unidades / ml), a continuación, esterilizarla utilizando un filtro de 0,22 micras.
- Utilice una relación / trombina de fibrinógeno ≥1: 0,0075 (v / v) con el fin de generar el gel de fibrina.
- Generando el gel de fibrina.
- Mantenga el fibrinógeno y trombina estéril soluciones madre en el hielo durante todos los pasos a seguir. Los geles de fibrina se les permite formar en placas de 24 pocillos.
- º prontitud superposicióne superficie de cada pocillo con la solución de fibrinógeno (200 l / pocillo), evitando la formación de burbujas de aire. Procedimiento 6 pocillos a la vez.
- Una vez que la solución de fibrinógeno cubre completamente la superficie de los pocillos, la inclinación de la placa en un ángulo de 45 ° y añadir 1,5 l de solución de trombina a la primera bien dejando caer la trombina en el centro del pozo, y luego agitar suavemente la placa en posición horizontal para 1-2 seg.
- Dejar la placa en una posición estable bajo la campana de flujo laminar (5-10 min) hasta que el proceso de gelificación / coagulación ha completado (NB: el proceso de polimerización no debe ser perturbado, por ejemplo, mediante el transporte de la placa a la incubadora).
- Una vez que los primeros seis pozos han polimerizado, repetir la misma secuencia (es decir, los 3 pasos anteriores) para los próximos seis pozos hasta que todos los pozos han sido procesados.
3. Segunda capa de fibrina gel de colágeno e intercalado Plug
- OpciónA: (El uso del tapón de colágeno Inmediatamente).
- Asegúrese de que la primera capa de gel de fibrina se polimeriza en todos los pozos inclinando suavemente la placa. Coloque la placa de 96 pocillos que contiene el lado tapones de gel de colágeno a lado con la placa de 24 pocillos (que contiene los geles de fibrina) para facilitar la transferencia de los tapones de colágeno.
- Añadir una gota de HBSS en cada pocillo de la placa que contiene los tapones de colágeno.
- Retire cada tapón de colágeno del pozo con una aguja delgada montada en una jeringa (utilizado como asa) o utilizando un micro-cuchara (ver video). Transferir cada tapón de colágeno sobre la primera capa de gel de fibrina usando uno o dos micro-cucharas, mientras se asegura de que el tapón de colágeno está bien centrado en el pozo y que la esterilidad se mantiene bien.
- Superposición de gel de fibrina previamente formada con la segunda capa de solución de fibrinógeno (300 l / pocillo) e introducir la trombina como se describe en 2.3, manteniendo un mínimo 1:. Relación de 0,0075 y una secuencia de seis pocillos a la vez </ Li>
- Opción B (recubrimiento del tapón de colágeno con una capa delgada de la reducción de factor de crecimiento-membrana basal (GFRBM)).
- Enfriar todos las soluciones preparadas e instrumentos de antemano y mantenerlos a 4ºC o en hielo (por ejemplo, pipetas, puntas, tubos de ensayo) durante la manipulación ya alícuotas congeladas de GFRBM son muy sensibles a la velocidad de calentamiento excesivo durante la descongelación (siga las instrucciones del fabricante) .
- Después de la eliminación de los pocillos de la placa, en remojo cada tapón de colágeno durante 2 minutos en un tubo de centrífuga de 1,5 ml en hielo que contiene 100 l de una solución GRFBM puro.
- Transferir cada tapón revestido sobre la primera capa de fibrina garantizando al mismo tiempo que es bien centrada, como se describió anteriormente. Incubar las placas que contiene enchufables a 37 ° C durante 5 min para permitir que el GRFBM para formar un gel. Añadir la segunda capa de fibrina como en el paso 3.1.4.
4. Cell Culture Medium Condiciones
- Llenar cada pocillo con medio de cultivo (400 l). Los medios de cultivo y los suplementos se seleccionarán sobre la base de la línea celular y las condiciones experimentales.
- Añadir aprotinina, un agente antifibrinolítico, al medio de cultivo a una concentración final de 100 unidades de inhibidor de calicreína (KIU) / ml.
