Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bestemme Immune System Suppression versus CNS Beskyttelse for farmakologiske tiltak i Autoimmune Demyelinisering

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54348
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3,4
1Physical Medicine and Rehabilitation, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham, 4Center for Glial Biology and Medicine, University of Alabama at Birmingham
* These authors contributed equally

Introduction

Multippel sklerose (MS) er karakterisert ved inflammatoriske lesjoner, hovedsakelig hvit substans regioner av hjernen tidlig i sykdommen. Etter langvarig progresjon, blir grå materie atrofi detektert av MR avbildning og markerer neurodegenerative fase av sykdommen. Reaktiv gliose, demyelinisering og aksonal skade i hvit substans er knyttet til CNS-infiltrere immunceller. Ingen av de behandlinger som for tiden anvendes i MS revers eller direkte forhindre nevrodegenerasjon i CNS - i stedet, de reduserer inflammasjon ved å dempe T-celleaktivering og / eller infiltrasjon inn i CNS. Fordi det er ingen kur for MS og pasienter som bruker nåværende behandlinger fortsetter å oppleve sykdomsprogresjon, funn av medikamenter som hindrer demyelinisering og nevronale tap er kritisk viktig. Imidlertid skille mellom virkninger på immunceller og tilsvarende på CNS kan være vanskelig eksperimentelt, som det resultat - dvs, redusert skade på sentralnervesystemet - ser at same uavhengig av de mekanismene gjennom hvilke det forekommer. Derfor vurdering av CNS vern må samarbeider med vurderinger av CNS-infiltrerende immunceller og spredning av immunceller i periferien for å finne ut hvordan farmakologiske stoffer påvirker sykdomsmekanismer.

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en veletablert dyremodell av autoimmune inflammatoriske lidelser som var direkte ansvarlig for oppdagelsen av narkotika i dag brukes til å behandle MS 1-4. Mus blir ofte brukt for EAE, med C57BL / 6 mus å være en populær belastning basert på tilgjengeligheten av genetiske varianter. C57BL / 6 mus indusert med EAE stille kronisk sykdomsprogresjon med utbruddet rundt dag 10 etter induksjon. Infiltrering av ryggmargen parenchyma og cerebellum er karakteristisk for histopatologi av disse dyrene, med fravær av infiltrasjon i det kortikale parenkym 5. I tillegg kortikale lesjoner og demyelinisering i bregn er kjennetegn ved sykdommen 6-9, som er relativt fraværende i C57BL / 6 mus. Derfor kan det være å foretrekke når det er mulig å bruke SJL mus, som har relapsing-remitting sykdom og skader som finnes i både hjernen og ryggmargen som vises lik de i MS 10.

Behandling kan ikke klassifiseres som nevro hvis immunceller aldri kommer til CNS. Derfor er denne protokollen gjør bruk av strømningscytometrisk analyse av hjerne, ryggmargen, og milter fra mus EAE for å bestemme effekten av behandlingen på immuncelleinfiltrasjon inn i CNS og proliferasjonen av immunceller i periferien, som tidligere vist 11. Immunhistokjemiske analyser av CNS vev for å fastslå omfanget og arten av nevro er også beskrevet. Ved å kombinere disse fremgangsmåter gjør det mulig for bestemmelse av hvorvidt immunceller ble aktivert og proliferert i periferien, enten immunceller kom inn i CNS, og hvorvidt den var CNS protected fra betennelse eller skade. Hvis nevrobeskyttende effekter er mistenkt til tross for effekter på immunsystemet, kan forskere endre behandling starttider etter immuncelleinfiltrasjon inn i CNS har oppstått.

Her presenterer vi en protokoll med to forskjellige modeller for aktiv EAE, en T-celle-mediert dyremodell av MS, og flowcytometri analyse kombinert med immunhistokjemi på ulike tidspunkter i løpet av sykdommen for å bestemme effekten av eksperimentelle behandlinger på ulike aspekter av MS patogenesen. Denne metoden vil hjelpe forskere i å skille mellom effekter på immun celleproliferasjon og infiltrasjon versus CNS beskyttelse, noe som gjør det lettere å innskrenke hvordan legemidler virker på sykdom patogenesen.

Protocol

Eksperimentelle prosedyrer som involverer mus må være i samsvar med relevante institusjonelle og statlige forskrifter. For denne studien, ble musene plassert og behandlet i samsvar med National Institutes of Health og University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer.

