Introduction
Multipel sklerose (MS) er kendetegnet ved inflammatoriske læsioner, overvejende hvid substans regioner af hjernen tidligt i sygdommen. Efter langvarig progression, er grå substans atrofi påvises ved MRI-billeddannelse og markerer den neurodegenerative fase af sygdommen. Reaktiv gliose, demyelinisering og axonal skade i den hvide substans tilskrives CNS-infiltrerer immunceller. Ingen af de behandlinger øjeblikket anvendes i MS omvendt eller direkte forhindre neurodegeneration i CNS - stedet, de reducerer inflammation ved at dæmpe T-celle-aktivering og / eller infiltration i CNS. Fordi der er ingen helbredelse for MS og patienter ved hjælp af nuværende behandlinger fortsat oplever sygdomsprogression, opdagelser af lægemidler, der forhindrer demyelinisering og neuronal tab er kritisk vigtigt. Skelne mellem virkningerne på immunceller og dem på CNS, kan imidlertid være vanskelig eksperimentelt, som resultatet - dvs. reduceret skade på CNS - ser de same uanset de mekanismer, hvorigennem den forekommer. Derfor skal vurderingen af CNS beskyttelse skal samarbejde med vurderinger af CNS-infiltrerende immunceller og proliferation af immunceller i periferien at bestemme, hvordan farmakologiske agenter påvirker sygdomsmekanismer.
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en veletableret dyremodel for autoimmune inflammatoriske lidelser, der var direkte ansvarlig for opdagelsen af midler, der anvendes til behandling af MS 1-4. Mus anvendes ofte til EAE, med C57BL / 6-mus er en populær stamme baseret på tilgængeligheden af genetiske varianter. C57BL / 6-mus induceret med EAE udviser kronisk sygdomsprogression med start omkring dag 10 efter induktion. Infiltration af rygmarven parenkym og cerebellum er karakteristiske for histopatologi af disse dyr, med fravær af infiltration i det kortikale parenkym 5. Derudover kortikale læsioner og demyelinisering ibregn er kendetegnende for sygdommen 6-9, som er relativt fraværende i C57BL / 6-mus. Derfor kan det være at foretrække, når muligt at bruge SJL-mus, som har recidiverende-remitterende sygdom og læsioner findes i både hjernen og rygmarven, der vises de samme som i MS 10.
Behandlingen kan ikke klassificeres som nervebeskyttende hvis immunceller aldrig nå CNS. Derfor er denne protokol anvender flowcytometrisk analyse af hjerne, rygmarv, og milte fra EAE-mus for at bestemme virkninger af behandling på immuncelle infiltration i CNS og proliferation af immunceller i periferien, som tidligere demonstreret 11. Immunohistokemiske analyser af CNS-væv for at bestemme omfanget og arten af neurobeskyttelse er også beskrevet. Kombinere disse metoder muliggør bestemmelse af, hvorvidt immunceller blev aktiveret og prolifererede i periferien, hvorvidt immunceller indtastet CNS, og hvorvidt CNS var protected fra betændelse eller skader. Hvis der er mistanke neurobeskyttende virkninger trods virkninger på immunsystemet, kan eksperimentatorer ændre behandlingen starte tidspunkter efter immuncelle infiltration i CNS er opstået.
Her præsenterer vi en protokol ved hjælp af to forskellige modeller for aktiv EAE, en T-celle-medieret dyremodel af MS, og flowcytometri analyse kombineret med immunhistokemi på forskellige tidspunkter i løbet af sygdommen at fastlægge effekten af eksperimentelle behandlinger på forskellige aspekter af MS patogenese. Denne metode vil hjælpe forskere med at skelne mellem effekter på immunforsvaret celledeling og infiltration versus CNS beskyttelse, gør det lettere at indsnævre hvordan lægemidler virker på sygdommen patogenese.
Protocol
Eksperimentelle procedurer, der involverer mus skal overholde relevante institutionelle og statslige regler. For nærværende undersøgelse blev mus opstaldet og behandles i overensstemmelse med National Institutes of Health og University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer.
1. EAE induktion og Scoring
- Inducere EAE i C57BL / 6-mus 11-13 eller SJL-mus 10,11 som tidligere beskrevet 13.
BEMÆRK: Eksperimentatorer bør vælge en model ideel til spørgsmål deres forskning (se diskussionen for yderligere detaljer). - Optag scores dagligt som tidligere beskrevet 11 for hver mus begynder på dag 7 efter induktion. Undersøg gennemsnitlige daglige scores over tid mellem behandlingsgrupper.
2. Behandling
- Treat EAE-mus før sygdommens indtræden at bestemme, om behandling påvirker immun celleinfiltration eller proliferation.
- Vælg en behandling, migThOD levering, og hyppigheden af behandling, mens overvejer lægemidlets blod-hjerne-barrieren permeabilitet, halveringstid, og dosering.
BEMÆRK: EAE øger blod-hjerne-barriere-permeabilitet og kan tillade stoffer at nå CNS som ellers ikke ville være i stand raske dyr. Udførelse af forsøgene for dosisresponskurver ser på EAE kliniske scoringer kan hjælpe med at vælge en passende dosis af lægemiddel. kontrol af køretøjer bør udføres parallelt med medicinsk behandling. Alternativt kan betingede knockout-mus anvendes med samme kuld som kontroller. - Brug SJL eller C57BL / 6-mus til dette eksperiment. Behandle mus tidligt efter EAE-induktion (dag 7), før indtræden af symptomer ved hjælp af den valgte metode ved levering.
- Sacrifice og dissekere mus ved toppen af sygdom (ca. dag 15), som i trin 3.1 og dens undergrupper trin, baseret på den højeste kliniske score gennemsnit over tid.
- Adfærd flowcytometri på muse rygmarv (som i trin 3.2) til bestemmelse immuncellepopulationer infiltratipå i CNS, og på milte (som i trin 3.3) til bestemmelse af immuncelleproliferation i periferien. På separate mus, at adfærd immunhistokemi (som i trin 4) kvantificere astrocytter og mikroglia, og bevarelse af myelin.
- Vælg en behandling, migThOD levering, og hyppigheden af behandling, mens overvejer lægemidlets blod-hjerne-barrieren permeabilitet, halveringstid, og dosering.
- Treat EAE-mus efter sygdommens indtræden at bestemme, om behandlingen beskytter CNS efter immun celle infiltration har fundet sted.
- Gentag trin 2.1.1.
- Brug SJL mus i dette forsøg, da disse mus har målbar sygdom remissioner. Behandle mus under den første top i sygdom (eller om ønsket, på toppen af et efterfølgende tilbagefald) som målt ved gennemsnitlige kliniske scorer.
- Sacrifice mus på et ønsket tidspunkt efter EAE-induktion. Fordi infiltration allerede har fundet sted, kan det ikke være nyttigt at måle infiltration ved FACS-analyse. Imidlertid tage rygmarv at kvantificere reaktiv gliose og myelin at afgøre, om der er CNS beskyttelse trods immun celleinfiltration.