NOTA: Guarde las placas en una incubadora de cultivo de células en las condiciones utilizadas para la línea celular probado. - Reponer los cultivos con medio fresco cada dos días o de acuerdo con el calendario experimental, y añade aprotinina. Antes de la adición de medio fresco, ligeramente la inclinación de la placa (en un ángulo de 30 a 35 °) y inclinar la pipeta contra el lado del pozo, mientras que la aspiración cuidadosamente el medio acondicionado en observación constante.
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Representative Results
Como se mencionó anteriormente, una característica interesante de este ensayo de cultivo de células 3D es que las células cancerosas no sólo pueden migrar desde el tapón de colágeno al gel de fibrina adyacentes, sino también establecer tumores secundarios (estructuras por ejemplo, vía satélite tumorales-like). Esto puede observarse directamente con un microscopio de contraste de fase invertida a bajas y altas magnificaciones a través del espesor de gel, especialmente con una distancia condensador de funcionamiento larga (Figura 2). El uso de este método de cultivo celular 3D, el comportamiento de las células metastásicas conocidas se puede fácilmente en comparación con la encontrada en células no metastásicas, como se ha demostrado en varias ocasiones con diferentes configuraciones experimentales 15. Por ejemplo, numerosos tumores satélites se encuentran dispersos al azar en el gel de fibrina con la línea celular B16F10 metastásico, mientras que sólo muy pocos tumores satélites pequeños de modo se pueden detectar con su contraparte no metastásico, B16F0 línea celular (Figura 2).
Figura 2:. Comportamiento de melanoma de ratón B16F10 (A) y células B16F0 (B) en el Sistema de cultivo celular 3D El B16F10 y células B16F0 líneas son conocidos por ser metastásico y débilmente metastásico, respectivamente. Una vista superior del gel compuesto se muestra después de 15 días de cultivo en placa de 24 pocillos. El tapón de colágeno (*) es adyacente a una capa de gel de fibrina en el que han migrado células (flechas) y formado tumores de satélite como se ve a mayor aumento. Muy convenientemente, estas líneas de células expresan un alto nivel de melanina que permite la visualización directa (es decir, sin manchar). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La forma de los tumores frontales y de satélite de migración puede variar como funcción de las características de la línea celular. Por ejemplo, las células 4T07 murinos mamarias de carcinoma de la glándula, que son poco metastásico, pero son muy invasiva localmente, forman un frente de migración que se extiende radialmente en el gel de fibrina (Figura 3A). Después de 14 días de cultivo, las células se han separado de la parte delantera migratoria para formar estructuras con forma estelar muy parecidas a las estructuras de la glándula mamaria (Figura 3B-D).
Figura 3: Ratón Glándula Mamaria Carcinoma células 4T07. Estas células demuestran una fuerte capacidad de migrar en el gel de fibrina (A). La línea discontinua delimita el tapón de colágeno y las flechas muestran la dirección de la parte delantera de la migración. Las células invaden de manera uniforme la matriz de fibrina (A), y bien organizados, estructuras tubulares estelar-forma se pueden observar en 3D (una Bd C). Vistas bajo el microscopio de contraste de fase. (A - C) y las secciones histológicas teñidas por hematoxilina y eosina (D) se muestran Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las estructuras celulares observados con este sistema de cultivo 3D, en particular los tumores de satélite, pueden ser cuantificados por proyección plana después de la tinción de los geles con una solución de azul de metileno como se indica anteriormente 16. La tinción muestras de gel con Hoechst 33258 en varias etapas de cultivo celular permite visualizar los núcleos de las células bajo epifluorescencia invertido microscopía (Figura 4).
