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Immunology and Infection

निर्धारण ऑटोइम्यून माइलिन रहित में औषधीय हस्तक्षेप के लिए सीएनएस संरक्षण बनाम प्रतिरक्षा प्रणाली दमन

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54348
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3,4
1Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham, 4Center for Glial Biology and Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Introduction

मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) मुख्य रूप से मस्तिष्क रोग में जल्दी के सफेद पदार्थ क्षेत्रों में भड़काऊ घावों की विशेषता है। लंबे समय तक प्रगति के बाद, ग्रे बात शोष एमआरआई इमेजिंग द्वारा पता लगाया और रोग के neurodegenerative चरण के निशान है। रिएक्टिव gliosis, माइलिन रहित, और सफेद पदार्थ में axonal क्षति सीएनएस-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार हैं। उपचार वर्तमान में रिवर्स या सीधे सीएनएस में neurodegeneration रोकने एमएस में इस्तेमाल की कोई नहीं - इसके बजाय, वे सीएनएस में टी सेल सक्रियण और / या घुसपैठ attenuating द्वारा सूजन को कम। क्योंकि एमएस के लिए कोई इलाज नहीं है और मौजूदा उपचार का उपयोग मरीजों को रोग प्रगति का अनुभव करने के लिए जारी, दवाओं है कि माइलिन रहित और neuronal नुकसान को रोकने की खोजों गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर प्रभाव और सीएनएस पर उन लोगों के बीच फर्क प्रयोगात्मक मुश्किल हो सकता है, परिणाम के रूप में - यानी, सीएनएस के लिए कम नुकसान - एस लग रहा हैजिसके माध्यम से यह होता है तंत्र की परवाह किए बिना ame। इसलिए, सीएनएस सुरक्षा का आकलन परिधि में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रसार को सीएनएस-घुसपैठ का निर्धारण करने के लिए कैसे औषधीय एजेंटों रोग तंत्र को प्रभावित के आकलन के साथ भागीदारी की जानी चाहिए।

प्रायोगिक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) स्व-प्रतिरक्षित भड़काऊ विकारों कि दवाओं की खोज वर्तमान में एमएस 1-4 इलाज के लिए इस्तेमाल के लिए सीधे तौर पर जिम्मेदार था की एक अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल है। चूहे अक्सर C57BL / 6 चूहों आनुवंशिक वेरिएंट की उपलब्धता के आधार पर एक लोकप्रिय तनाव होने के साथ EAE के लिए उपयोग किया जाता है। C57BL / 6 चूहों EAE के साथ प्रेरित दिन 10 के बाद प्रेरण के आसपास शुरू होने के साथ पुरानी बीमारी प्रगति दिखा रहे हैं। रीढ़ की हड्डी पैरेन्काइमा और सेरिबैलम की घुसपैठ इन जानवरों के ऊतकविकृतिविज्ञानी के लक्षण हैं, cortical पैरेन्काइमा 5 में घुसपैठ के अभाव के साथ। इसके अतिरिक्त, cortical घावों और बी में माइलिन रहितबारिश रोग 6-9 की पहचान है, जो C57BL / 6 चूहों में अपेक्षाकृत अनुपस्थित रहे हैं। इसलिए, यह संभव है जब SJL चूहों, जो पुनरावर्तन-प्रेषण रोग और दोनों मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में पाया घावों कि एमएस 10 में उन लोगों के समान दिखाई देते हैं का उपयोग करने के लिए बेहतर हो सकता है।

उपचार न्यूरोप्रोटेक्टिव के रूप में वर्गीकृत नहीं किया जा सकता है, तो प्रतिरक्षा कोशिकाओं सीएनएस तक कभी नहीं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और परिधि में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रसार पर उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए दिमाग, रीढ़ की हड्डी डोरियों, और EAE चूहों से spleens के प्रवाह cytometric विश्लेषण के उपयोग, जैसा कि पहले 11 का प्रदर्शन किया जाता है। सीएनएस ऊतकों की Immunohistochemical विश्लेषण हद तक और neuroprotection की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए भी वर्णन किया गया है। इन तरीकों का मेल है कि क्या प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय और परिधि में प्रचूर मात्रा में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं सीएनएस में प्रवेश किया है कि क्या कर रहे थे के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, और सीएनएस था कि क्या जनसंपर्कसूजन या नुकसान से otected। न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव प्रतिरक्षा प्रणाली पर प्रभाव के बावजूद संदेह कर रहे हैं, तो प्रयोगकर्ताओं उपचार प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के बाद प्रारंभ होने के समय में हुआ है सीएनएस बदल सकते हैं।

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल सक्रिय EAE, एमएस की एक टी सेल की मध्यस्थता पशु मॉडल की दो अलग अलग मॉडल का उपयोग मौजूद है, और बीमारी के दौरान विभिन्न समय अंक पर immunohistochemistry के साथ संयुक्त प्रवाह cytometry विश्लेषण के विभिन्न पहलुओं पर प्रयोगात्मक उपचार की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए एमएस रोगजनन। इस विधि प्रतिरक्षा सेल प्रसार और घुसपैठ सीएनएस संरक्षण बनाम पर प्रभाव के बीच का फर्क है, यह आसान नीचे संकीर्ण करने के लिए कैसे दवाओं रोग रोगजनन पर कार्रवाई करने में शोधकर्ताओं की सहायता करेंगे।

Protocol

प्रयोगात्मक चूहों को शामिल प्रक्रियाओं प्रासंगिक संस्थागत और सरकारी नियमों का पालन करना चाहिए। वर्तमान अध्ययन के लिए, चूहे रखे और बर्मिंघम संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों पर स्वास्थ्य और अलबामा विश्वविद्यालय के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार इलाज किया गया।

1. EAE प्रेरण और स्कोरिंग

  1. C57BL / 6 चूहों 11-13 या SJL चूहों 10,11 में EAE प्रेरित के रूप में पहले 13 में वर्णित है।
    नोट: प्रयोगकर्ता अपने अनुसंधान सवाल (आगे विस्तार के लिए चर्चा देखें) के लिए एक मॉडल आदर्श चुनना चाहिए।
  2. रिकॉर्ड स्कोर दैनिक के रूप में पहले प्रत्येक माउस के दिन 7 के बाद प्रेरण पर शुरुआत के लिए 11 में वर्णित है। उपचार समूहों के बीच के समय में औसत दैनिक स्कोर की तुलना करें।

2. उपचार

  1. रोग शुरू होने से पहले EAE चूहों का इलाज निर्धारित करने के लिए अगर इलाज प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ या प्रसार को प्रभावित करता है।
    1. एक उपचार का चयन, मुझेप्रसव के Thod, और नशीली दवाओं के रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता, आधा जीवन, और खुराक पर विचार करते हुए उपचार की आवृत्ति।
      नोट: EAE रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता बढ़ जाती है और दवाओं सीएनएस कि अन्यथा स्वस्थ पशुओं में सक्षम नहीं होगा तक पहुँचने के लिए अनुमति हो सकती है। EAE नैदानिक ​​स्कोर पर देख खुराक प्रतिक्रिया घटता के लिए प्रयोगों का आयोजन दवा का एक उचित खुराक चुनने में मदद मिल सकती है। वाहन नियंत्रण नशीली दवाओं के उपचार के लिए समानांतर में किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सशर्त पीटा चूहों नियंत्रण के रूप में littermates के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. इस प्रयोग के लिए SJL या C57BL / 6 चूहों का प्रयोग करें। चूहों का इलाज EAE प्रेरण (दिन 7) जल्दी के बाद, प्रसव के चुने हुए विधि का उपयोग लक्षणों की शुरुआत से पहले।
    3. बलिदान और रोग के शिखर (लगभग 15 दिन) में चूहों काटना, 3.1 कदम और इसके उप-कदम, समय के साथ उच्चतम स्कोर नैदानिक ​​औसत के आधार पर के रूप में।
    4. आचार (3.2 कदम के रूप में) माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों पर प्रवाह cytometry प्रतिरक्षा सेल infiltrati निर्धारित करने के लिएसीएनएस के पर, और (के रूप में कदम 3.3 में) spleens पर परिधि में प्रतिरक्षा सेल प्रसार निर्धारित करने के लिए। अलग चूहों पर, (4 कदम के रूप में) आचरण immunohistochemistry astrocytes और microglia, और माइलिन के संरक्षण यों की।
  2. रोग शुरू होने के बाद EAE चूहों के इलाज के बाद प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ हो गई है उपचार सीएनएस की रक्षा करता है, तो यह निर्धारित करने के लिए।
    1. दोहराएँ कदम 2.1.1।
    2. इस प्रयोग के लिए SJL चूहों का उपयोग करें, के रूप में इन चूहों दर्जे का रोग माफी की है। रोग में पहली बार चोटी के दौरान चूहों को समझो (या, यदि एक के बाद पतन के चरम पर वांछित,) के रूप में औसत नैदानिक ​​स्कोर द्वारा मापा जाता है।
    3. एक वांछित समय के बाद EAE प्रेरण पर चूहों बलिदान। क्योंकि घुसपैठ पहले से ही हुई है, यह FACS विश्लेषण द्वारा घुसपैठ को मापने के लिए उपयोगी नहीं हो सकता। हालांकि, प्रतिक्रियाशील gliosis और माइलिन यों तो अगर वहाँ प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के बावजूद सीएनएस सुरक्षा है निर्धारित करने के लिए रीढ़ की हड्डी डोरियों ले।