3. flowcytometrianalyse
- dissektion
- Label tre 15 ml koniske rør (én for hjernen, en for rygmarv, og en for milt) pr dyr med dyrets ID og typen af væv indeholdt. Hold alle væv i separate rør til hele proceduren på is.
- For FACS analyse af milte, ofrer mus ved toppen af sygdom (~ dag 15 post-EAE-induktion) anvendelse af carbondioxid med en strømningshastighed på omkring 15% container volumen per minut til 2 - 3 min. Bekræft dødshjælp ved manglende respiration. Efter aflivning af hver mus, fjerne milten 14 og anbringes i et individ, mærket 15 ml konisk rør (fra trin 3.1.1) indeholdende iskold RPMI suppleret med 2% FCS, 100 IU penicillin og 100 ug / ml streptomycin ( benævnt "medier" i hele protokol).
- For FACS-analyse af hjerne og rygmarv, udføre hjerteperfusion ved at skære musens højre atrium med kirurgiske sakse at frigive circulating blod og piercing af venstre ventrikel med en nål forbundet til en sprøjte fyldt med 10 ml iskold PBS. Injicer langsomt 10 ml PBS.
- Afbrød musens hoved og gøre en opskæres midterlinjen af hovedbunden med kirurgiske sakse. Peel huden tilbage med hånden eller med pincet og gøre en opskæres midterlinjen af kraniet med kirurgiske sakse, ved hjælp af indgangspunktet af rygmarven som et udgangspunkt plet.
- Skræl væk kraniet med mikro pincet og bruge en scoop at befri hjernen. Placer hjerner i mærket 15 ml koniske rør (fra trin 3.1.1) indeholdende medier.
- Fjern musens hud med pincet og kirurgiske sakse, og eviscerate musen med kirurgiske sakse. Skær lemmer, hale, ribben, og enhver omgivende muskel med kirurgiske saks for at befri rygsøjlen.
- Skær rygsøjlen i omkring 5 nogenlunde lige store stykker med kirurgiske sakse og presse den ene ende af et stykke med en hæmostat, og derefter bruge en anden hæmostat to fortsætte klemme, bevæger sig langs stykket indtil rygmarven klemmer ud af toppen. Gentag dette for hvert stykke af rygsøjlen og placere ledninger i individuelle, mærket 15 ml koniske rør (fra trin 3.1.1) indeholdende medier.
- Vurdering af immuncelle infiltration i hjerne og rygmarv
- Skær hjerner og rygmarv i mindre stykker med steril saks. Crush med stemplet fra en 3 ml sprøjte over en 70 um cellefilter i et nyt 50 ml rør under skylningen sien med medierne. Bringe hvert rør til et 50 ml volumen med medier. Centrifuger ved 453 xg i 5 minutter for at pelletere celler.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 4 ml 40% tæthed gradient medier. overlay omhyggeligt densitetsgradienten 40% holdige celler oven på 2 ml 70% densitetsgradient i en ny 15 ml konisk rør-pipette meget langsomt på væggen af det koniske rør for at sikre korrekt lagdeling af gradienten. Spin på 796 xg i 20 minutter ved stuetemperatur meden bremse.
- Fjern forsigtigt det øverste myelin lag fra gradient med en 1 ml overførsel pipette, derefter fjerne levedygtige celler i grænsefladen med en 1 ml overførsel pipette og overføres til en ny 15 ml konisk rør. Bringe røret til 15 ml med medium og centrifugeres ved 448 xg i 10 min.
- Resuspender pellet i 200 pi medier og anbringes i en brønd i en 96-brønds rundbundet plade (hver prøve fra hvert dyr går ind i sin egen brønd). Centrifugeres pladen ved 410 x g i 5 min.
- Svirp off supernatanten og resuspender pellet i 200 pi restimulering medier (RPMI suppleret med 10% FCS, 100 IE / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat og 55 uM β-mercaptoethanol, plus 50 ng / ml phorbolmyristatacetat (PMA), 750 ng / ml ionomycin, og proteinet transport inhibitor Brefeldin A). Pladen anbringes i en inkubator ved 37 ° C i 4 timer.
BEMÆRK: PMA og ionomycin restimulering resulterer i aktivering af alle T-lymfocytter-uanset deres antigenspecificitet for at vurdere det totale antal af hver T-celle delmængde i givet væv. Imidlertid kan antigenspecifikke effektor T-cellereaktioner vurderes på forskellige måder, herunder igen at stimulere celler med MOG-peptid i nærvær af Brefeldin A 15,16. - Vurdering af CNS CD4 + T-celle-fænotyper
- Efter inkubering centrifugeres 96 brønde rundbundet plade (fra trin 3.2.5), ved 410 xg i 5 minutter og bladre supernatanten. Alle de følgende farvningsprocedurer trin udføres i denne plade.
- Vask cellerne i 200 pi PBS med 2% FCS og der centrifugeres ved 410 xg i 5 min. Svirp off supernatant og inkuber cellerne med 200 pi PBS indeholdende 2% FCS med Fc Block (klon 2.4G2) for 10 - 15 minutter på is.
- Til at begynde den ekstracellulære pletten, centrifuge celler ved 410 xg i 5 min, flick off supernatanten, og resuspender pellet i 50 &# 956; l overflade pletten cocktail indeholdende fluoroformærkede antistoffer mod CD4 (1: 200, 1 ug / ml), TCRβ (1: 200, 1 ug / ml), og levedygtighed farvestof (1: 500) fortyndet i PBS i 15 min på is. Centrifuger cellerne ved 410 x g i 5 min og flick off supernatant. Vask cellerne 2x i 200 pi PBS centrifugeres ved 410 xg i 5 min.
- Efter fjernelse af ekstracellulære pletten, initiere den intracellulære farvning proceduren ved fiksering / permeabilisering efterfulgt af intracellulær farvning.
- Til at begynde, flick off supernatanten og fix / permeabilisere celler med Foxp3 transskription faktor farvningsreagenser 17 (ifølge producentens anvisninger, se Materialer List) i 30 min til natten over ved 4 ° C.
- Vask cellerne i 150 pi permeabilisering buffer fra kittet og centrifugeres pladen ved 410 x g i 5 min. Svirp off supernatanten og bejdse celler i 50 pi permeabilisering puffer med fluorophormærket-antistoffer mod IL-17A (1: 200, 1 ug / ml), IFN-γ (1: 200, 1 ug / ml), og Foxp3 (1: 200, 2,5 ug / ml) fortyndet i PBS i 30 min på is.
- Centrifuger cellerne ved 410 x g i 5 min og flick off supernatant. For at fjerne overskydende antistoffer vaske 3x i 200 pi permeabilisering buffer centrifugeres ved 410 xg i 5 min. Svirp off supernatanten og resuspender i 200 pi PBS.