1. EAE Induksjon og scoring

  1. Induserer EAE i C57BL / 6 mus 11-13 eller SJL-mus 10,11 som tidligere beskrevet 13.
    MERK: forskere bør velge en modell ideelt for deres problemstilling (se omtale for ytterligere detaljer).
  2. Rekord score daglig som tidligere beskrevet 11 for hver mus som begynner på dag 7 etter induksjon. Sammenligne gjennomsnittlige daglige score over tid mellom behandlingsgruppene.

2. Behandling

  1. Unn EAE mus før sykdomsutbruddet å avgjøre om behandlingen påvirker immuncelleinfiltrasjon eller spredning.
    1. Velg en behandling, megthod for levering, og hyppigheten av behandling mens vurderer stoffet blod-hjerne barrieren permeabilitet, halveringstid og dosering.
      MERK: EAE øker blod-hjernebarrieren permeabilitet og kan tillate narkotika for å nå CNS som ellers ikke ville være i stand til friske dyr. Gjennomføre eksperimenter for dose-responskurver ser på EAE kliniske score kan bidra i å velge en passende dose av stoffet. Kjøretøykontroll bør utføres parallelt med medikamentell behandling. Alternativt kan betingede knockout-mus brukes sammen med kullsøsken som kontroller.
    2. Bruk SJL eller C57BL / 6 mus for dette eksperimentet. Unn mus tidlig etter EAE induksjon (dag 7), før utbruddet av symptomene ved hjelp av valgt leveringsmåte.
    3. Offer og dissekere mus på toppen av sykdom (ca dag 15), som i trinn 3,1 og dens sub-trinn, basert på den høyeste kliniske poengsum gjennomsnitt over tid.
    4. Conduct flowcytometri på mus ryggmargen (som i trinn 3.2) for å bestemme immuncelle infiltratipå i CNS, og på milter (som i trinn 3.3) for å bestemme immun celleproliferasjon i periferien. På separate mus, for å gjennomføre immunhistokjemi (som i trinn 4) kvantifisere astrocytter og microglia, og bevaring av myelin.
  2. Unn EAE mus etter sykdomsutbruddet å avgjøre om behandling beskytter CNS etter immuncelleinfiltrasjon har oppstått.
    1. Gjenta trinn 2.1.1.
    2. Bruk SJL-mus for dette forsøk, da disse mus har målbar sykdom remisjoner. Behandle mus i løpet av den første topp i sykdom (eller, om ønsket, på toppen av et etterfølgende tilbakefall), som målt ved en gjennomsnittlig kliniske poengsummer.
    3. Sacrifice mus på et ønsket tidspunkt etter EAE induksjon. Fordi infiltrering allerede har funnet sted, vil det ikke være hensiktsmessig å måle infiltrering ved FACS-analyse. Men ta ryggmargen å kvantifisere reaktiv gliose og myelin å finne ut om det er CNS beskyttelse til tross for immuncelleinfiltrasjon.