3. फ्लो का विश्लेषण

  1. विच्छेदन
    1. लेबल तीन 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (मस्तिष्क के लिए एक, रीढ़ की हड्डी के लिए एक, और तिल्ली के लिए एक) जानवर के आईडी और ऊतक के प्रकार के साथ पशु प्रति निहित। बर्फ पर पूरी प्रक्रिया के लिए अलग ट्यूबों में सभी ऊतकों रखें।
    2. 3 मिनट - spleens के FACS विश्लेषण के लिए, रोग (~ 15 दिन के बाद EAE प्रेरण) 2 के लिए प्रति मिनट के बारे में 15% कंटेनर मात्रा के प्रवाह की दर के साथ कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग कर के चरम पर चूहों बलिदान। श्वसन की कमी से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें। प्रत्येक माउस के बलिदान के बाद, एक व्यक्ति में तिल्ली 14 और जगह को हटाने, लेबल (कदम 3.1.1 से) 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब युक्त ठंडा RPMI 2% एफसीएस, 100 आइयू पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ( प्रोटोकॉल भर में "मीडिया") के रूप में भेजा।
    3. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के FACS विश्लेषण के लिए, शल्य कैंची circulatin को रिहा करने के साथ माउस का सही आलिंद काटने से हृदय छिड़काव प्रदर्शनजी रक्त और भेदी ठंडा पीबीएस के 10 मिलीलीटर से भरा एक सिरिंज से जुड़े एक सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल। धीरे-धीरे 10 मिलीलीटर पीबीएस इंजेक्षन।
    4. माउस के सिर काट और एक शल्य कैंची के साथ खोपड़ी के midline में कटौती कर सकते हैं। पील त्वचा वापस हाथ से या संदंश के साथ और एक एक प्रारंभिक स्थल के रूप में रीढ़ की हड्डी के प्रवेश बिंदु का उपयोग शल्य कैंची के साथ खोपड़ी के midline को काटा, बनाते हैं।
    5. माइक्रो संदंश के साथ खोपड़ी दूर छील और मस्तिष्क को मुक्त करने की एक स्कूप का उपयोग करें। दिमाग लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (कदम 3.1.1 से) युक्त मीडिया में रखें।
    6. संदंश और शल्य कैंची के साथ माउस की त्वचा निकालें, और शल्य कैंची का उपयोग माउस अंतड़ी निकालना। अंग, पूंछ, पसलियों कट, और शल्य कैंची के साथ किसी भी आसपास पेशी कशेरुका स्तंभ मुक्त करने के लिए।
    7. शल्य कैंची के साथ के बारे में 5 लगभग बराबर टुकड़ों में कशेरुका स्तंभ कट और एक hemostat के साथ एक टुकड़ा के एक छोर निचोड़ है, और फिर एक और hemostat टी का उपयोगओ, फैलाएंगे टुकड़ा साथ चलती है जब तक रीढ़ की हड्डी ऊपर से बाहर निचोड़ कर रख जारी है। कशेरुका स्तंभ के एक टुकड़े के लिए इस दोहराएँ और व्यक्ति में डोरियों जगह, 15 मिलीलीटर (कदम 3.1.1 से) शंक्वाकार ट्यूबों मीडिया वाले लेबल।
  2. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ का आकलन
    1. बाँझ कैंची का उपयोग छोटे टुकड़ों में दिमाग और रीढ़ की हड्डी डोरियों कट। जबकि मीडिया के साथ झरनी rinsing एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी पर एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से सवार के साथ क्रश। मीडिया के साथ एक 50 मिलीलीटर की मात्रा करने के लिए प्रत्येक ट्यूब लाओ। गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए 453 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 40% घनत्व ढाल मीडिया के 4 मिलीलीटर में resuspend गोली। ध्यान से ढाल के समुचित लेयरिंग सुनिश्चित करने के लिए 40% घनत्व शंक्वाकार ट्यूब की दीवार पर एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब-पिपेट में 70% घनत्व ढाल के 2 मिलीलीटर के शीर्ष पर कोशिकाओं से युक्त बहुत धीरे धीरे ढाल ओवरले। साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए 796 XG पर स्पिनएक ब्रेक बाहर।
    3. ध्यान से, एक 1 मिलीलीटर हस्तांतरण विंदुक के साथ ढाल से ऊपरी परत को हटाने माइलिन फिर एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक 1 मिलीलीटर हस्तांतरण पिपेट और हस्तांतरण के साथ इंटरफेस में व्यवहार्य कोशिकाओं को हटा दें। 10 मिनट के लिए 448 XG पर मीडिया और सेंट्रीफ्यूज के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब लाओ।
    4. 200 μl मीडिया में resuspend गोली और एक 96 अच्छी तरह गोल-नीचे की थाली से एक अच्छी तरह से में जगह (प्रत्येक जानवर से प्रत्येक नमूना अपने स्वयं अच्छी तरह से में जाना होगा)। 5 मिनट के लिए 410 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
    5. restimulation मीडिया के 200 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली बंद झटका (RPMI 10% एफसीएस के साथ पूरक, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, 1x गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट , और 55 माइक्रोन के β-mercaptoethanol, प्लस 50 एनजी / एमएल phorbol myristate एसीटेट (पीएमए), 750 एनजी / एमएल ionomycin, और प्रोटीन परिवहन अवरोध Brefeldin ए)। 4 घंटे के लिए 37 ओ सी में एक मशीन में प्लेट रखें।
      नोट: पीएमए और ionomआदेश में सभी टी lymphocytes-चाहे उनके प्रतिजन विशिष्टता के के सक्रियण में ycin restimulation परिणामों को देखते हुए ऊतकों में प्रत्येक टी सेल सबसेट की कुल संख्या का आकलन करने के लिए। हालांकि, विशिष्ट प्रतिजन प्रेरक टी सेल प्रतिक्रिया Brefeldin एक 15,16 की उपस्थिति में MOG पेप्टाइड के साथ कोशिकाओं restimulating सहित विभिन्न तरीकों में मूल्यांकन किया जा सकता है।
    6. सीएनएस सीडी 4+ टी सेल phenotypes का आकलन
      1. ऊष्मायन के बाद, सेंट्रीफ्यूज 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेट (कदम 3.2.5 से), 5 मिनट के लिए 410 XG पर और सतह पर तैरनेवाला बंद झटका। निम्नलिखित धुंधला चरणों के सभी इस थाली में किया जाता है।
      2. कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 410 XG पर 2% एफसीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ 200 μl पीबीएस में धो लें। सतह पर तैरनेवाला बंद झटका और 200 μl पीबीएस युक्त 2% एफसीएस 10 के लिए एफसी ब्लॉक (क्लोन 2.4G2) के साथ के साथ कोशिकाओं को सेते हैं - बर्फ पर 15 मिनट।
      3. बाह्य दाग, सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं 410 XG पर 5 मिनट के लिए 50 में से सतह पर तैरनेवाला बंद झटका, और resuspend गोली शुरू करने के लिए, और# 956; सतह दाग कॉकटेल के एल सीडी 4 के खिलाफ fluorophore लेबल एंटीबॉडी युक्त (1: 200, 1 माइक्रोग्राम / एमएल), TCRβ (1: 200, 1 माइक्रोग्राम / एमएल), और व्यवहार्यता डाई (1: 500) 15 के लिए पीबीएस में पतला मिनट बर्फ पर। 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला बंद झटका के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। धो कोशिकाओं 200 μl पीबीएस में 2x तो 5 मिनट के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र।
      4. बाह्य दाग को हटाने के बाद, intracellular धुंधला द्वारा पीछा निर्धारण / permeabilization द्वारा intracellular धुंधला प्रक्रिया आरंभ करें।
        1. रात भर 4 ओ सी पर 30 मिनट के लिए; (देखें सामग्री सूची निर्माता के निर्देशों के अनुसार) Foxp3 प्रतिलेखन कारक धुंधला अभिकर्मकों 17 के साथ सतह पर तैरनेवाला शुरू करने के लिए, झाड़ू और तय / Permeabilize कोशिकाओं
        2. 5 मिनट के लिए 410 XG पर किट और सेंट्रीफ्यूज थाली से 150 μl permeabilization बफर में कोशिकाओं को धो लें। आईएल 17A के खिलाफ fluorophore लेबल-एंटीबॉडी के साथ 50 μl permeabilization बफर में सतह पर तैरनेवाला और दाग कोशिकाओं बंद झटका (1: 200, 1 माइक्रोग्राम / एमएल), IFN-γ (1: 200, 1 माइक्रोग्राम / एमएल), और Foxp3 (1: 200, 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) बर्फ पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में पतला।
        3. 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला बंद झटका के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। अतिरिक्त एंटीबॉडी 200 μl permeabilization बफर में धो 3x तो 5 मिनट के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र निकालने के लिए। 200 μl पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend बंद झटका।
        4. प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण, लाइव सीडी 4 + TCRβ + कोशिकाओं के रूप में पहले से वर्णित 11 प्रत्येक अणु व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत का आकलन करने पर gating। एक hemocytometer 18 या अन्य मान्य पद्धति का उपयोग करके सीडी 4+ टी सेल phenotypes से प्रत्येक के साथ माउस प्रति कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गणना।
        5. प्राप्त आंकड़ों का उपयोग करना, प्रतिशत और प्रत्येक माउस से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में घुसपैठ सीडी 4+ टी कोशिकाओं की संख्या की गणना इन आबादियों जो EAE रोगजनन और संरक्षण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं पर एक विशेष ध्यान के साथ19: आईएल 17A + IFN-γ -, आईएल 17A + IFN-γ +, आईएल 17A - IFN-γ +, Foxp3 +।
  3. परिधीय टी सेल प्रसार और सक्रियता का आकलन
    1. एक 60 x 15 मिमी संस्कृति डिश में पाले सेओढ़ लिया गिलास स्लाइड के साथ तिल्ली क्रश। कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए मीडिया का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन रखें। 5 मिनट के लिए 448 XG पर मीडिया और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब भरें।
    2. 2 मिलीलीटर में महाप्राण मीडिया और resuspend गोली एसीके आरटी पर बफर lysing लगभग 3 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए।
    3. एक नया ट्यूब में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी पर मीडिया के साथ 15 मिलीलीटर की मात्रा और तनाव के लिए ट्यूब ले आओ। अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 448 XG पर तैरनेवाला, और 2 मिलीलीटर मीडिया में resuspend aspirate।
    4. की-67 धुंधला द्वारा परिधीय सीडी 4+ टी सेल प्रसार का आकलन
      1. EQ के एक छोटे से विभाज्य (आमतौर पर 200 μl) की जगहएक 96 अच्छी तरह गोल-नीचे की थाली में अलग-अलग कुओं (नमूना प्रति एक) में 3.3.3 से splenocytes की uivalent संख्या।
      2. 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला बंद झटका के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र। 200 μl पीबीएस में Resuspend युक्त 2% एफसीएस और दोहराने centrifugation। पीबीएस युक्त 2% एफसीएस एफसी ब्लॉक (क्लोन 2.4G2) के साथ साथ सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं बंद झटका और 10 के लिए सेते हैं - बर्फ पर 15 मिनट। बाह्य दाग दोहराने कदम 3.2.6.3 के लिए।
      3. बाह्य दाग को हटाने के बाद, intracellular धुंधला द्वारा पीछा निर्धारण / permeabilization द्वारा intracellular धुंधला प्रक्रिया आरंभ करें।
        1. दोहराएँ कदम 3.2.6.4.1।
        2. 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला बंद झटका के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। धो कोशिकाओं 200 5 मिनट के लिए 410 XG पर किट और सेंट्रीफ्यूज से μl permeabilization बफर में 1x। 30 मिनट के लिए: एंटी-की-67 एंटीबॉडी (200, 1 माइक्रोग्राम / एमएल 1) के साथ 50 μl permeabilization बफर में सतह पर तैरनेवाला और दाग कोशिकाओं बंद झटका।
        3. 410 XG पर अपकेंद्रित्र के लिए कोशिकाओंआर 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला बंद झटका। धो कोशिकाओं 200 5 मिनट के लिए 410 XG पर किट और सेंट्रीफ्यूज से μl permeabilization बफर में 2x।
        4. सतह पर तैरनेवाला बंद झटका और धोने कोशिकाओं 200 μl पीबीएस में 1x और 5 मिनट के लिए 410 XG पर अपकेंद्रित्र। प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण, लाइव सीडी 4 + TCRβ + कोशिकाओं के रूप में पहले से वर्णित 11 पर gating, तो प्रतिशत की-67 + कोशिकाओं का आकलन करें।
    5. परिधीय सीडी 4+ टी सेल phenotypes का आकलन
      1. 5 मिनट के लिए 410 XG पर एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे प्लेट (नमूना प्रति एक अच्छी तरह से) और सेंट्रीफ्यूज में (कदम 3.3.3 से) कोशिकाओं के 200 μl की जगह और 3.2.5 के रूप में फिर से उत्तेजित।
      2. 4 घंटे के लिए 37 ओ सी में एक मशीन में प्लेट रखें। कदम 3.2.6 और इसके उप-कदम के रूप में ही धुंधला प्रक्रिया को पूरा करें। 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5 में के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण।