Figura 4: Las células de cáncer de mama sensible a hormonas. de mama humanosCancerosas MCF-7 células fueron expuestas a diferentes concentraciones de tamoxifeno. Tumores satélite en geles de fibrina (fila superior) fueron observadas por microscopía de contraste de fase. ADN de los geles de colágeno (que indican la presencia de células en los tumores de los pseudo-primario) (fila inferior), se tiñó con Hoechst 33258 y se visualizaron mediante microscopía de epifluorescencia. Como era de esperar, la fragmentación del ADN inducida por tamoxifeno como resultado de la apoptosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| reactivos | Volumen |
| 5x DMEM (sin bicarbonato) Preparar a partir de polvo | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO 3 | 0,5 ml |
| NaOH 1 N | 20 l |
| ddH2O | 100 l |
| Mantener esta solución en hielo | |
| suspensión celular | 880 l |
| Así la mezcla en hielo y finalmente añadir rápidamente: | |
| RTT de colágeno (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Volumen total | 5 ml |
Tabla 1:. El colágeno Plugs reactivos necesarios y preparación de una solución de colágeno para 18-19 enchufes. Mezclar bien inmediatamente después de la adición del colágeno (el recipiente por inversión arriba y abajo), mientras que evita las burbujas de aire, y luego distribuir rápidamente 200 l a cada pocillo.
| Pasos | | Posibles razones | soluciones | |
| Paso 1. tapón de colágeno | Burbujas de aire | pipeteo inapropiado * | Mezclar bien y evitar burbujas excesivas. |
| Dibuje cada 200 l con una pipeta de émbolo todo el camino hacia abajo y liberar a 200 l (Pipeteado inverso). * | |||
| tapón de colágeno contracción | tapón de colágeno se contrae con ciertas líneas celulares, en particular cuando se incubaron durante la noche. | Comprobar si las células inducen la contracción del colágeno antes de iniciar el experimento. Se recomienda controlar la contracción durante unos días. De lo contrario, los tapones pueden contratar en el gel intercalada. | |
| La gelificación no se produce | Comprobación de los reactivos para la frescura, molaridad, pH, etc.); asegurarse de que ningún reactivo se ha omitido. | Empezar de nuevo desde BEGinning. | |
| Paso 2. La primera capa de gel de fibrina | Burbujas de aire | Los mismos comentarios *; necesita práctica. | La misma solución. * Las burbujas de aire puede permanecer en el gel de fibrina pero por lo general desaparecen con el tiempo a 37 ° C. |
| La gelificación no se produce | cantidad incorrecta de fibrinógeno utilizada; comprobar la concentración de trombina o degradación. | Empezar de nuevo desde el principio. | |
| Supongamos que la trombina solución es inadecuada; aumentar ligeramente la concentración y / o el volumen de la trombina (por ejemplo, dos veces). | |||
| fase líquida residual después de la gelificación | solución de fibrinógeno y trombina no se mezclan bien. | Empezar de nuevo desde el principio. | |
| La fibrina no es homogénea (es decir, estructuras fibrilares, aglomerados) | La trombina se ha difundido de manera inadecuada en el gel; exla agitación excesiva o insuficiente | Necesita la práctica; empezar de nuevo desde el principio. | |
| Paso 3. Sandwich / 2ª capa de fibrina | Mismas observaciones que en el paso 2. | ||
| tapón de colágeno es rápidamente (unas horas) rodeadas por zonas vacías en la fibrina | La fibrina no ha polimerizado adecuadamente en contacto con gel de colágeno | Empezar de nuevo desde el principio | |
| tapones de colágeno pueden ser progresivamente (días-semanas), rodeada de áreas vacías en la fibrina | lisis Local; | Si se limita a unos pocos lugares en el enchufe, el experimento puede seguir así. De lo contrario, considerar la posibilidad de comenzar desde el principio. Podría ser debido a células que secretan una cantidad excesiva de activador del plasminógeno. | |
| No se olvide que el agente antifibrinolítico! | |||
| Paso 4 y 5. Cell de cultivo y seguimiento | fibrinólisis | Problema con el agente antifibrinolítico (degradación, dosis subóptima, etc.). | Si extensa cantidad de tumores satélites o invasión, aumentar la dosis del agente antifibrinolítico. |
| Acidificación | el crecimiento celular excesivo. | Cambio de medio de cultivo de células con más frecuencia. | |
Tabla 2: Solución de problemas Posibles problemas y soluciones propuestas..