- Analyser celler ved flowcytometri, gating på levende CD4 + TCRβ + -celler som tidligere beskrevet 11 for at vurdere procentdelen af celler, der udtrykker hvert molekyle. Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer 18 eller andre validerede metode til at bestemme antallet af celler per mus med hver af CD4 + T-celle-fænotyper.
- Brug de opnåede data, beregne procent og antallet af CD4 + T-celler infiltrerer hjernen og rygmarven fra hver mus, med særlig fokus på disse populationer, der spiller kritiske roller i EAE patogenese og beskyttelse19: IL-17A + IFN-γ -, IL-17A + IFN-γ +, IL-17A - IFN-γ +, Foxp3 +.
- Vurdering af perifer T-celleproliferation og aktivering
- Crush milt med matteret glas dias i en 60 x 15 mm kultur fad. Placer cellesuspension i en 15 ml konisk rør ved anvendelse af medier til at suspendere celler. Fyld rør til 15 ml med medier og centrifuger celler ved 448 xg i 5 min.
- Aspirer medier og resuspender pellet i 2 ml ACK lyseringsbuffer ved stuetemperatur for at lysere røde blodlegemer i ca. 3 min.
- Bringe røret til 15 ml volumen med medier og stamme over en 70 um cellefilter i et nyt rør. Centrifuger cellerne ved 448 xg i 5 min, aspireres supernatanten, og resuspender i 2 ml medium.
- Vurdering af perifert CD4 + T-celle-proliferation med Ki-67-farvning
- Placer en lille portion (typisk 200 ul) af equivalent antal splenocytter fra 3.3.3 i individuelle brønde (en per prøve) i en 96-brønds rundbundet plade.
- Centrifuger ved 410 xg i 5 min og svirp off supernatant. Resuspender i 200 pi PBS indeholdende 2% FCS og gentag centrifugering. Svirp off supernatanten og resuspender cellerne med PBS indeholdende 2% FCS med Fc Block (klon 2.4G2) og inkuberes i 10 - 15 minutter på is. For ekstracellulær plet gentage trin 3.2.6.3.
- Efter fjernelse af ekstracellulære pletten, initiere den intracellulære farvning proceduren ved fiksering / permeabilisering efterfulgt af intracellulær farvning.
- Gentag trin 3.2.6.4.1.
- Centrifuger cellerne ved 410 x g i 5 min og flick off supernatant. Vask cellerne 1x i 200 pi permeabilisering buffer fra kittet og der centrifugeres ved 410 xg i 5 min. Svirp off supernatanten og bejdse celler i 50 pi permeabilisering puffer med anti-Ki-67-antistof (1: 200, 1 ug / ml) i 30 min.
- Centrifuger cellerne ved 410 xg for 5 min og svirp off supernatant. Vask cellerne 2x i 200 pi permeabilisering buffer fra kittet og der centrifugeres ved 410 xg i 5 min.
- Flick off supernatanten og vask cellerne 1x i 200 pi PBS og centrifugeres ved 410 xg i 5 min. Analyser celler ved flowcytometri, gating på levende CD4 + TCRβ + -celler som tidligere beskrevet 11, så vurdere procent Ki-67 + celler.
- Vurdering af perifere CD4 + T-celle-fænotyper
- Placer 200 pi celler (fra trin 3.3.3) i en 96-brønds rundbundet plade (én brønd per prøve) og centrifugeres ved 410 xg i 5 min og restimulere som i 3.2.5.
- Placer plade i en inkubator ved 37 ° C i 4 timer. Udfør den samme farvning fremgangsmåde som i trin 3.2.6 og dens undergrupper trin. Analyser cellerne ved flowcytometri som i 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5.
4. Immunhistokemi end Kvantificering
- vævspræparatet
- Sacrifice EAE mus i et særskilt forsøg fra dem, der anvendes i trin 3 og dens undergrupper skridt på noget tidspunkt efter EAE induktion (ofte ~ dag 30, i den kroniske fase af sygdommen for C57BL / 6 mus eller i løbet af et højdepunkt i de gennemsnitlige kliniske scorer for SJL mus) følge nedenstående trin for at fastslå omfanget af reaktiv gliose og demyelinisering.
- Bedøver mus med 2,5% isofluran og 97,5% ilt og bekræft passende dybde af anæstesi med en blid tå knivspids med pincet, på udkig efter en manglende respons. Udfør transcardiac perfusion som beskrevet i trin 3.1.3. Efter injektion af PBS ind i venstre hjertekammer, bruge en ny sprøjte til at injicere 10 ml 4% paraformaldehyd i PBS ADVARSEL:. Paraformaldehyd er en hud og lunge lokalirriterende, kan forårsage alvorlige skader på øjnene, og er mistænkt for at fremkalde kræft. Undgå indånding, indtagelse og kontakt med hud og øjne. Perfusion bør udføres i et stinkskab. Fjern hjerner og rygsøjle som beskrevet i trin 3.1.4 - 3.1.6. Bind rygsøjle til pinde med snor for at sikre lige opretning af rygmarven.
- Sætte hjerner i scintillationshætteglas mærket med dyrets ID med ca. 20 ml af 4% paraformaldehyd i PBS og rygmarv i 50 ml koniske rør mærket med dyrets ID med ca. 50 ml 4% paraformaldehyd i PBS til post-løse natten over.
- At cryoprotect hjerner, skylles 3 gange i 1x PBS og opbevares ved 4 ° C i 30% sucrose i 1x PBS. Tillad hjerner til at falde til bunden af beholdere (ca. 3 dage).
- Fjern calcium fra rygsøjlen ved at skylle det 3 gange i 1 x PBS og anbringe det i et stort volumen (ca. 50 ml til en muse rygmarv) af 0,5 M EDTA i 1 x PBS (udgangs-pH vil være ~ 10; pH til ~ 7,8 med 6 N HCI) i 2 - 3 uger, indtil knoglen er ikke længere stiv. Cryoprotect rygsøjlen ved at følge trin 4.1.5.
- Embed hjerner ogrygsøjle i OCT efter sub-trinene nedenfor, så snart de falder til bunden af deres containere.
- Lav en blanding af 1 del 30% saccharose i 1x PBS og 2 dele oktober (for eksempel, tilsættes 15 ml 30% sucrose i 1x PBS til 30 ml OLT),.
- Tilføj Okt / saccharose blandingen til indlejring skimmel (22 x 22 x 20 mm for hjerner og 22 x 30 x 20 mm for rygmarv), indtil den er ca. ½ fuld.
- Skær rygsøjle i 6 lige store stykker med et barberblad og anbringes i en 22 x 30 x 20 mm indlejring skimmel vender fremad for koronale rygmarv sektioner. Placer hele hjerner i 22 x 22 x 20 mm forme vender fremad.