4. Immunohistochemistry एकडी मात्रा

  1. ऊतक तैयारी
    1. EAE प्रेरण (अक्सर ~ 30 दिन के बाद किसी भी बिंदु पर चरण 3 और इसके उप-चरणों में इस्तेमाल उन लोगों से एक अलग प्रयोग में EAE चूहों बलिदान, C57BL / 6 चूहों के लिए या के लिए औसत नैदानिक ​​स्कोर में एक चोटी के दौरान इस रोग के जीर्ण चरण के दौरान SJL चूहों) नीचे चरणों का पालन प्रतिक्रियाशील gliosis और माइलिन रहित की सीमा निर्धारित करने के लिए।
    2. 2.5% isoflurane और 97.5% ऑक्सीजन के साथ चूहों anesthetize और संदंश का उपयोग, प्रतिक्रिया की कमी के लिए तलाश चुटकी एक सज्जन पैर की अंगुली के साथ संज्ञाहरण की उचित गहराई की पुष्टि करें। कदम 3.1.3 में वर्णित के रूप transcardiac छिड़काव प्रदर्शन करना। । बाएं वेंट्रिकल में पीबीएस इंजेक्शन लगाने के बाद, पीबीएस चेतावनी में 4% paraformaldehyde के 10 मिलीलीटर इंजेक्षन करने के लिए एक नई सिरिंज का उपयोग करें: Paraformaldehyde एक त्वचा और फेफड़ों अड़चन है, आंखों को गंभीर क्षति हो सकती है, और कैंसर पैदा करने का संदेह है। साँस लेना, घूस से बचें, और त्वचा और आंखों के साथ संपर्क करें। छिड़काव एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। 3.1.6 - कदम 3.1.4 में वर्णित के रूप में दिमाग और कशेरुकी कॉलम निकालें। तार के साथ चिपक जाती है कशेरुकी कॉलम बाँध रीढ़ की हड्डी के सीधे संरेखण सुनिश्चित करने के लिए।
    3. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार पीबीएस में लगभग 50 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde के साथ जानवर की आईडी के साथ लेबल नलियों रात भर बाद ठीक करने के लिए में पीबीएस में 4% paraformaldehyde के बारे में 20 मिलीलीटर के साथ जानवर की आईडी के साथ लेबल जगमगाहट शीशियों, और रीढ़ की हड्डी डोरियों में दिमाग रखो।
    4. दिमाग cryoprotect करने के लिए, 4 1x पीबीएस में 30% sucrose में ओ सी में 1x पीबीएस में 3 बार और दुकान कुल्ला। दिमाग अपने कंटेनरों के बारे में (3 दिन) के नीचे करने के लिए ड्रॉप करने के लिए अनुमति दें।
    5. कशेरुका स्तंभ से कैल्शियम हटाये यह 1x पीबीएस में 3 बार rinsing और एक बड़ी मात्रा में रखकर 1x पीबीएस में 0.5 एम EDTA के (एक माउस रीढ़ की हड्डी के लिए लगभग 50 मिलीलीटर) (पीएच शुरू हो जाएगा ~ 10; पीएच 7.8 ~ 2 के लिए 6 एन एचसीएल) के साथ - 3 सप्ताह तक हड्डी अब कोई कठोर है। कदम 4.1.5 का पालन करके कशेरुका स्तंभ Cryoprotect।
    6. एम्बेड दिमाग औरअक्टूबर में कशेरुकी स्तंभ के रूप में जल्द ही वे अपने कंटेनर के नीचे करने के लिए ड्रॉप के रूप में नीचे उप-चरणों का पालन।
      1. 1x पीबीएस में 1 हिस्सा 30% sucrose और 2 भागों अक्टूबर के एक मिश्रण बनाने के लिए (उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस में 15 मिलीलीटर 30% sucrose से जोड़ने के लिए 30 मिलीलीटर अक्टूबर)।
      2. embedding मोल्ड (22 x 22 x 20 मिमी दिमाग के लिए और 22 x 30 x 20 रीढ़ की हड्डी डोरियों के लिए मिमी) जब तक इसके बारे में आधा भरा हुआ है के लिए OCT / सुक्रोज मिश्रण जोड़ें।
      3. 6 समान रूप से आकार एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर टुकड़ों में कशेरुकी कॉलम में कटौती और एक 22 x 30 x 20 मिमी embedding मोल्ड राज्याभिषेक रीढ़ की हड्डी वर्गों के लिए आगे का सामना करना पड़ में जगह है। पूरे दिमाग 22 x 22 x 20 मिमी आगे का सामना करना पड़ सांचों में रखें।
      4. OCT / सुक्रोज मिश्रण ऊतक को कवर किया और यह 1 घंटे के लिए बैठने के लिए जाने के लिए जोड़ें। इसलिए बुलबुले बच सकते हैं। इस घंटे के दौरान, एक डिश है कि फ्लैश ठंड के लिए नए नए साँचे embedding पकड़ कर सकते हैं करने के लिए 2-methylbutane जोड़ें। सूखी बर्फ पर पकवान प्लेस और पूर्व शांत करने के लिए कवर।
      5. -80 ओ सी में सूखी बर्फ और दुकान पर 2-methylbutane में ढालना फ्लैश फ्रीज एसी के अंदरontainer निर्जलीकरण को रोकने के लिए।
    7. जब तैयार, 16 माइक्रोन cryostat के साथ में खंड ऊतक और electrostatically आरोप लगाया स्लाइड्स पर माउंट। प्रत्येक मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के लिए एक स्लाइड पर हर 10 वें खंड रखो (उदाहरण के लिए, स्लाइड 1 वर्गों 1, 11 के लिए होगा, और 21, और स्लाइड 2 वर्गों 2, 12 होगा, और 22, और इतने पर)। स्टोर -80 ओ सी पर स्लाइड या सही धुंधला के लिए दूर का उपयोग करें।
  2. प्रतिक्रियाशील gliosis और माइलिन लिए धुंधला हो जाना
    1. जब धुंधला के लिए तैयार है, वही (या संभव के रूप में समान) क्षेत्र में हर जानवर के लिए मस्तिष्क और दाग प्रति रीढ़ की हड्डी के लिए एक स्लाइड प्रत्येक चुनें। मस्तिष्क के लिए, महासंयोजिका और cingulum बंडल दिखा स्लाइड चुनें।
    2. जगह 7 मिनट के लिए 70 ओ सी में एक गर्मी ब्लॉक पर ऊतक के साथ स्लाइड। 7 मिनट के बाद गर्मी ब्लॉक बंद और स्लाइड एक और 10 के लिए गर्मी ब्लॉक पर ठंडा होने दें - 15 मिनट। यह धुंधला प्रक्रिया के दौरान स्लाइड गिरने से ऊतक वर्गों रोकने जाएगा।
    3. धो 3 से 5 मिनट के लिए (सतह एंटीजन को निशाना बनाने के लिए एंटीबॉडी) 0.1% nonionic डिटर्जेंट (intracellular एंटीजन के लिए) या 1x पीबीएस के साथ 1x पीबीएस में बार प्रत्येक स्लाइड।
      नोट: चूंकि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी intracellular हैं, nonionic डिटर्जेंट बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जाएगा। स्लाइड्स इस कदम के बाद पूरी तरह से सूखे की अनुमति कभी नहीं।
    4. एक कंटेनर में स्लाइड्स की जगह और साइट्रेट बफर पीएच 3.0 के साथ कवर किया। साइट्रेट बफर बनाने के लिए, पानी में 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा 0.192 छ निर्जल साइट्रिक एसिड जोड़ें। एसिटिक एसिड के साथ पीएच को समायोजित 3.0 पीएच के ऊपर या नीचे NaOH अगर।
    5. 30 मिनट के लिए 37 ओ सी में स्लाइड सेते हैं और 5 मिनट के लिए 0.1% nonionic साबुन के साथ 1x पीबीएस में 3 बार धोएं।
    6. सर्किल एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम के साथ ऊतक के आसपास एक क्षेत्र और एक humidified कक्ष में स्लाइड्स जगह (उदाहरण के लिए, एक स्लाइड गीला कागज तौलिए से युक्त बॉक्स)। ऊतक के लिए बफर अवरुद्ध जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: अवरुद्ध बफर 1x पीबीएस के होते हैंप्लस 0.3% nonionic डिटर्जेंट और उचित सीरम (5%) माध्यमिक एंटीबॉडी, यानी, माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP) और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP), और बकरी सीरम Iba1 के लिए के लिए घोड़े सीरम के मेजबान पर आधारित है।