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Discussion
Como un importante nota técnica, es esencial que ningún hueco está presente en la interfaz entre la central y los geles periféricos. De lo contrario, podría reducir la capacidad de las células para migrar / invadir el gel de fibrina. Un espacio entre el colágeno y los geles de fibrina puede formar durante la primera 24 horas de cultivo si la trombina no se ha diluido apropiadamente. También es posible que la línea celular probado podría llevar el gel de colágeno se contraiga durante el cultivo, causando así un espacio relativamente grande para formar entre ambos geles. Esto es especialmente espera que cuando las células del estroma se mezclan en el gel de colágeno, junto con las células de cáncer debido a la actividad myofibroblastic-como 18. A fin de evitar este artefacto, el tapón de colágeno debe ser incubado a 37 ° C durante un período más largo (≥48 hr ) para inducir la contracción de gel antes de montar el sándwich de fibrina.
Un problema también se encontró con el ensayo es la presenciade discernible fibrillas de fibrina o aglomerados. Esto confiere un nublado en lugar de aspecto translúcido para el gel de fibrina, lo que complica la interpretación de datos debido a la perturbación de las rutas migratorias de células de cáncer. Tales problemas pueden surgir de agitación inadecuada o excesiva de la solución de fibrinógeno durante el proceso de polimerización en las placas de cultivo. También puede ser debido a la adición indebida de la trombina en la solución de fibrinógeno (paso 2.3). Un gel de fibrina formación deficiente o turbia no puede fijarse una vez solidificado. Colágeno o fibrina geles pueden contener burbujas de aire que, en la mayoría de los casos, será liberado espontáneamente después de unos días en la incubadora; sin embargo, una dosificación apropiada minimiza su aparición. Se recomienda introducir un agente anti-fibrinolítico en el inicio del periodo de cultivo de células. La fibrinólisis se puede producir después de un largo período de cultivo celular debido a la actividad celular y la activación de enzimas proteolíticas (es decir, activador del plasminógeno) dentro de la cenchufe ollagen y los tumores de satélite, dependiendo de los tipos celulares de cáncer y su agresividad 19 de liberación .La del tapón de colágeno a partir del gel de fibrina degradado y la fijación de células a la parte inferior de las placas son dos consecuencias de la fibrinólisis excesiva (ver sección de solución de problemas en la Tabla 2). Una limitación de la técnica presente es el espesor del gel de fibrina, que puede hacer que sea difícil para observar células a través de todo el gel. Sin embargo, el uso de un microscopio con un condensador de gran distancia de trabajo ayuda a evitar esta limitación y para supervisar las células a lo largo de todo el eje Z. La microscopía confocal o intravital también puede proporcionar una alternativa de visualizar las células en el gel de fibrina.
Uno de los principales objetivos para el desarrollo de este modelo de cultivo celular 3D era proporcionar un compartimiento de la matriz extracelular a través del cual las células cancerosas son capaces de migrar y desarrollar libremente. La fibrina fue seleccionado debido a su presencia en los tumores,que se debe al aumento de la permeabilidad vascular inducida por la inflamación, necrosis y la angiogénesis alterada, y puesto que la fibrina es también conocido para facilitar la invasión de células tumorales 20,21. La interfaz entre los dos compartimientos presenta un gran interés ya que imita la producción de nueva matriz de apoyo, tales como fibrina, en los tumores. Por otra parte, el oxígeno y los nutrientes de difusión, y en el largo plazo, la estabilidad del pH, se desregula, posiblemente, en el compartimiento de colágeno en comparación con el compartimiento periférico de fibrina en el que se facilita la difusión. Debido al gran número de células cancerosas inicialmente agregados en un tapón de colágeno central, signos de necrosis / apoptosis se observan dentro del tumor primario durante el cultivo, simulando el fenómeno observado durante la expansión de los tumores primarios en los pacientes 22. Por otra parte, la formación de tumores de satélite es notablemente relacionado con la agresividad de las células cancerosas, así como su comportamiento metastásico. Dependiendo de la línea celular y el tipo of experimento, el período de incubación requerido para la observación de procesos metastásicos pertinentes, pueden ser tan largo como 30 días. Esto es por lo general más largo que para otros ensayos de 3D, pero el retraso añadido aporta la ventaja de estudiar un modelo más representativo de tumores in situ.