- Tilføj Okt / saccharose blanding til dækning af vævet og lad det sidde i 1 time. så bobler kan slippe ud. I løbet af denne time, tilsættes 2-methylbutan til en ret, som kan holde indlejring forme til flash-frysning. Sæt fadet på tøris og dække til at pre-cool.
- Flash-fryse formen i 2-methylbutan på tøris og opbevares ved -80 ° C inde i acontainer at undgå dehydrering.
- Når du er klar, sektion væv på 16 um med en kryostat og montere på elektrostatisk ladede dias. Sæt hver 10. sektion på et dias hver for hjerne og rygmarv (f.eks slide 1 vil have §§ 1, 11 og 21, og skub 2 vil have afsnit 2, 12 og 22, og så videre). Store glider ved -80 ° C eller bruge højre væk til farvning.
- Farvning for reaktiv gliose og myelin
- Når klar til farvning, vælge en slide hver for hjerne og rygmarv pr pletten for hvert dyr i den samme (eller så ens som muligt) region. For hjernen, vælge dias viser corpus callosum og cingulum bundt.
- Anbring objektglassene med væv på en varmeblok ved 70 ° C i 7 min. Efter 7 min slukke for varmen blok og lad dias køle på varme blokken for en anden 10 - 15 min. Dette vil forhindre vævssnit i at falde objektglassene under farvningsproceduren.
- Wash slides 3 gange hver i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk detergent (for intracellulære antigener) eller 1 x PBS (for antistoffer rettet overfladeantigener) i 5 min.
BEMÆRK: Da antistofferne anvendes i denne protokol er intracellulære, vil nonioniske detergenter anvendes i efterfølgende trin. Lad aldrig slides tørre helt efter dette trin. - Anbring objektglassene i en beholder og dække med citratpuffer pH 3,0. For at gøre citratpuffer, tilsættes 0,192 g vandfri citronsyre til et endeligt volumen på 100 ml i vand. Indstil pH med eddikesyre hvis over pH 3,0 eller NaOH, hvis nedenfor.
- Inkuber slides ved 37 ° C i 30 min og vask 3 gange i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk detergent i 5 minutter.
- Cirkel et område omkring vævet med en hydrofob barriere pen og placere objektglassene i et fugtigt kammer (for eksempel et objektglas boks indeholder våde papirhåndklæder). Tilføj blokerende buffer til vævet. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Blokeringsbuffer består af 1 x PBSplus 0,3% ikke-ionisk detergent og den passende serum (5%) baseret på værten af det sekundære antistof, dvs. hesteserum for myelin basisk protein (MBP) og glial fibrillært surt protein (GFAP), og gedeserum i Iba1. - Flick blokeringsbuffer off dias og tilføje primært antistof (1: 1.000 eller 0,2 ug / ml gede-anti-myelin basisk protein for oligodendrocytter, 1: 1.000 eller 1 ug / ml til 3 ug / ml muse-anti-GFAP for astrocytter, eller 1 : 750 eller 0,67 ug / ml kanin-anti-Iba1 for mikroglia) fortyndet i den passende blokerende buffer (se trin 4.2.6) til det indcirklede område. Lad ved 4 ° C natten over i fugtigt kammer.
- Flick antistof i blokeringsbuffer off dias og vaskes objektglassene 3 gange i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk detergent i 5 minutter.
- Tilføj sekundært antistof (1: 200 eller 7,5 ug / ml biotinyleret heste-anti-muse for MBP og GFAP, eller biotinyleret gede-anti-kanin for Iba1) fortyndet i den passende blokerende buffer (se step 4.2.6) til det indcirklede område og efterlade dias at inkubere i befugtet kammer i 1 time ved stuetemperatur.
- Flick antistof i blokeringsbuffer off dias og vaskes objektglassene 3 gange i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk detergent i 5 minutter.
- Forbered avidin-biotin-peroxidase-kompleks (ABC) i immunperoxidase (se materialer liste) 30 min før brug og omrystes på et rysteapparat indtil det skal bruges i 4.2.12. Tilføj 0,3% H2O 2 i methanol til det indcirklede område i 10 minutter for at standse endogen peroxidaseaktivitet.
- Flick opløsning off objektglassene og vask i 2 gange i 1 x PBS eller 1x PBS med 0,1% ikke-ionisk detergent i 5 min, derefter 1 gang i 1 x PBS. Tilføj ABC reagens til det indcirklede område i 30 minutter.
- Flick vaskemiddel fra dias og vask 3 gange i 1 x PBS i 5 minutter, derefter 2 gange i vand i 5 minutter. Lav 3,3'-diaminobenzidin (DAB) opløsning (se Materialer List) og føje den til at dække sektionerne.
BEMÆRK: Dette trin kræver et mikroskop for at observere optimal opdageion tid af farvning og skal gøres for den samme mængde tid til dias, der skal sammenlignes. - Wash slides 3 gange i vand i 5 minutter hver. Dehydrere vævet ved anbringelse i de følgende opløsninger i 2 min hver: 70% ethanol i vand, 95% ethanol i vand, 100% ethanol i vand, 50% xylener og 50% ethanol, 100% xylener. Seal et dækglas på diaset med en harpiksholdige montering medium.
- Alternativt udføre immunfluorescensfarvning som tidligere beskrevet 11 for at vurdere reaktive gliose anvendelse af antistoffer mod Iba-1 og GFAP.
- Tag billeder af hver rygmarv sektion (farvet med respektive antistoffer ved hjælp af DAB) med en 4X, 0,13 NA objektiv og gemme billederne som .tiff. Alternativt kan du tage billeder af corpus callosum og cingulum bundt i venstre eller højre hjernehalvdel ved hjælp af en 20X, 0,50 NA objektiv og gemme billederne som .tiff. For en mere omfattende bestemmelse af læsion belastning i hjernen, er det fordelagtigt at indbefatte både hemispheres i analyserne.
- Måling gennemsnitlige fraktion område for reaktiv gliose (Iba1 og GFAP-farvning)
- Hent NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) og åben på en computer. På ImageJ software, bruge menuen strengen Filer> Åbn og vælge et billede fra trin 4.2.16. Tegn et område ved hjælp af "Polygon markeringer" værktøj på menulinjen. For rygmarv, spore hele afsnittet; for hjerner, corpus callosum og cingulum bundt. Konverter billedet til 16-bit ved at gå til Image> Type og klikke på "16-bit".
- De-støj billedet ved at gå til Proces> Træk Baggrund og indstille "rullende bolden radius" til mindst størrelsen af det største objekt, der ikke er en del af baggrunden (se ImageJ brugervejledningen på http: //rsbweb.nih .gov / ij / docs / vejledning / 146-29.html).