3. flowcytometrisystemer Analysis

  1. Dissection
    1. Merk tre 15 ml koniske rør (en for hjernen, en for ryggmargen, og ett for milt) per dyr med dyrets ID og type vev som finnes. Hold alle vev i separate rør for hele prosedyren på is.
    2. For FACS-analyse av milten, ofre mus ved toppen av sykdom (~ dag 15 etter induksjon av EAE) ved anvendelse av karbondioksid med en strømningshastighet på omtrent 15% beholdervolum pr minutt i 2 - 3 min. Bekreft aktiv dødshjelp ved manglende åndedrett. Etter ofring av hver mus, fjerne milten 14 og sted i et individ, som er merket 15 ml konisk rør (fra trinn 3.1.1) inneholdende is-kald RPMI supplert med 2% FCS, 100 IU penicillin, og 100 ug / ml streptomycin ( referert til som "media" gjennom-protokollen).
    3. For FACS analyse av hjernen og ryggmargen, utføre hjerte perfusjon ved å kutte musens høyre atrium med kirurgisk saks for å frigjøre circulating blod og gjennomtrengning av venstre ventrikkel med en nål som er koblet til en sprøyte fylt med 10 ml iskald PBS. Sakte injisere 10 ml PBS.
    4. Klipp av musen hodet og gjøre et kutt opp midtlinjen av hodebunnen med kirurgisk saks. Peel huden tilbake for hånd eller med pinsett og gjøre et kutt opp midtlinjen av skallen med kirurgiske sakser, ved hjelp av inngangspunkt i ryggmargen som et utgangspunkt spot.
    5. Skrelle bort skallen med mikro tang og bruk en skje til å frigjøre hjernen. Sett hjernen i merkede 15 ml koniske rør (fra trinn 3.1.1) som inneholder media.
    6. Fjern musens hud med pinsett og kirurgiske sakser, og eviscerate musen ved hjelp av kirurgisk saks. Skjær av lemmer, hale, ribbe, og noen omliggende muskler med kirurgisk saks for å frigjøre ryggsøylen.
    7. Skjær ryggraden i ca 5 omtrent like stykker med kirurgiske sakser og klem den ene enden av ett stykke med en pinsetten, og deretter bruke en annen pinsetten to fortsette å klemme, beveger seg langs stykket inntil ryggmargen mus ut av toppen. Gjenta dette for hver del av ryggsøylen og plassere ledningene i individuelle, merket 15 ml koniske rør (fra trinn 3.1.1) som inneholder media.
  2. Vurdering av immuncelleinfiltrasjon i hjernen og ryggmargen
    1. Skjær hjerne og ryggmargen i mindre biter ved hjelp av steril saks. Knus med stempelet fra en 3 ml sprøyte i løpet av en 70 mikrometer celle sil inn i en ny 50 ml rør mens rensing av silen med media. Bringe hvert rør til et 50 ml volum med medium. Sentrifuger ved 453 xg i 5 minutter for å pelletere cellene.
    2. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 4 ml 40% densitetsgradient media. overlappe forsiktig densitetsgradient 40% inneholdende celler på toppen av 2 ml 70% tetthetsgradient i en ny 15 ml konisk rør-pipette meget langsomt på veggen av det koniske røret for å sikre god lagdeling av gradienten. Rotere ved 796 xg i 20 min ved RT medut en brems.
    3. Fjern forsiktig øvre myelin lag fra gradienten med en 1 ml overføring pipette, og deretter fjerne levedyktige celler i grensesnittet med en 1 ml overføring pipette og overfør til en ny 15 ml konisk tube. Ta tuben til 15 ml med medier og sentrifuger ved 448 xg i 10 min.
    4. Resuspender pellet i 200 ul media og fyll i en brønn av en 96-brønns rundbunnet plate (hver prøve fra hvert dyr går inn i sin egen brønn). Sentrifuger plate ved 410 xg i 5 minutter.
    5. Flick av supernatanten og resuspender pelleten i 200 pl restimulering medium (RPMI supplert med 10% FCS, 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat , og 55 uM β-merkaptoetanol, i tillegg til 50 ng / ml forbolmyristatacetat (PMA), 750 ng / ml ionomycin, og proteinet transport inhibitor Brefeldin A). Sett platen i en inkubator ved 37 ° C i 4 timer.
      MERK: PMA og ionomycin restimulering resulterer i aktivering av alle T-lymfocytter, uavhengig av deres antigenspesifisitet for å vurdere det totale antall av hver T-celle-undersett i det gitte vev. Imidlertid kan antigen-spesifikke effektor-T-celle-responser bli vurdert på forskjellige måter, blant annet restimulating celler med MOG peptid i nærvær av Brefeldin A 15,16.
    6. Vurdering av CNS CD4 + T-celle fenotyper
      1. Etter inkubering, sentrifuger 96-brønns rundbunnet plate (fra trinn 3.2.5), ved 410 xg i 5 minutter og flick av supernatant. Alle de følgende farge trinn utføres i denne plate.
      2. Vask celler i 200 ul PBS med 2% FCS og sentrifuger ved 410 xg i 5 minutter. Flick av supernatant og inkuberes cellene med 200 mL PBS inneholder 2% FCS med Fc Block (klone 2.4G2) for 10 - 15 min på is.