    7. झाड़ स्लाइड बंद बफर और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने अवरुद्ध (1: 1,000 या oligodendrocytes के लिए 0.2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर बकरी विरोधी माइलिन बुनियादी प्रोटीन, 1: 1000 या 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से 3 माइक्रोग्राम astrocytes के लिए / एमएल माउस विरोधी GFAP, या 1 : 750 या 0.67 माइक्रोग्राम / एमएल खरगोश microglia के लिए विरोधी Iba1) उचित अवरुद्ध बफर में पतला (परिक्रमा क्षेत्र के लिए कदम 4.2.6) देखें। Humidified कक्ष में 4 ओ सी रात भर छोड़ दें।
    8. स्लाइड बंद बफर और स्लाइड के 5 मिनट के लिए 0.1% nonionic साबुन के साथ 1x पीबीएस में 3 बार धोने को रोकने में झाड़ एंटीबॉडी।
    9. माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (1: 200 या 7.5 माइक्रोग्राम / एमएल biotinylated घोड़ा MBP और GFAP, या biotinylated बकरी Iba1 के लिए विरोधी खरगोश के लिए विरोधी माउस) उचित अवरुद्ध बफर में पतला है (देखें काएंपी 4.2.6) परिक्रमा क्षेत्र के लिए और आरटी पर 1 घंटे के लिए humidified कक्ष में सेते करने के लिए स्लाइड छोड़ दें।
    10. स्लाइड बंद बफर और स्लाइड के 5 मिनट के लिए 0.1% nonionic साबुन के साथ 1x पीबीएस में 3 बार धोने को रोकने में झाड़ एंटीबॉडी।
    11. उपयोग करने से पहले immunoperoxidase में avidin बायोटिन-peroxidase जटिल (एबीसी) (सामग्री की सूची देखें) 30 मिनट के तैयार है और एक प्रकार के बरतन पर आंदोलन तक 4.2.12 में की जरूरत है। 0.3% एच 2 ओ 2 अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने के लिए 10 मिनट के लिए परिक्रमा क्षेत्र में मेथनॉल में जोड़ें।
    12. स्लाइड बंद झाड़ समाधान और 1x पीबीएस में 5 मिनट के लिए 0.1% nonionic डिटर्जेंट के साथ 1x पीबीएस या 1x पीबीएस में 2 बार में धो लें, तो 1 बार। 30 मिनट के लिए परिक्रमा क्षेत्र के लिए एबीसी अभिकर्मक जोड़ें।
    13. स्लाइड बंद झाड़ समाधान और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 3 बार धोने, तो 2 5 मिनट के लिए पानी में कई बार। 3,3'-diaminobenzidine (थपका) समाधान करें (देखें माल की सूची) और वर्गों को कवर करने के लिए जोड़ें।
      नोट: यह कदम इष्टतम का पता लगाने के निरीक्षण करने के लिए एक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता हैधुंधला की आयन समय और स्लाइड के लिए समय की एक ही राशि के लिए किया जाना चाहिए तुलना में किया जा सके।
    14. धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए पानी में 3 बार स्लाइड। पानी में 70% इथेनॉल, पानी में 95% इथेनॉल, पानी में 100% इथेनॉल, 50% Xylenes और 50% इथेनॉल, 100% Xylenes: 2 मिनट प्रत्येक के लिए निम्नलिखित समाधान में रखकर ऊतक निर्जलीकरण। एक राल बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड पर एक coverslip सील।
    15. के रूप में पहले 11 में वर्णित प्रतिक्रियाशील gliosis मोबाइल -1 और GFAP खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग आकलन करने के लिए वैकल्पिक रूप से, immunofluorescent धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    16. एक 4X, 0.13 NA उद्देश्य के साथ प्रत्येक रीढ़ की हड्डी खंड (थपका का उपयोग कर संबंधित एंटीबॉडी के साथ दाग) के चित्र लेने और झगड़ा के रूप में छवियों को बचा लो। वैकल्पिक रूप से, महासंयोजिका और बाएं या दाएं मस्तिष्क गोलार्द्ध में cingulum बंडल एक 20X, 0.50 एनए उद्देश्य का उपयोग कर के चित्र लेने और झगड़ा के रूप में छवियों को बचा लो। मस्तिष्क में घाव लोड की एक अधिक व्यापक निर्धारण के लिए, यह दोनों hemispher शामिल करने के लिए भी फायदेमंद हैविश्लेषण में es।
  3. मापने प्रतिक्रियाशील gliosis के लिए मतलब अंश क्षेत्र (Iba1 और GFAP धुंधला)
    1. एनआईएच ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) डाउनलोड और एक कंप्यूटर पर खुला। ImageJ सॉफ्टवेयर पर, मेनू स्ट्रिंग फ़ाइल> ओपन का उपयोग करें और कदम 4.2.16 से एक छवि का चयन करें। एक क्षेत्र मेनू पट्टी पर "बहुभुज चयन" उपकरण का उपयोग ड्रा। रीढ़ की हड्डी डोरियों के लिए, पूरे खंड का पता लगाने; दिमाग, महासंयोजिका और cingulum बंडल के लिए। करने के लिए छवि> टाइप जा रहा है और इस पर क्लिक करके 16-बिट के लिए छवि परिवर्तित "16-बिट।"
    2. डी-शोर प्रक्रिया> पृष्ठभूमि घटाना और सबसे बड़ा उद्देश्य यह है कि पृष्ठभूमि (http पर उपयोगकर्ता गाइड ImageJ को देखने का हिस्सा नहीं है की कम से कम आकार के लिए "रोलिंग गेंद त्रिज्या" स्थापित करने के लिए जा रहा द्वारा छवि: //rsbweb.nih .gov / आई जे / डॉक्स / गाइड / 146-29.html)।
      नोट: मोबाइल -1 धुंधला की एक 4X छवि के लिए हम 4.0 का उपयोग करें और GFAP के लिए हम 50.0 उपयोग करते हैं, लेकिन इन नंबरों छवि बढ़ाई और धुंधला int के आधार पर भिन्न हो सकते हैंensity।
    3. "फिसलने parabloid" जाँच करें और क्लिक करें "ठीक है"। छवि के लिए जाने>> सीमा समायोजित ... और निचले दहलीज स्तर (ऊपर पट्टी) फिसलने सलाखों का उपयोग निर्धारित किया है। शामिल केवल धुंधला हो कि सेलुलर है और छवियों भर में लगातार हो। अंधेरे पृष्ठभूमि (केवल फ्लोरोसेंट धुंधला करने के लिए लागू होता है) के साथ छवियों के लिए, यह सुनिश्चित करें कि "डार्क पृष्ठभूमि" बॉक्स की जाँच की है।
    4. विश्लेषण करने के लिए> सेट माप ... और चुनें "क्षेत्र अंश" जाओ (हित के क्षेत्र के भीतर thresholded क्षेत्र का प्रतिशत देता है)। सुनिश्चित करें कि "सीमा के लिए सीमा" अनियंत्रित है और "प्रदर्शन लेबल" जाँच की है। क्लिक करें "ठीक है" जब पूरा करें।
    5. माप प्राप्त करने के लिए, का विश्लेषण करने के लिए> उपाय जाना। एक "परिणाम" पॉपअप बॉक्स दिखाई देगा और है के रूप में इस डेटा बचाया जा सकता है या नकल एक अन्य कार्यक्रम में। विश्लेषण के लिए, की तुलना उपचार समूहों के बीच "क्षेत्र अंश" मूल्यों।
  4. ऑप्ट द्वारा MBP धुंधला की मात्राराजनैतिक घनत्व
    1. कदम 4.3.1 में वर्णित के रूप में खोलें छवि और ब्याज की एक क्षेत्र आकर्षित। विश्लेषण करने के लिए> सेट माप जाओ ... और चयन (चयन पिक्सेल की संख्या से विभाजित भीतर ग्रे मूल्यों का योग) "ग्रे मूल्य मतलब है"। सुनिश्चित करें कि "सीमा के लिए सीमा" अनियंत्रित है और "प्रदर्शन लेबल" जाँच की है। क्लिक करें "ठीक है" जब पूरा करें।
    2. माप प्राप्त करने के लिए, का विश्लेषण करने के लिए> उपाय जाना। एक "परिणाम" पॉपअप बॉक्स प्रकट निरीक्षण करें। इस डेटा कॉपी और बचाने के लिए है या किसी अन्य कार्यक्रम में कॉपी के रूप में।
    3. विश्लेषण के लिए, कॉपी और एक अन्य कार्यक्रम में मान पेस्ट। ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) सूत्र का उपयोग करने में मतलब ग्रे मूल्य कन्वर्ट: आयुध डिपो = लॉग 10 (255 / ग्रे मूल्य मतलब है)।