BEMÆRK: For en 4X billede af Iba-1 farvning vi bruger 4,0 og for GFAP vi bruger 50,0, men disse tal kan variere billedet forstørrelse og farvning intensity. - Check "Glidende hyperbolsk paraboloide" og klik "OK". Gå til Image> Adjust> Threshold ... og indstil den nedre niveau (den øverste bjælke) ved hjælp af de glidende barer. Medtag kun farvning der er cellulære og være konsekvent på tværs billeder. For billeder med mørke baggrunde (gælder kun fluorescerende farvning), sikre, at feltet "Mørk baggrund" er markeret.
- Gå til Analyser> Set Målinger ... og vælg "Område fraktion" (giver procentandelen af tærskel-område inden for området af interesse). Sørg for, at "Begræns til tærskel" er markeret og "Display label" er markeret. Klik på "OK" når du er færdig.
- For at opnå målinger, skal du gå til Analyser> Measure. A "Results" popup boks vises, og disse data kan gemmes som er eller kopieres i et andet program. Til analyse, sammenligne "Område fraktion" værdier mellem behandlingsgrupper.
- Kvantificering af MBP farvning med optical tæthed
- Åbn billede og tegne et område af interesse som beskrevet i trin 4.3.1. Gå til Analyser> Set Målinger ... og vælg "Mean grå værdi" (summen af grå værdier i markeringen divideret med antallet af pixels). Sørg for, at "Begræns til tærskel" er markeret og "Display label" er markeret. Klik på "OK" når du er færdig.
- For at opnå målinger, skal du gå til Analyser> Measure. Overhold en "Results" popup boks vises. Kopier denne data og gem som er eller kopiere i et andet program.
- Til analyse, kopiere og indsætte værdier i et andet program. Konvertere gennemsnitlige gråtone værdi i optisk densitet (OD) ved hjælp af formlen: OD = log 10 (255 / betyde grå værdi).
Representative Results
Her brugte vi to modeller af EAE at forstå, hvis et farmakologisk middel giver CNS beskyttelse ved enten formildende CNS-infiltrerer T-celler eller forhindre myelin og axonal skade under stormløb af inflammatoriske immun celle infiltration. For at bestemme om et terapeutisk middel forhindrer immun celleinfiltration ind i rygmarven er C57BL / 6 musemodel for kronisk EAE anvendes, hvor immun celleinfiltration og sygdom patologi er overvejende placeret i rygmarven (Figur 1A). At afgøre, om en terapeutisk lægemiddel giver CNS beskyttelse under indtrængen af immunceller til CNS, SJL dyremodel af recidiverende-remitterende EAE anvendes, hvilket demonstrerer sygdomspatologi i både hjernen og rygmarven (Figur 1B).
Kliniske vurderinger
Relevante kliniske vurderinger er foretaget efter følgende rubrikken for typiske (figur 1C) eller atypisk (figur 1D) EAE. For typisk klinisk sygdom, en score på 0 er ingen unormal adfærd. Når samlet op af haleroden, kan halen rotere hurtigt (meget ligesom en helikopter rotor) og bagbenene vil spredes fra hinanden. En klinisk score på 1 er et delvis slap hale, som kan bestemmes ved at løfte musen ved haleroden. Den normale helikopter-lignende roterende kan svækkes eller fraværende, og en del af halen kan være helt halte. En nyttig måde at afgøre omfanget af haleparalyse er at køre en finger op længden af halen, som unparalyzed hale normalt vil krølle rundt om fingeren, mens en delvist lammet hale vil være i stand hertil. En klinisk score på 2 repræsenterer et helt lammet hale. Ingen bevægelse af halen forekommer overhovedet, når picking musen op ved haleroden. En klinisk score på 3 repræsenterer delvis bagbensparalyse. Bestemmelse af denne score kræver, at musen være fri til at bevæge sig på en flat overflade. Hvis en bagben trækker som musen bevæger sig fremad, eller hvis den ene eller begge bagben synes at være delvist lammet, kan gives en score på 3. En klinisk score på 4 repræsenterer fuldstændig bagbensparalyse. Med denne score, vil en mus være ude af stand til at flytte sine bagben og vil trække sig frem med sine forreste lemmer. En klinisk score på 5 repræsenterer en døende mus, eller en mus med besvær bevæger sig på tværs af sit bur eller vejrtrækning. Hvis en mus ikke kan trække sig langs bunden af buret eller hvis vejrtrækning er besværet, bør musen humant aflivet. En klinisk score på 6 repræsenterer en mus fundet død i sit bur. En score på 6 er usædvanligt og årsager til andet end EAE død bør undersøges.
Atypisk klinisk sygdom kan eller ikke kan være ledsaget af lammelse. Det kan være nødvendigt at indbefatte to separate systemer med point hvis en mus præsenterer med atypisk sygdom plus typiske symptomer. En score på 0 er ingen unormal adfærd, ets med den typiske pointsystem. En klinisk score på 1 repræsenterer en lille hoved sving eller tilt, mens musen er til fods. Dette kan bestemmes ved at lade musen til at gå frem og observere en konstant venstre eller højre retningsvirkning til dens bevægelse. En klinisk score på 2 repræsenterer en mere udtalt hoved tur og dårlig oprettende evne. Som med en atypisk score på 1, musen har retningsvirkning til dens bevægelse og kan have lidt svært med balancen. En klinisk score på 3 repræsenterer en manglende evne til at gå i en lige linje. Musen vil have svært at balancere og kan bruge den side af buret for at hjælpe højre selv som det går. En klinisk score på 4 repræsenterer en mus liggende på sin side, ude af stand til at gå på grund balancering problemer. Musen kan være i stand til at trække sig selv langs bunden af buret, men kan have retningsvirkning til dens bevægelse. En klinisk score på 5 repræsenterer kontinuerlig rulning medmindre understøttes. En mus, der når denne score bør humant aflivet. En klinikal score på 6 repræsenterer en mus fundet død i sit bur. En score på 6 er usædvanligt og årsager til andet end EAE død bør undersøges.
Det kan være nødvendigt at tillade "i-mellem" scoringer, f.eks, tilføje 0,5 til en score, hvis en musens tilstand ændrer lidt, eller hvis det er vanskeligt at vælge mellem to scoringer. For eksempel, at en mus, der begynder at flytte langsommere end sine normale modparter, men viser ingen lammelse, eller en mus, der folder sin hind fødder med sin front i stedet for splaying sine ben ud, når samlet op af halen kan gives en score på 0,5 . En mus, der kun kan trække sig langs bunden af buret og er kun i stand til at spjæt sine bagben periodisk eller ved berøring kan gives en score på 3,5.