Es bien reconocido que las células cultivadas en modelos de cultivo 3D muestran diferencias en la señalización celular y la expresión génica en comparación con cultivos de células monocapa 5,23. Crecer células cancerosas en 3D también afecta a su sensibilidad a agentes quimioterapéuticos 24-26. Una característica importante y atractiva de este modelo de cultivo celular 3D reside en la posibilidad de modificar la concentración de ECM, y por lo tanto la rigidez del gel, que puede ser de interés para los que trabajan en las propiedades biomecánicas de la célula-célula y célula-ECM interacciones, así como el efecto de las propiedades de la matriz en la invasión celular / migración de procesos 27. El ensayo de cultivo de células en 3D que aquí se presenta se puede adaptared para adaptarse a diferentes entornos y / o en condiciones experimentales. Por ejemplo, el ensayo puede ser ampliado para dar cabida a los estudios que requieren un gran número de células; con la duplicación de la cantidad de material y el número de células, tapón de colágeno se pueden preparar en una placa de 48 pocillos y se estratificó sobre un gel de fibrina en una placa de 6 pocillos. Por otro lado, puede ser difícil miniaturizar el sistema de cultivo de alto rendimiento estudios y las mediciones debido a la homogeneidad incoherente del gel de fibrina.
La introducción de las células no cancerosas en uno de los dos compartimentos de gel puede modificar el comportamiento de las células cancerosas. Por ejemplo, la formación de tumores de satélite se ve agravada cuando la línea celular PC3 de cáncer de próstata se mezcla con los fibroblastos y las células endoteliales 14. Alternativamente, las líneas de células marcadas con fluorescencia se pueden introducir en los compartimientos de gel para investigar las interacciones célula-célula y / o para realizar un seguimiento de las células durante el periodo de cultivo. Por otra parte, histological secciones se pueden preparar después de la fijación de gel; Sin embargo, la calidad de los resultados de inmunohistoquímica puede variar entre los anticuerpos ya que pueden producirse reacciones cruzadas con la fibrina. Tinción de rutina de secciones histológicas tales como con hematoxilina y eosina (H & E) puede revelar la organización de células dentro de las matrices de gel (Figura 3D).
Es relativamente fácil de quitar el tapón de colágeno a partir del gel de fibrina (por ejemplo, tirando del cable con una pipeta de vidrio). Así, las células y los tumores de satélites presentes en el gel de fibrina pueden ser cultivadas por separado de las que se encuentran en el tapón de colágeno. Las células de las colonias satélites se pueden cosechar mediante la extracción de las colonias con las tijeras quirúrgicas o un escalpelo y su cultivo en medio de cultivo sin aprotinina a células libres a partir del gel de fibrina. Recogida de las células de los diferentes compartimentos del gel compuesto puede permitir que varios estudios adicionales, incluyendo genes y el análisis de expresión de proteínas. Puedetambién se puede utilizar para aislar poblaciones de células con fenotipos agresivos para más in vitro o en estudios in vivo. Por ejemplo, se utilizó este modelo de cultivo 3D para identificar genes implicados en la metástasis de melanoma 16. Todas esas aplicaciones representativas demuestran claramente la flexibilidad permitida por un sistema de cultivo celular 3D bi-compartimental en el que las células de co-cultivo puede llevarse a cabo.
En conclusión, el diseño de nuestro sistema de cultivo 3D es flexible y puede ofrecer nuevas vías para investigar los eventos biológicos y moleculares durante la apoptosis de las células del cáncer, la migración y la metástasis, así como para la evaluación de medicamentos contra el cáncer.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
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