Representative Results

यहाँ, हम समझने के लिए एक औषधीय एजेंट द्वारा सीएनएस सुरक्षा प्रदान करता है, तो EAE के दो मॉडलों का इस्तेमाल या तो सीएनएस-घुसपैठ टी कोशिकाओं attenuating या भड़काऊ प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के हमले के दौरान माइलिन और axonal चोट को रोकने। अगर एक चिकित्सीय एजेंट रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ को रोकता है निर्धारित करने के लिए, पुरानी EAE की C57BL / 6 माउस मॉडल जहां प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और रोग विकृति मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी (चित्रा 1 ए) में स्थित है प्रयोग किया जाता है। निर्धारित करने के लिए एक चिकित्सकीय दवा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, पुनरावर्तन-प्रेषण EAE की SJL पशु मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है, जो दोनों मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी (चित्रा 1 बी) में रोग विकृति दर्शाता में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ के दौरान सीएनएस सुरक्षा प्रदान करता है।

नैदानिक ​​आकलन

प्रासंगिक नैदानिक ​​आकलन ठेठ निम्नलिखित ख़ाना (चित्रा 1 के अनुसार किया जातासी) या असामान्य (चित्रा -1) EAE। ठेठ नैदानिक ​​रोग के लिए, 0 के स्कोर कोई असामान्य व्यवहार है। पूंछ के आधार द्वारा उठाया है, पूंछ (अधिक एक हेलीकॉप्टर के रोटर की तरह) जल्दी से बारी बारी से कर सकते हैं और पिछले पैरों के अलावा फैल जाएगा। 1 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक आंशिक रूप से लंगड़ा पूंछ, पूंछ के आधार द्वारा माउस उठाने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जो है। सामान्य हेलिकॉप्टर की तरह घूर्णन या कमजोर किया जा सकता अनुपस्थित, और पूंछ का हिस्सा पूरी तरह से लंगड़ा हो सकता है। पूंछ पक्षाघात की सीमा निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी तरीका है एक उंगली, पूंछ की लंबाई को चलाने के लिए के रूप में एक unparalyzed पूंछ आमतौर पर उंगली के आसपास कर्ल जाएगा, जबकि एक आंशिक रूप से लकवाग्रस्त पूंछ ऐसा करने में असमर्थ हो जाएगा। 2 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक पूरी तरह से रुक पूंछ का प्रतिनिधित्व करता है। जब पूंछ के आधार पर माउस उठा पूंछ की कोई आंदोलन पर सब होता है। 3 के एक नैदानिक ​​स्कोर आंशिक हिंद अंग पक्षाघात का प्रतिनिधित्व करता है। इस स्कोर का निर्धारण है कि माउस एक fla पर स्थानांतरित करने के लिए मुक्त हो की आवश्यकता हैटी सतह। माउस आगे बढ़ता रहता है के रूप में यदि एक हिंद अंग खींच रहा है, या अगर एक या दोनों हिंद अंग आंशिक रूप से लकवाग्रस्त हो दिखाई देते हैं, 3 के स्कोर दी जा सकती है। 4 के एक नैदानिक ​​स्कोर पूरा हिंद अंग पक्षाघात का प्रतिनिधित्व करता है। इस स्कोर के साथ, एक माउस अपने हिंद अंग को स्थानांतरित करने में असमर्थ हो जाएगा और उसके सामने अंगों का उपयोग कर खुद आगे खींचें होगा। 5 का एक नैदानिक ​​स्कोर एक मरणासन्न माउस का प्रतिनिधित्व करता है, या कठिनाई के साथ एक माउस अपने पिंजरे या सांस लेने भर से ही चलती है। एक माउस पिंजरे के नीचे के साथ या अगर अपनी सांस लेने अस्वाभाविक है ही नहीं खींच सकते हैं, तो माउस नम्रता euthanized किया जाना चाहिए। 6 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक माउस अपने पिंजरे में मृत पाया प्रतिनिधित्व करता है। 6 का स्कोर असामान्य है और EAE के अलावा अन्य मृत्यु के कारणों की जांच की जानी चाहिए।

असामान्य नैदानिक ​​रोग हो सकता है या पक्षाघात के साथ नहीं किया जा सकता है। यह दो अलग स्कोरिंग प्रणाली में शामिल करने के लिए आवश्यक हो सकता है अगर एक माउस असामान्य बीमारी के साथ साथ विशिष्ट लक्षण के साथ प्रस्तुत करता है। 0 का स्कोर कोई असामान्य व्यवहार, एक हैठेठ स्कोरिंग प्रणाली के साथ है। जबकि माउस चल रहा है 1 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक मामूली सिर बारी या झुकाव का प्रतिनिधित्व करता है। इस माउस आगे चलने के लिए अनुमति देता है और अपने आंदोलन के लिए एक निरंतर बाईं या दाईं दिशात्मकता देख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। 2 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक और अधिक स्पष्ट सिर बारी और गरीब ठीक क्षमता का प्रतिनिधित्व करता है। 1 के एक असामान्य स्कोर के साथ के रूप में, माउस अपने आंदोलन को दिशात्मकता है और संतुलन के साथ मामूली कठिनाई हो सकती है। 3 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक सीधी रेखा में चलने में असमर्थता का प्रतिनिधित्व करता है। माउस कठिनाई संतुलन होगा और सही खुद को मदद करने के लिए के रूप में यह चलता है पिंजरे के पक्ष का उपयोग कर सकते हैं। 4 के एक नैदानिक ​​स्कोर एक माउस अपने पक्ष पर बिछाने, संतुलन मुद्दों के कारण चलने में असमर्थ प्रतिनिधित्व करता है। माउस से ही पिंजरे के नीचे के साथ खींचें करने में सक्षम हो सकता है लेकिन अपने आंदोलन को दिशात्मकता हो सकता है। जब तक समर्थित 5 का एक नैदानिक ​​स्कोर निरंतर रोलिंग का प्रतिनिधित्व करता है। एक चूहा है कि इस स्कोर तक पहुँच जाता नम्रता euthanized किया जाना चाहिए। एक क्लिनिक6 के अल स्कोर एक माउस अपने पिंजरे में मृत पाया प्रतिनिधित्व करता है। 6 का स्कोर असामान्य है और EAE के अलावा अन्य मृत्यु के कारणों की जांच की जानी चाहिए।

यह स्कोर, उदाहरण के लिए "बीच में" के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक हो सकता है, एक स्कोर 0.5 जोड़ने अगर एक माउस की हालत परिवर्तन थोड़ा या अगर दो स्कोर के बीच का चयन मुश्किल है। उदाहरण के लिए, एक माउस है कि शुरू होता है अपने सामान्य समकक्षों की तुलना में अधिक धीरे धीरे कदम, लेकिन कोई पक्षाघात, या एक माउस है कि इसके पिछले पैर जब पूंछ द्वारा उठाया 0.5 के स्कोर दी जा सकती है अपने पैर बाहर splaying के बजाय अपने सामने के साथ clasps को प्रदर्शित करने के लिए । एक चूहा है कि केवल पिंजरे के नीचे के साथ खुद को खींचें और केवल अपने हिंद अंग चिकोटी समय समय पर या जब छुआ 3.5 के स्कोर दी जा सकती सक्षम है सकते हैं।

इम्यून सेल घुसपैठ में कमी का आकलन

C57BL / 6 माउस मॉडल में EAE (चित्रा 1 ए, दिन 0), प्रतिजन presentati के शामिल होने के बादऔर तिल्ली में टी कोशिकाओं के प्रसार पर दिन पर होते हैं 1 - 5 लगभग प्रारंभिक प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ नैदानिक ​​स्कोर के साथ उपस्थित चूहों के बाद 3 से 5 दिन सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ 7. दिन के आसपास के द्वारा पीछा किया। अगर एक चिकित्सीय एजेंट रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ बाधा डाल रही है का आकलन करने के लिए, दवाओं या वाहन प्रतिजन प्रस्तुति और spleens में प्रसार के बाद 7 दिन पर पेश कर रहे हैं, लेकिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी में घुसपैठ करने के लिए शुरू होने से पहले। प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ तनु की गई है, नैदानिक ​​रोग पाठ्यक्रम बढ़ती 10 से 15 (चित्रा 2) दिनों से बीमारी के चरण के दौरान सुधार नैदानिक ​​स्कोर को प्रदर्शित करना चाहिए।