Vurdering af en reduktion i Immune celleinfiltration
Efter induktion af EAE i C57BL / 6-musemodellen (figur 1A, dag 0), antigen presentatipå og proliferation af T-celler i milten forekommer på dag 1 - 5 efterfulgt af immun celle infiltration i CNS omkring dag 7. Ca. 3 til 5 dage efter de første immun celleinfiltration mus stede med kliniske bedømmelser. At vurdere, om et terapeutisk middel blokerer immuncelle infiltration ind i rygmarven, er lægemidler eller vehikel indføres på dag 7 efter antigenpræsentation og proliferation i miltene men før immunceller begynder at infiltrere rygmarven. Hvis immun celle infiltration er blevet svækket, bør den kliniske sygdomsforløb afspejle forbedrede kliniske scoringer under stigende fase af sygdommen fra dag 10 til 15 (figur 2).
En reduktion i immun celle infiltration ville også resultere i formindsket neuroinflammation. Reaktiv astrocytose og mikrogliose anses store stempler for neuroinflammation. Farvning for astrocytter med GFAP og microglia med Iba-1 kan derpå anvendes til at vurdere Changes i gennemsnit område fraktion farvning til at kvantificere neuroinflammation (figur 3).
For at bestemme om immun celleinfiltration er reduceret, er de rygmarv fjernet og bearbejdet til flowcytometrianalyse på toppen af sygdom (figur 1A, ca. dag 18). Dette sikrer, at det største antal immunceller er trådt ind i rygmarven. Indgang af T-celler ind i CNS betragtes som den initierende inflammatoriske begivenheden og begge Th1 og Th17 celler findes i dyremodeller af EAE samt MS-patienter. Tilsammen skal flowcytometrisk analyse omfatter vurdering af begge typer af patogene T-celler. Endvidere tregs er velkarakteriserede suppressor T-celler, der dæmper sygdom. Derfor skal procentandelen af tregs fra en total CD4 + population vurderes i forhold til den procentdel af effektor T-cellepopulationer. Dette vil afsløre, om en samlet reduktion i T-celle infiltration har fundet sted, eller hvis there er en skævvridning af T-celle-fænotyper i CNS. Repræsentative dot plots (figur 4A) demonstrerer en reduktion i det samlede antal af CD4 + infiltrerende T-celler i rygmarv fra lægemiddelbehandlede mus sammenlignet med rygmarv fra vehikelbehandlede mus (tal i øverste højre kvadranter). Til bedømmelse Th1, Th17, og Treg celler følgende signatur proteinerne evalueres: IFN-γ +, IL-17 +, og Foxp3 +, henholdsvis og bør reduceres (figur 4A). Bør udføres statistisk analyse på CD4 + IFN-γ +, IL-17 +, og Foxp3 + celletal at påvise en signifikant reduktion (figur 4B). For at udelukke en skævhed af T-celle delmængder, statistisk evaluering af andelen af IFN-γ + IL-17 + IFN-γ + IL-17 -, IL-17 + IFN-γ - og Foxp3 + celler udføres ( Fifigur 4C).
For at eliminere muligheden for, at en reduktion af CNS-infiltrerende T-celler er en konsekvens af inhibering af proliferation, aktivering, og differentiering i periferien, skal evalueres antallet af aktivt prolifererende T-celler ud over andelen af T-celle undertyper. Ingen ændring i procentdelen af CD4 +, IFN-γ +, IL-17 + eller Foxp3 + bør findes hvis aktivering og differentiering er upåvirket (figur 5A). Endvidere bør der findes ingen ændring i Ki67 + CD4 + celler, hvis spredning er upåvirket (figur 5B). Lægemiddelbehandlinger indføres på dag 7 eller senere for at undgå ændring indledende antigenpræsentation og T-celle aktivering i periferien. Men i genetiske modeller proteiner ofte slettes konstitutivt under embryogenese eller fremkaldt før induktion af EAE gør splenocyt assessment af stor betydning.
Vurdering CNS Protection
For at demonstrere, om et særligt terapeutisk middel modulerer sygdom patologi i CNS efter immun celleinfiltration, bør drug interventioner anvendes under den første top i klinisk sygdom scoring. SJL model af EAE er fordelagtig til disse eksperimenter, idet disse mus udviser en recidiverende-remitterende fænotype. Hvis et lægemiddel behandling forebygger myelin-axon degeneration, vil en forbedring i kliniske scoringer observeres (figur 6). Patologisk bedømmelse af myelin skal bekræfte en reduktion af myelin skade overensstemmelse med forbedrede kliniske bedømmelser. Til kvantitativt evaluere myelin integritet, DAB-farvning af myelin basisk protein (MBP) udføres, efterfulgt af statistisk analyse af den optiske densitet for denne farvning (figur 7). For yderligere at underbygge, at neuroinflammation opretholdes eller faldet med therapeutic indgreb, kan reaktive gliose vurderes ved måling gennemsnitlige fraktion område for reaktiv gliose som beskrevet ovenfor (figur 3). At bekræfte, at en terapeutisk intervention direkte beskytter CNS uden immunmodulerende effekter, skal dæmpning af immun celle infiltration i CNS og proliferation i milten tilbagediskonteres. For at løse dette, bør metoder til hjerne og rygmarv vurdering af immun celleinfiltration og vurdering af perifer T-celleproliferation og aktivering udføres som beskrevet ovenfor (figur 4 og 5). Samlet set terapeutiske midler, der blokerer celle skade i CNS uden tegn på en reduktion af CNS-infiltrerende T-celler eller proliferation af T-celler i periferien er CNS-beskyttende behandlinger.
Figur 1. Repræsentative results Kliniske Scorer fra EAE i C57BL / 6 og SJL mus. (A) Kliniske scorer (gennemsnit ± SEM) i C57BL / 6-mus (n = 10) induceret med MOG 35-55 til frembringelse EAE med kronisk sygdom. (B) Kliniske scorer (gennemsnit ± SEM) i SJL-mus (n = 3) induceret med PLP139-151 at producere EAE med recidiverende-remitterende sygdom. (C) Den kliniske scoring rubrikken bruges til at spore typiske sygdomsprogression i EAE-mus. (D) Den kliniske scoring rubrikken bruges til at spore atypisk sygdomsprogression i EAE-mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Farmakologisk behandling forud for Immune celleinfiltration i C57BL / 6-mus med EAE. 35-55. Data er fra tre poolede uafhængige forsøg. Statistisk forskel blev bestemt ved anvendelse af en ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney U test, * p <0,05. Re-print med tilladelse fra (11).