      3. For å begynne den ekstracellulære flekken, sentrifuger cellene ved 410 xg i 5 minutter, bla av supernatanten og resuspender pelleten i 50 &# 956; l av overflate flekk cocktail inneholdende fluoroforen merkede antistoffer mot CD4 (1: 200, 1 ug / ml), TCRβ (1: 200, 1 ug / ml), og levedyktighet fargestoff (1: 500) fortynnet i PBS i 15 min på is. Sentrifuger cellene ved 410 xg i 5 minutter og flick av supernatant. Vask cellene 2x i 200 ul PBS deretter sentrifuger ved 410 xg i 5 minutter.
      4. Etter å ha fjernet den ekstracellulære flekken, initiere intracellulære fargingsprosedyren ved fiksering / permeabilization fulgt av intracellulær farging.
        1. For å begynne, flick av supernatanten og fikse / permeabilize celler med foxp3 transkripsjonsfaktorer Fargingsreagensmidlene 17 (i henhold til produsentens anvisninger, se Materials List) for 30 min til over natten ved 4 o C.
        2. Vask celler i 150 ul permeabiliseringsbuffer fra settet og sentrifuger plate ved 410 xg i 5 minutter. Flick av supernatanten og beis celler i 50 pl permeabiliseringsbuffer med fluoroformerket-antistoffer mot IL-17A (1: 200, 1 ug / ml), IFN-γ (1: 200, 1 ug / ml), og foxp3 (1: 200, 2,5 ug / ml) fortynnet i PBS i 30 minutter på is.
        3. Sentrifuger cellene ved 410 xg i 5 minutter og flick av supernatant. For å fjerne overflødig antistoffer vaske 3x i 200 ul permeabiliseringsbuffer deretter sentrifuger ved 410 xg i 5 min. Flick av supernatant og resuspender i 200 mL PBS.
        4. Analyser cellene ved flowcytometri, gating på levende CD4 + TCRβ + -celler som beskrevet ovenfor 11 for å bedømme andelen av celler som uttrykker hvert molekyl. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer 18 eller annet godkjent metode for å bestemme antall celler per mus med hver av CD4 + T-celle-fenotyper.
        5. Ved hjelp av innhentet data, beregne prosentandel og antall CD4 + T-celler infiltrerer hjernen og ryggmargen fra hver mus, med et særlig fokus på disse befolkningsgruppene som spiller viktige roller i EAE patogenesen og beskyttelse19: IL-17A + IFN-γ -, IL-17A + IFN-γ +, IL-17A - IFN-γ +, foxp3 +.
  3. Vurdering av perifere T-celle proliferasjon og aktivering
    1. Knus milt med frostede glassplater i en 60 x 15 mm kultur parabolen. Plasser cellesuspensjon i en 15 ml konisk rør ved hjelp av media til å suspendere celler. Fyll rør til 15 ml med medier og sentrifuger cellene ved 448 xg i 5 min.
    2. Aspirer media og resuspender pelleten i 2 ml ACK lysebuffer ved romtemperatur for å lysere røde blodceller i ca. 3 min.
    3. Ta t-banen til 15 ml volum med media og press over en 70 mikrometer celle sil inn et nytt rør. Sentrifuger cellene ved 448 xg i 5 minutter, aspirer supernatanten og resuspender i 2 ml media.
    4. Vurdering av perifere CD4 + T-celledeling av Ki-67-farging
      1. Plasser en liten delmengde (vanligvis 200 pl) av eqekvivalente mengder splenocytter fra 3.3.3 til individuelle brønner (én for hver prøve) i en 96-brønns rundbunnet plate.
      2. Sentrifuger ved 410 xg i 5 minutter og flick av supernatanten. Resuspender i 200 mL PBS inneholder 2% FCS og gjenta sentrifugering. Flick av supernatanten og resuspender celler med PBS som inneholder 2% FCS med Fc Block (klone 2.4G2) og inkuberes i 10 - 15 min på is. For ekstracellulære flekken gjenta trinn 3.2.6.3.
      3. Etter å ha fjernet den ekstracellulære flekken, initiere intracellulære fargingsprosedyren ved fiksering / permeabilization fulgt av intracellulær farging.
        1. Gjenta trinn 3.2.6.4.1.
        2. Sentrifuger cellene ved 410 xg i 5 minutter og flick av supernatant. Vask cellene 1x i 200 ul permeabiliseringsbuffer fra settet og sentrifuger ved 410 xg i 5 minutter. Flick av supernatanten og flekk celler i 50 ul permeabiliseringsbuffer med anti-Ki-67-antistoff (1: 200, 1 ug / ml) i 30 min.
        3. Sentrifuger cellene ved 410 xg for 5 min og flick av supernatanten. Vask cellene 2x i 200 ul permeabiliseringsbuffer fra settet og sentrifuger ved 410 xg i 5 minutter.
        4. Flick av supernatanten og vask cellene 1x i 200 mL PBS og sentrifuger ved 410 xg i 5 min. Analyser cellene ved flowcytometri, gating på live CD4 + TCRβ + celler som tidligere beskrevet 11, deretter vurdere prosent Ki-67 + celler.
    5. Vurdering av perifere CD4 + T-celle fenotyper
      1. Plasser 200 ul celler (fra trinn 3.3.3) i en 96-brønns rundbunnet plate (en vel per prøve) og sentrifuger ved 410 xg i 5 minutter og på nytt stimulere som i 3.2.5.
      2. Plassere platen i en inkubator ved 37 ° C i 4 timer. Utfør den samme flekker prosedyre som i trinn 3.2.6 og under trinn. Analyser cellene ved flowcytometri som i 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5.