प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ में कमी भी कम neuroinflammation नतीजा होगा। रिएक्टिव astrocytosis और microgliosis neuroinflammation के लिए प्रमुख पहचान माना जाता है। GFAP और आईबीए-1 के साथ microglia साथ astrocytes लिए धुंधला हो जाना तो चांग का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामतलब क्षेत्र अंश धुंधला में तों neuroinflammation (चित्रा 3) यों की।

यदि प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ कम हो जाता है निर्धारित करने के लिए, रीढ़ की हड्डी डोरियों हटा दिया है और इस बीमारी के शिखर (चित्रा 1 ए, लगभग 18 दिन) में प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहे हैं। यह सुनिश्चित करता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या सबसे अधिक रीढ़ की हड्डी में प्रवेश किया है। सीएनएस में टी कोशिकाओं के प्रवेश की शुरुआत भड़काऊ घटना माना जाता है और दोनों Th1 और Th17 कोशिकाओं EAE के पशु मॉडल के रूप में अच्छी तरह के रूप में एमएस रोगियों में पाए जाते हैं। साथ में ले ली, प्रवाह cytometric विश्लेषण रोगजनक टी कोशिकाओं के दोनों प्रकार के आकलन को शामिल करना चाहिए। इसके अलावा, Tregs अच्छी तरह से विशेषता शमन टी कोशिकाओं है कि इस बीमारी को तर कर रहे हैं। इसलिए, एक कुल सीडी 4 + आबादी से Tregs का प्रतिशत effector टी सेल आबादी के प्रतिशत की तुलना में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह अगर टी सेल घुसपैठ में एक समग्र कमी हो गई है प्रकट होगा या अगर वहाँई सीएनएस में टी सेल phenotypes की एक skewing है। प्रतिनिधि डॉट भूखंडों (चित्रा 4 ए) सीडी 4 + की कुल संख्या में कमी वाहन इलाज चूहों (ऊपरी सही quadrants में नंबर) से रीढ़ की हड्डी डोरियों के साथ तुलना में दवा इलाज चूहों से रीढ़ की हड्डी डोरियों में टी कोशिकाओं घुसपैठ प्रदर्शित करता है। क्रमशः IFN-γ +, आईएल 17 +, और Foxp3 +, और कम किया जाना चाहिए (चित्रा -4 ए): Th1, Th17, और Treg कोशिकाओं निम्न हस्ताक्षर प्रोटीन मूल्यांकन कर रहे हैं मूल्यांकन करने के लिए। सांख्यिकीय विश्लेषण एक महत्वपूर्ण कमी (चित्रा 4 बी) प्रदर्शित करने के लिए पर सीडी 4 +, IFN-γ +, आईएल 17 +, और Foxp3 + सेल नंबर किया जाना चाहिए। आईएल -17 + IFN-γ - - टी सेल सबसेट के एक skewing, IFN-γ + आईएल 17 +, IFN-γ + आईएल 17 के अनुपात के सांख्यिकीय मूल्यांकन शासन से बाहर करने के लिए, और Foxp3 + कोशिकाओं किया जाता है ( फाईGure 4C)।

संभावना है कि टी कोशिकाओं सीएनएस-घुसपैठ में कमी परिधि में प्रसार, सक्रियण, और भेदभाव बाधा का परिणाम है खत्म करने के लिए सक्रिय रूप से टी सेल उपप्रकार के अनुपात के अलावा टी कोशिकाओं proliferating की संख्या का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यदि सक्रियण और भेदभाव अप्रभावित (चित्रा 5 ए) कर रहे हैं सीडी 4+, IFN-γ + के प्रतिशत में कोई परिवर्तन नहीं, आईएल 17 +, या Foxp3 + पाया जाना चाहिए। इसके अलावा, Ki67 + CD4 + कोशिकाओं में कोई बदलाव नहीं आया है, तो प्रसार अप्रभावित (चित्रा 5 ब) है पाया जाना चाहिए। दवा उपचार 7 दिन पर पेश कर रहे हैं या बाद में परिधि में प्रारंभिक प्रतिजन प्रस्तुति और टी सेल सक्रियण फेरबदल से बचने के लिए। हालांकि, आनुवंशिक मॉडल में प्रोटीन अक्सर अनिवार्यता से embryogenesis दौरान नष्ट कर दिया या splenocyte asse बनाने EAE के शामिल होने से पहले प्रेरित कर रहे हैंउच्च महत्व के ssment।

सीएनएस संरक्षण का आकलन

एक विशेष चिकित्सीय एजेंट प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के बाद सीएनएस में रोग विकृति modulates यदि प्रदर्शित करने के लिए, दवा हस्तक्षेपों नैदानिक ​​रोग स्कोरिंग में पहली बार चोटी के दौरान प्रशासित किया जाना चाहिए। EAE की SJL मॉडल के बाद से इन चूहों एक पुनरावर्तन-प्रेषण phenotype दिखा रहे इन प्रयोगों के लिए फायदेमंद है। एक दवा उपचार माइलिन-अक्षतंतु अध: पतन रोकता है, तो नैदानिक ​​स्कोर में सुधार (चित्रा 6) मनाया जाएगा। माइलिन का रोग आकलन माइलिन नुकसान सुधार नैदानिक ​​स्कोर के साथ सुसंगत में कमी की पुष्टि करनी चाहिए। मात्रात्मक माइलिन अखंडता, माइलिन बुनियादी प्रोटीन की थपका धुंधला मूल्यांकन करने के लिए (MBP), (चित्रा 7) इस धुंधला के लिए ऑप्टिकल घनत्व के सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा पीछा किया जाता है। आगे कहा कि neuroinflammation को पुष्ट करने के लिए निरंतर या therape की कमी हुई हैutic हस्तक्षेप, प्रतिक्रियाशील gliosis प्रतिक्रियाशील gliosis (चित्रा 3) के रूप में ऊपर वर्णित के लिए मतलब अंश क्षेत्र को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। पुष्टि करने के लिए कि एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप सीधे इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव के बिना सीएनएस रक्षा कर रहा है, spleens में सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और प्रसार के क्षीणन रियायती किया जाना चाहिए। यह पता करने के लिए, मस्तिष्क और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और परिधीय टी सेल प्रसार और सक्रियण के आकलन की रीढ़ की हड्डी के आकलन के लिए ऊपर वर्णित विधि के रूप में किया जाना चाहिए (आंकड़े 4 और 5)। साथ में ले ली, चिकित्सीय एजेंट है कि टी कोशिकाओं या परिधि में टी कोशिकाओं के प्रसार को सीएनएस-घुसपैठ में कमी का कोई सबूत के साथ सीएनएस में सेल चोट ब्लॉक सीएनएस-सुरक्षात्मक उपचार कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रतिनिधि resuC57BL / 6 और SJL चूहे में EAE से नैदानिक ​​स्कोर एलटीएस। (ए) नैदानिक ​​स्कोर C57BL की (± SEM मतलब है) / 6 चूहों (एन = 10) MOG 35-55 के साथ प्रेरित पुरानी बीमारी के साथ EAE उत्पादन करने के लिए। (बी) के नैदानिक ​​स्कोर SJL चूहों (एन = 3) पीएलपी 139-151 के साथ प्रेरित पुनरावर्तन-प्रेषित करने की बीमारी के साथ EAE उत्पादन करने के लिए (SEM ± मतलब है)। (सी) नैदानिक ​​स्कोरिंग EAE चूहों में ठेठ रोग प्रगति को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल ख़ाना। (डी) नैदानिक ​​स्कोरिंग EAE चूहों में असामान्य रोग प्रगति को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल ख़ाना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 2. औषधीय उपचार EAE साथ C57BL / 6 चूहों में पूर्व प्रतिरक्षा करने के लिए सेल घुसपैठ। 35-55 के साथ दिन 7 postimmunization से एसएएस (एन = 19) पीबीएस के साथ इलाज (एन = 20) या। डेटा तीन जमा स्वतंत्र प्रयोगों से कर रहे हैं। सांख्यिकीय अंतर है, * पी <0.05 एक nonparametric दो पूंछ मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग निर्धारित किया गया था। से (11) की अनुमति के साथ फिर से प्रिंट।