Figur 3. immunfluorescensfarvning og Kvantificering af reaktiv gliose i rygmarven af kontrol, EAE, og Behandlede C57BL / 6 mus. (A) Fluorescerende mærkning af GFAP (astrocytter) og Iba-1 (mikroglia) i rygmarven for kontrol (ikke-immuniserede ) mus (venstre paneler) og EAE mus behandlet med PBS (midterste paneler) eller SAS (højre paneler). Scale bar = 100 um. Kvantificering af farvning blev bestemt ved anvendelse af området fraktion teknik til at måle procent immunopositive område for GFAP (B) og Iba-1 (C). Middelværdi ± SEM, n = 3 kontrol, n = 3 SAS-behandlet, eller n = 4 PBS-behandlede mus, 6 sektioner pr mus. Statistiske forskelle bestemtes ved anvendelse af en envejs ANOVA, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Re-print med tilladelse fra (11). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. FACS-analyse af EAE C57BL / 6 mus rygmarv Demonstration Reduceret T-celle infiltration i behandlede mus. C57BL / 6 mus blev behandlet med SAS eller PBS, begyndende 7 d postinduction af EAE. Rygmarve blev opnået på dag 15. (A) Repræsentative dot plots viser Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) og Th17 (IFN-γ- / IL-17 +) celler i CD4 + gate (øverste paneler) og T regulerende celler (Foxp3 +) (nedre paneler). Dot plots viser procentdele i øverste højre kvadrant. (B) det absolutte antal CD4 + celler såvel som IFN-γ +, IL-17A + og Foxp3 + -celler blev analyseret statistisk. (C) Ændringen i procent af T-cellepopulationer mellem SAS- og PBS-behandlede EAE-mus blev også undersøgt. Middelværdi ± SEM, n = 10 for PBS-behandlede, og n = 9 for SAS behandlet fra to uafhængige forsøg. To-halet t-test blev anvendt til alle søjlediagrammer. ** P <0,01. Re-print med tilladelse fra (11). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. FACS Analyse af EAE C57BL / 6 mus Milt Demonstration tilsvarende T-celle Expression Profiler og spredning i behandlede og ubehandlede mus. Milt fra PBS og SAS-behandlede mus blev analyseret 15 d postinduction af EAE. (A) Procentdelen af CD4 + -T-celler, Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), Th17 (IFN-y - / IL-17 +), og T regulerende celler (Foxp3 +) i milt fra PBS behandlede (n = 10) og SAS-behandlede (n = 9) mus fra to uafhængige forsøg. (B, venstre panel) Procentdelen af Ki-67 + -celler i CD4 + -populationen fra naive milt (n = 4) og fra PBS (n = 5) og SAS-behandlede mus (n = 5) induceret med EAE. En envejs ANOVA-test demonstrerede statistisk signifikans mellem andelen af Ki-67 + celler fra naive milte sammenlignet med enten PBS eller SAS-behandlede EAE-milte. Ingen signifikans blev observeret mellem PBS og SAS-behandlede EAE milten. (B, højre panel) Repræsentative dot plots; Tallene angiver andelen af proliferation. Dot plots viser procenter. Søjlediagrammer repræsenterer to-halet t-test, *** p <0,001. Re-print med tilladelse fra (11). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Farmakologisk behandling efter Immune celleinfiltration i SJL mus med EAE. Kliniske scorer (middel ± SEM) af SJL mus behandlet med PBS (n = 8) eller SAS (n = 8) fra dag 24 efter immunisering (stiplet linie) med PLP 139-151. Data er gennemsnit ± SEM af kliniske bedømmelser. Statistisk forskel blev bestemt ved anvendelse af en ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney U test, *** p <0,001. Top linie repræsenterer værdier, der anvendes til statistiskanalyse. Re-print med tilladelse fra (11).
Figur 7. Kvantificering af MBP Farvning ved hjælp optisk densitet. (A) Repræsentant farvning af MBP i thorax rygmarv fra en uspecificeret genetisk knockout mus sammenlignet med kuldsøster kontrol C57BL / 6 mus induceret med EAE. Beslag indikerer repræsentativt område med reduceret MBP farvning indikerer demyelinisering. (B) MBP farvning af thorax rygmarven fra en uspecificeret genetisk knockout C57BL / 6 mus. (C) Uspecificeret genetiske knockout-mus induceret med EAE (KO, n = 6-mus, 2 - 4 lænde- og thorax sektioner pr dyr) udviser en højere optisk densitet (OD) af MBP farvning i rygmarven end vildtype (WT, n = 3 mus, 2 - 4 lænde og thorax sektioner pr dyr) mus induceret med EAE. Analyseret statistisk USIng en to-halet t-test, * p <0,05. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Scale bar 100 pm.
Discussion
Patienter med MS fortsat oplever sygdom tilbagefald, mens du tager medicin, der dæmper T aktivering og / eller infiltration celle i CNS, berettiger udviklingen af behandlingsmuligheder, der direkte beskytter CNS. EAE er klassisk blevet anvendt til at modellere symptomerne på MS og kan være et stærkt værktøj, når man studerer arten af interaktioner mellem immunsystemet og CNS in vivo. Brug af timingen af behandlingen overvejelser i EAE, fx, før eller efter initiering af sygdom, sammenholdt med behandlingen immuncelle infiltration i CNS og proliferation og aktivering i periferien, er det muligt at afgrænse virkningerne af behandlingerne på både immunsystemet og CNS.
Mens EAE i C57BL / 6 mus er mere almindeligt brugt, kan EAE i SJL mus være mere repræsentativ for størstedelen af MS tilfælde, da disse mus har en recidiverende-remitterende fænotype og infiltrering af immunceller i parenchymaf hjernen 10. SJL mus har klart opsving i løbet af remission så godt, hvilket gør det muligt at begynde behandling, efter at sygdommen har fremlagt, men i perioder med reduceret inflammation. Det er vigtigt at overveje, at SJL mus ikke altid tilbagefald og eftergive synkront, hvilket resulterer i potentielt store variabilitet resultater samles. Derfor kan nogle forskere vælge at vise repræsentative resultater for kliniske scoringer fra et dyr, mens du tager mus til FACS-analyse og histologi ved individualiserede punkter i sygdomsprogression.
I betragtning når manipulationer er lavet til EAE-mus kan hjælpe i bestemmelsen af, hvordan en behandling påvirker immunsystemet eller centralnervesystemet. Der er mange muligheder for, når behandlingen begynder, hver med sin egen konnotation for hvorvidt immunceller har indtastet CNS, og hvordan de kan interagere med CNS. Behandling før symptomdebut indebærer, at immunceller endnu ikke har indtastet eller forvoldt skade på CNS.Behandling efter symptomdebut indebærer, at immunceller har indtastet CNS og har forårsaget nogle skader. Ved hjælp af SJL mus, kan behandlingen også begynde i løbet af et tilbagefald, hvor immunceller aktivt at infiltrere og forårsager betændelse, eller under remission, hvor immunceller kan være mindre udbredt i CNS med mindre inflammation. Indledende hypoteser om, hvordan behandlinger påvirker CNS og immunsystemet kan gøres, når man overvejer hvor immuncellerne er i den patologiske proces under behandlingen.