आकृति 1
चित्रा 3. Immunofluorescent धुंधला और नियंत्रण, EAE की रीढ़ की हड्डी डोरियों में प्रतिक्रियाशील gliosis की मात्रा, और इलाज C57BL / 6 चूहों। (ए) के नियंत्रण से रीढ़ की हड्डी डोरियों में GFAP (astrocytes) और आईबीए-1 (microglia) के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग (unimmunized ) चूहों (बाएं पैनल) और EAE चूहों पीबीएस (मध्य पैनल) या एसएएस (सही पैनल) के साथ इलाज किया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। धुंधला की मात्रा प्रतिशत immunop को मापने के लिए क्षेत्र अंश तकनीक का उपयोग कर निर्धारित किया गया थाGFAP (बी) और आईबीए-1 (सी) के लिए ositive क्षेत्र। मतलब ± SEM, एन = 3 नियंत्रण, एन = 3 एसएएस का इलाज, या एन = 4 पीबीएस इलाज चूहों, माउस प्रति 6 वर्गों। सांख्यिकीय मतभेद है, एक तरह से एनोवा का उपयोग कर निर्धारित किया गया है * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001। फिर से प्रिंट (11) से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4. FACS EAE C57BL / 6 माउस रीढ़ की हड्डी डोरियों के विश्लेषण से इलाज चूहों में टी सेल घुसपैठ में कमी का प्रदर्शन है। C57BL / 6 चूहों, एसएएस या पीबीएस के साथ इलाज किया गया शुरुआत EAE के 7 डी postinduction। (IFN-γ और Th17 - रीढ़ की हड्डी डोरियों Th1 (IFN-γ + / आईएल 17) दिखाने दिन 15. (ए) प्रतिनिधि डॉट भूखंडों पर प्राप्त किया गया- / आईएल 17 +) CD4 + गेट (ऊपरी पैनल) और टी नियामक कोशिकाओं (Foxp3 +) (कम पैनल) में कोशिकाओं। डॉट भूखंडों ऊपरी सही चक्र में प्रतिशत दिखा। (बी) CD4 + कोशिकाओं की पूर्ण संख्या के साथ ही IFN-γ +, आईएल 17A +, और Foxp3 + कोशिकाओं को सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया। (सी) SAS- और पीबीएस इलाज EAE चूहों के बीच टी सेल आबादी के प्रतिशत में परिवर्तन भी जांच की गई थी। ± SEM मतलब है, एन = पीबीएस में इलाज के लिए 10, और n = 9 एसएएस दो स्वतंत्र प्रयोगों से इलाज के लिए। दो पूंछ टी परीक्षण सभी बार रेखांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था। ** पी <0.01। फिर से प्रिंट (11) से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5. एफएसीEAE C57BL / 6 माउस Spleens का विश्लेषण और इलाज चूहे में समतुल्य टी सेल की अभिव्यक्ति प्रोफाइल और प्रसार का प्रदर्शन है। PBS- और एसएएस इलाज चूहों से Spleens विश्लेषण किया गया EAE के 15 घ postinduction। (ए) सीडी 4+ टी कोशिकाओं का प्रतिशत, Th1 (IFN-γ + / आईएल -17 -), Th17 (IFN-γ - / आईएल 17 +), और टी नियामक कोशिकाओं (Foxp3 +) PBS- से spleens में इलाज (एन = 10) और दो स्वतंत्र प्रयोगों से एसएएस का इलाज (एन = 9) चूहों। (बी, बाएं पैनल) अनुभवहीन spleens से सीडी 4 + जनसंख्या में Ki-67 + कोशिकाओं का प्रतिशत (एन = 4) के रूप में अच्छी तरह से PBS- (एन = 5) और एसएएस इलाज चूहों (एन = 5) के साथ प्रेरित EAE। एक एक तरह से एनोवा परीक्षण की-67 + या तो PBS- या एसएएस इलाज EAE spleens के साथ तुलना में भोली spleens से कोशिकाओं के अनुपात के बीच सांख्यिकीय महत्व का प्रदर्शन किया। कोई महत्व PBS- और एसएएस इलाज EAE spleens के बीच मनाया गया। (बी, सही पैनल) प्रतिनिधि डॉट भूखंडों; संख्या प्रसार के अनुपात में संकेत मिलता है। डॉट भूखंडों प्रतिशत दिखा। बार रेखांकन दो पूंछ टी परीक्षण का प्रतिनिधित्व करते हैं, *** पी <0.001। फिर से प्रिंट (11) से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6 औषधीय उपचार के बाद EAE साथ SJL चूहों में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ। क्लिनिकल स्कोर (मतलब ± SEM) पीबीएस के साथ इलाज किया SJL चूहों के (एन = 8) या एसएएस (एन = 8) दिन 24 postimmunization (धराशायी लाइन) पीएलपी के साथ से 139-151। डेटा मतलब नैदानिक ​​स्कोर के ± SEM हैं। सांख्यिकीय अंतर है, *** पी <0.001 एक nonparametric दो पूंछ मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग निर्धारित किया गया था। शीर्ष पंक्ति सांख्यिकीय लिए इस्तेमाल किया मूल्यों का प्रतिनिधित्वविश्लेषण। से (11) की अनुमति के साथ फिर से प्रिंट।

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चित्रा 7. MBP धुंधला की मात्रा ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग कर। (ए) एक अनिर्दिष्ट आनुवंशिक पीटकर माउस littermate नियंत्रण C57BL / 6 माउस EAE के साथ प्रेरित की तुलना से वक्ष रीढ़ की हड्डी में MBP के प्रतिनिधि धुंधला हो जाना। ब्रैकेट कम हो MBP धुंधला का संकेत माइलिन रहित के प्रतिनिधि क्षेत्र इंगित करता है। (बी) MBP एक अनिर्दिष्ट आनुवंशिक पीटकर C57BL / 6 माउस से वक्ष रीढ़ की हड्डी के धुंधला हो जाना। (सी) अनिर्दिष्ट आनुवंशिक पीटा चूहों EAE के साथ प्रेरित (KO, n = 6 चूहों, 2 - 4 काठ और पशुओं के प्रति वक्ष वर्गों) wildtype (डब्ल्यूटी से रीढ़ की हड्डी में MBP धुंधला की एक उच्च ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) दिखा रहे हैं, n = 3 चूहे, 2 - 4 काठ और पशुओं के प्रति वक्ष वर्गों) EAE के साथ प्रेरित चूहों। सांख्यिकीय विश्लेषण यूएसआईएक दो पूंछ टी परीक्षण एनजी, * पी <0.05। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन।

Discussion

एमएस के साथ मरीजों को रोग relapses अनुभव करने के लिए है, जबकि दवाओं है कि सीएनएस में टी सेल सक्रियण और / या घुसपैठ attenuate लेने के उपचार के विकल्प है कि सीधे सीएनएस की रक्षा के विकास warranting जारी है। EAE प्रतिष्ठित एमएस के लक्षण मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और जब विवो में प्रतिरक्षा प्रणाली और सीएनएस के बीच बातचीत की प्रकृति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। परिधि में सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और प्रसार और सक्रियण की जांच के साथ संयोजन के रूप में, EAE में इलाज के विचार, जैसे, के समय का उपयोग करने से पहले या रोग की दीक्षा के बाद, यह दोनों प्रतिरक्षा प्रणाली और पर उपचार के प्रभाव को चित्रित करने के लिए संभव है सीएनएस।

C57BL / 6 माउस में EAE अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, वहीं SJL माउस में EAE एमएस मामलों के बहुमत के अधिक प्रतिनिधि हो सकता है, के रूप में इन चूहों पैरेन्काइमा में एक पुनरावर्तन-प्रेषण phenotype और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ हैमस्तिष्क में 10। SJL चूहों के रूप में अच्छी तरह से, यह संभव उपचार शुरू करने के बाद रोग प्रस्तुत किया गया है बना रही है लेकिन कम सूजन के समय के दौरान छूट के दौरान स्पष्ट वसूली की है। यह विचार करना है कि SJL चूहों हमेशा पलटा नहीं है और synchrony में परिहार, संभावित बड़े परिवर्तनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप जब परिणाम जमा कर रहे हैं महत्वपूर्ण है। इसलिए, कुछ शोधकर्ताओं ने एक जानवर से नैदानिक ​​स्कोर के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाने के लिए है, जबकि रोग प्रगति में व्यक्तिगत अंक पर FACS विश्लेषण और ऊतक विज्ञान के लिए चूहों लेने के विकल्प चुन सकते हैं।

ध्यान में रखते हुए जब जोड़तोड़ EAE चूहों के लिए किया जाता है कि कैसे एक उपचार के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित करता है या सीएनएस के निर्धारण में सहायता कर सकते हैं। वहाँ जब इलाज शुरू होता है के लिए कई विकल्प हैं, चाहे प्रतिरक्षा कोशिकाओं सीएनएस में प्रवेश किया है के लिए अपने स्वयं के अर्थ और कैसे वे के साथ प्रत्येक सीएनएस के साथ बातचीत की जा सकती है। लक्षणों की शुरुआत से पहले इलाज का तात्पर्य है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं अभी तक दर्ज या सीएनएस के लिए नुकसान का कारण नहीं है।लक्षणों की शुरुआत के बाद उपचार का तात्पर्य है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं सीएनएस में प्रवेश किया है और कुछ नुकसान का कारण है। SJL चूहों का उपयोग करना, इलाज भी एक पलटा, जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय रूप से घुसपैठ कर रहे हैं और सूजन के कारण, या छूट, जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं को कम सूजन के साथ सीएनएस में कम प्रचलित हो सकता है के दौरान के दौरान शुरू कर सकते हैं। कैसे उपचार सीएनएस और प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावित के बारे में प्रारंभिक परिकल्पना जब विचार जहां प्रतिरक्षा कोशिकाओं के इलाज के दौरान रोग प्रक्रिया में हैं बनाया जा सकता है।

तरीके जिसमें उपचार प्रतिरक्षा कोशिकाओं और सीएनएस, EAE लक्षणों की गंभीरता को कम करने के अंतिम परिणाम के साथ प्रत्येक को प्रभावित कर सकते हैं की एक संख्या हैं। इसलिए, यह प्रवाह cytometric विश्लेषण और immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए, कैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं परिधि और सीएनएस में प्रभावित कर रहे हैं को देखने के लिए कि क्या प्रतिरक्षा कोशिकाओं सीएनएस में प्रवेश किया है आवश्यक है, और कैसे सीएनएस उपचार के लिए प्रतिक्रिया करते हैं। रीढ़ की हड्डी के प्रवाह cytometric विश्लेषण निर्धारित कर सकते हैं जबकि कितने कोशिकाओं हाएक निश्चित समय पर सीएनएस में प्रवेश किया है, एक निर्धारित नहीं कर सकता है कि इस प्रभाव को कम प्रतिरक्षा सेल की तस्करी की वजह से है, जब तक कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रसार को तिल्ली में अप्रभावित है। इसलिए यह दोनों परिधीय और सीएनएस ऊतक विश्लेषण और निर्धारित क्या मतलब mechanistically परिणाम जब दोनों ऊतकों तुलना कर रहे हैं के लिए आवश्यक है। यह भी संभव है के लिए प्रतिरक्षा सेल गतिविधि प्रोफाइल एक नियामक टी सेल की भारी प्रोफ़ाइल के लिए एक रोगजनक सहायक टी सेल भारी प्रोफ़ाइल में एक स्विच होने, उपचार से बदल सकता है, उदाहरण के लिए। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए मार्कर को देखते हुए और और इलाज जानवरों के बीच प्रतिशत अभिव्यक्ति की तुलना इसलिए भी एक महत्वपूर्ण विचार है। एमएस अनुसंधान में एक उभरती हुई अवधारणा पता चलता है कि बी कोशिकाओं स्व-प्रतिरक्षित माइलिन रहित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह दिखा रहा है कि बी कोशिकाओं टी कोशिकाओं 20 के पुनर्सक्रियन के लिए आवश्यक हैं के अध्ययन पर आधारित है। यह अवधारणा इस तरह के rituximab, CD20 पूर्व के खिलाफ एक एंटीबॉडी के रूप में उपचार की सफलता के द्वारा समर्थित हैबी कोशिकाओं 21,22 की सतह पर दबा दिया। क्लिनिकल परीक्षण में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ocrelizumab की सफलता से प्रदर्शन के रूप में, CD20 के विभिन्न epitopes को लक्षित दवाओं बी सेल-लक्षित चिकित्सा विज्ञान 23 की प्रभावकारिता में सुधार हो सकता।

यहाँ प्रस्तुत तकनीकों में से एक सीमा है कि यह संभव है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं सीएनएस में प्रवेश लेकिन पैरेन्काइमा में यात्रा करने में असमर्थ होने के लिए है। Immunohistochemistry प्रतिरक्षा कोशिकाओं के perivascular cuffing का पता लगाने और इलाज और इलाज जानवरों के बीच पैरेन्काइमा में यात्रा की दूरी का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक अन्य संभावित सीमा EAE रोगजनन पर Microbiome का प्रभाव शामिल है। खानेवाला पेट microbiota भारी रोग रोगजनन 24 प्रभावित कर सकते हैं; इसलिए, चूहों विभिन्न कालोनियों में रखे और अलग पिंजरों में भी रोग की गंभीरता में विशाल अंतर हो सकता है। तदनुसार, यह हमेशा बेहतर है जहां संभव हो के लिए एक ही पिंजरे में उठाया littermate नियंत्रण का उपयोग करने के लिएEAE शामिल प्रयोगों। एक अंतिम ध्यान दें कि अगर यह प्रयोगात्मक परिधि में प्रतिरक्षा सेल proliferative परिवर्तन के प्रभाव को खत्म करने के लिए वांछनीय है, यह सक्रिय इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रेरण निष्क्रिय हस्तांतरण प्रेरण के बजाय का उपयोग कर ऐसा करने के लिए संभव हो सकता है।

Neuroprotection के लिए आगे की पुष्टि कोशिका मृत्यु का या जो चुनिंदा एक प्रकार की कोशिका पर प्रोटीन का विलोपन के लिए अनुमति देता है सशर्त पीटा चूहों के उपयोग के माध्यम से विशिष्ट तंत्र का परीक्षण करने के लिए एक प्रणाली सह संस्कृति 11 का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। इसके अलावा, औषधीय एजेंटों कि न्यूरोप्रोटेक्टिव हैं के अन्वेषण का विस्तार करने, axonal transection और neuronal मौत का मार्करों शामिल किया जाना चाहिए। महत्व का एक अन्य क्षेत्र remyelination है। घायल एक्सोन आगे का समर्थन है कि न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचारों remyelination उपचारों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा होना चाहिए उधार remyelinate करने में असमर्थ हैं। इसके अतिरिक्त, बिना मेलिनकृत एक्सोन myelina से चोट की चपेट में हैंटेड एक्सोन। यह एक अक्षतंतु demyelinated उपचारात्मक उपायों कि समय पर remyelination axonal चोट कर पाएगा को बढ़ावा हो जाता है जब कि पता चलता है। इन रास्ते तलाशने के लिए, माइलिन रहित और remyelination के लिए अन्य विवो मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, cuprizone और lysolecithin)। इस के साथ साथ वर्णित विधि माइलिन नुकसान बढ़ाता द्वारा neuroprotection का आकलन करने पर जोर दिया। remyelination के मूल्यांकन के पूर्वज कोशिकाओं की संख्या के साथ ही उनके पैदा करना और परिपक्व भी जांच करने के लिए महत्वपूर्ण होगा करने की क्षमता के लिए। इन वैकल्पिक मॉडल के उल्लेख के साथ, एक भी इन्सेफेलाइटिस के विभिन्न मॉडलों कि virally मध्यस्थता कर रहे हैं पर विचार करना चाहिए। वहाँ दो अच्छी तरह से विशेषता आरएनए वायरल मॉडल है कि माइलिन घटाने का उत्पादन कर रहे हैं: एक Theiler के murine encephalomyelitis, एक गैर छा Picornaviridae वायरस है, और अन्य माउस हेपेटाइटिस वायरस, वायरस Coronaviridae परिवार 25,26 के एक सदस्य है।

EAE अनुसूचित जनजाति के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैकैसे जोड़तोड़ या उपचार प्रतिरक्षा प्रणाली और इन विवो में सीएनएस को प्रभावित udies। यहां वर्णित प्रोटोकॉल निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं जहां उपचार रोग की प्रक्रिया को प्रभावित कर रहे हैं, चाहे वह परिधि में होना, रक्त मस्तिष्क बाधा पर, या सीएनएस में। एमएस के लिए कोई मौजूदा उपचार रोग और रोगियों को अक्सर समय के साथ अनुभव गिरावट का इलाज। इसी तरह, अन्य सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और माइलिन की गिरावट तीव्र फैलाया encephalomyelitis, अनुप्रस्थ मेरुरज्जुशोथ, और neuromyelitis ऑप्टिकल, कमी उपचार है कि सीएनएस की रक्षा के रूप में यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं घुसपैठ द्वारा हमले के तहत सीधे सहित, शामिल रोगों। ध्यान में उपचार के समय ले रहा है और सीएनएस के immunohistochemistry के साथ संयोजन के रूप में तिल्ली के प्रवाह cytometric विश्लेषण और रीढ़ की हड्डी का उपयोग कर सूजन और नुकसान का आकलन करने के लिए यंत्रवत निर्धारण के लिए अनुमति देगा उपचार के बारे में किए जाने के लिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

जनरल बंदोबस्ती कोष, राष्ट्रीय - इस काम NINDS P30-NS069324, राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस SocietyRG 4587-A-1, Civitan इंटरनेशनल रिसर्च फाउंडेशन, माइक एल Jezdimir अनुप्रस्थ सुषुंना की सूजन फाउंडेशन, अलबामा स्वास्थ्य सेवा फाउंडेशन के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया विज्ञान फाउंडेशन 1355183, और T32 AI007051 नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9719245
22 x 30 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9531194
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific  21985-023
2-Methylbutane Fisher Scientific O3551-4
30 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific 18-30
ACK Lysing Buffer Quality Biological 118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7 BD Biosciences 552775 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Foxp3-FITC eBioscience 11-5773-82 0.5 mg/ml stock concentration
anti-GFAP (Cocktail) Biolegend 835301 1 - 3 mg/ml stock concentration
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg) Wako 019-19741 0.5 mg/ml stock concentration
anti-IFN-γ APC eBioscience 17-7311-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-7177-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Ki-67 PE eBioscience 12-5698-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-MBP (D-18) Santa Cruz Biotechnology sc-13912 0.2 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ FITC eBioscience 11-5961-85 0.5 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ PE eBioscience 12-5961-83 0.2 mg/ml stock concentration
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Vector Labs BA-1000 1.5 mg/ml stock concentration
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG Vector Labs BA-2000  1.5 mg/ml stock concentration
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% Fisher Scientific AC42356-5000
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% Fisher Scientific AC446085000
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 Fisher Scientific 12-550-15
Golgi Plug BD Biosciences 555029 protein transport inhibitor
Immedge Hydrophobic Barrier Pen Fisher Scientific NC9545623
Ionomycin EMD Millipore 407952-5mg
L-Glutamine, 100x Corning 25-005-Cl
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-Cl
Near IR Live/Dead Staining Kit Life Technologies L10119 viability dye
Normal goat serum Vector Labs S-1000
Normal horse serum Vector Labs S-2000
Paraformaldehyde, 96% Fisher Scientific AC416785000
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 density gradient
Permount Fisher Scientific SP15-500 resinous mounting medium
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1mg
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody BioLegend 808401
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
Sodium Pyruvate Corning 25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 nonionic detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) Fisher Scientific NC9206402 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase 
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) Fisher Scientific NC9276270 DAB solution

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 115 neuroprotection केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के संरक्षण स्व-प्रतिरक्षित माइलिन रहित प्रयोगात्मक autoimmune encephalomyelitis टी सेल oligodendrocyte माइलिन एकाधिक काठिन्य
निर्धारण ऑटोइम्यून माइलिन रहित में औषधीय हस्तक्षेप के लिए सीएनएस संरक्षण बनाम प्रतिरक्षा प्रणाली दमन
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Evonuk, K. S., Moseley, C. E.,… More

Evonuk, K. S., Moseley, C. E., Doyle, R. E., Weaver, C. T., DeSilva, T. M. Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination. J. Vis. Exp. (115), e54348, doi:10.3791/54348 (2016).

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