Der er en række måder, hvorpå behandlinger kan påvirke immunceller og CNS, hver med det endelige resultat af at reducere sværhedsgraden af EAE-symptomer. Derfor er det nødvendigt at anvende flowcytometrisk analyse og immunhistokemi at se på, hvordan immune celler påvirkes i periferien og CNS, hvad enten immunceller har indtastet CNS, og hvordan CNS reagerer på behandlingen. Mens flowcytometrisk analyse af rygmarven kan bestemme, hvor mange celler have indtastet CNS på et givet tidspunkt, kan man ikke bestemme, at denne virkning skyldes reduceret immune celletrafik medmindre proliferation af immunceller er upåvirket i milten. Det er derfor nødvendigt at analysere både perifere og CNS-væv og bestemme, hvad resultater betyder mekanistisk når begge væv sammenlignes. Det er også muligt for immuncelle aktivitetsprofiler ikke påvirket af behandling, for eksempel med en afbryder i en patogen hjælper-T--tung profil til en regulatorisk T-celle-tung profil. Ser man på markører for forskellige celletyper og sammenligne procent ekspression mellem behandlede og ubehandlede dyr er derfor også en vigtig overvejelse. En nye begreb i MS forskning tyder på, at B-celler spiller en vigtig rolle i autoimmun demyelinisering. Dette er baseret på undersøgelser, der viser, at B-celler er nødvendige for reaktivering af T-celler 20. Dette koncept understøttes af den succes, behandlinger som rituximab, et antistof mod CD20 extrykket på overfladen af B-celler 21,22. Som det fremgår af den succes, det monoklonale antistof ocrelizumab i kliniske forsøg, kan lægemidler rettet mod forskellige epitoper af CD20 forbedre effektiviteten af B-celle-målrettede lægemidler 23.
En begrænsning af de teknikker, der præsenteres her, er, at det er muligt for immunceller at komme ind i CNS, men være ude af stand til at rejse i parenkym. Immunhistokemi kan anvendes til at påvise perivaskulær infiltration af immunceller og evaluere afstand i parenkym mellem behandlede og ubehandlede dyr. En anden potentiel begrænsning indebærer virkningerne af microbiome på EAE patogenese. Kommensale gut mikrobiota kan stærkt påvirke sygdommen patogenese 24; derfor, mus anbragt i forskellige kolonier og selv i forskellige bure kan have store forskelle i sygdommens sværhedsgrad. Følgelig er det altid at foretrække hvis det er muligt at anvende kuld kontroller rejst i samme bur tilforsøg med EAE. En sidste bemærkning er, at hvis det er eksperimentelt ønskeligt at eliminere virkningerne af immun celleproliferative ændringer i periferien, kan det være muligt at gøre det ved hjælp passiv overførsel induktion snarere end den aktive induktion beskrevet i denne protokol.
Yderligere bekræftelse til neurobeskyttelse kan opnås ved anvendelse af et co-kultursystem 11 for at teste specifikke mekanismer af celledød eller gennem anvendelse af betingede knockout-mus, som muliggør deletion af proteiner selektivt på en celletype. Endvidere at udvide udforskning af farmakologiske midler, der er nervebeskyttende bør markører for axonal overskæring og neuronal død medtages. Et andet vigtigt område er remyelinisering. Skadede axoner er ude af stand til at remyelinate udlån yderligere støtte, som neurobeskyttende behandlinger bør være en vigtig del af remyelinering behandlingsformer. Derudover umyelinerede axoner er mere sårbare over for skader end myelinated axoner. Dette tyder på, at når en axon bliver demyeliniserede terapeutiske interventioner, der fremmer rettidig remyelinering vil forhindre axonal skade. For at udforske disse muligheder, kan andre in vivo modeller til demyelinisering og remyelinering anvendes (dvs. cuprizone og lysolecithin). Den heri beskrevne fremgangsmåde fokuserede på at vurdere neurobeskyttelse ved at kvantificere myelin tab. Til evalueringen af remyelinisering antallet af progenitorceller såvel som deres evne til at proliferere og modnes ville også være vigtigt at undersøge. Med omtalen af disse alternative modeller, må man også overveje forskellige modeller af encephalitis, der viralt medieret. Der er to velkarakteriserede RNA virale modeller, der producerer myelin tab: Den ene er Theiler s murine encephalomyelitis, en ikke-kappeklædte Picornaviridae virus, og den anden er muse hepatitis virus, et medlem af Coronaviridae virus familien 25,26.
EAE er et værdifuldt redskab for studies af hvordan manipulationer eller behandlinger påvirker immunsystemet og CNS in vivo. Den her beskrevne kan hjælpe med at afgøre, hvor behandlinger påvirker sygdomsforløbet, hvad enten det er i periferien, ved blodhjernebarrieren, eller i CNS-protokollen. Ingen nuværende behandlinger for MS helbrede sygdommen og patienter ofte erfaring tilbagegang over tid. Tilsvarende andre sygdomme, der involverer immun celle infiltration i CNS og nedbrydning af myelin, herunder akut dissemineret encephalomyelitis, tværgående myelitis, og neuromyelitis optica, manglende behandlinger, der beskytter CNS som det er direkte under angreb ved at infiltrere immunceller. Under hensyntagen til timingen af behandlingen og under anvendelse flowcytometrisk analyse af milten og rygmarv, sammenholdt med immunhistokemi af CNS at vurdere inflammation og skader vil muliggøre mekanistiske bestemmelser skal foretages vedrørende behandlinger.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NINDS P30-NS069324, The National multipel sklerose SocietyRG 4587-A-1, The Civitan International Research Foundation, The Mike L. Jezdimir Tværgående myelitis Foundation, The University of Alabama Health Services Foundation - General Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, og T32 AI007051 fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
| 22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| 30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
| ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/ml stock concentration |
| anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/ml stock concentration |
| anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1 - 3 mg/ml stock concentration |
| anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/ml stock concentration |
| anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/ml stock concentration |
| anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/ml stock concentration |
| anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/ml stock concentration |
| anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/ml stock concentration |
| anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/ml stock concentration |
| anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/ml stock concentration |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/ml stock concentration |
| Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/ml stock concentration |
| Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
| Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
| Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-Cl | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
| Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
| Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
| Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-Cl | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
| Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
| Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
| Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |
References
- Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide. Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).
- Yednock, T. A., et al. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature. 356, 63-66 (1992).
- Ridge, S. C., et al. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone. Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).
- Kuerten, S., et al. MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum. J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).
- Brownell, B., Hughes, J. T. The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).
- Kidd, D., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis. Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).
- Geurts, J. J., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology. AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).
- Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130, 2816-2829 (2007).
- Evonuk, K. S., et al. Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination. J Immunol. 195, 450-463 (2015).
- Rowse, A. L., et al. Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling. PloS one. 7, e52658 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. , (2014).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. , (2015).
- McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE. J Neuroinflammation. 12, 128 (2015).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. , (2012).
- Law, J. P., et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Korn, T., et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature medicine. 13, 423-431 (2007).
- Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system. Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).
- Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).
- Bar-Or, A., et al. Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial. Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).
- Kappos, L., et al. Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet. 378, 1779-1787 (2011).
- Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis. The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).