4. Immunohistokjemi end Kvantifisering

  1. tissue forberedelse
    1. Sacrifice EAE mus i et eget eksperiment fra de som brukes i trinn 3 og dens sub-trinn på noe tidspunkt etter EAE induksjon (ofte ~ dag 30, under den kroniske fasen av sykdommen i C57BL / 6 mus eller under en topp i gjennomsnitt kliniske score for SJL mus) å følge trinnene nedenfor for å fastslå omfanget av reaktiv gliose og demyelinisering.
    2. Anesthetize mus med 2,5% isofluran og 97,5% oksygen og bekrefte passende anestesidybden med en mild tå klype med tang, på jakt etter en manglende respons. Utfør transcardiac perfusjon som beskrevet i trinn 3.1.3. Etter å ha injisert PBS inn i venstre hjertekammer, bruk en ny sprøyte for å injisere 10 ml 4% paraformaldehyde i PBS. FORSIKTIG: Paraformaldehyde er en hud og lunge irriterende, kan forårsake alvorlig skade på øynene, og er mistenkt for å forårsake kreft. Unngå innånding, svelging og kontakt med hud og øyne. Perfusjon bør utføres i et avtrekksskap. Fjern hjerner og ryggvirvel kolonner som beskrevet i trinn 3.1.4 - 3.1.6. Bind ryggvirvel kolonner til pinner med hyssing for å sikre rett justering av ryggmargen.
    3. Sett hjernen i scintillasjonsglass merket med dyrets ID med ca 20 ml 4% paraformaldehyde i PBS, og ryggmargen i 50 ml koniske rør merket med dyrets ID med ca 50 ml 4% paraformaldehyde i PBS til etter fikse natten.
    4. For å cryoprotect hjerner, skyll 3 ganger i 1x PBS og oppbevar ved 4 o C i 30% sukrose i 1x PBS. La hjernen til å slippe til bunnen av beholderne (ca 3 dager).
    5. Fjern kalsium fra ryggsøylen ved å skylle den 3 ganger i 1x PBS og plassere den i et stort volum (ca. 50 ml for en mus ryggmarg) på 0,5 M EDTA i 1x PBS (starter pH vil være ~ 10; pH til ~ 7,8 med 6 N HCl) i 2 - 3 uker helt til benet ikke lenger er stiv. Cryoprotect ryggsøylen ved å følge trinn 4.1.5.
    6. Embed hjerner ogryggvirvel kolonner i oktober følgende under trinnene nedenfor så snart de faller til bunnen av beholderne.
      1. Lag en blanding av 1 del 30% sukrose i 1x PBS og 2 deler oktober (for eksempel legge til 15 ml 30% sukrose i 1x PBS til 30 ml OCT).
      2. Legg oktober / sukrose blandingen til embedding mold (22 x 22 x 20 mm for hjerne og 22 x 30 x 20 mm for ryggmargen) til den er ca ½ full.
      3. Skjær ryggvirvel kolonner inn i 6 like store biter ved hjelp av et barberblad og plasser i en 22 x 30 x 20 mm embedding mold vendt forover for koronale ryggmarg seksjoner. Plasser hele hjernen til 22 x 22 x 20 mm muggsopp vendt fremover.
      4. Legg oktober / sukrose blanding til å dekke vev og la den sitte i en time. så bobler kan slippe ut. I løpet av denne hr, tilsett 2-methylbutane til en rett som kan holde innebygging former for flash-frysing. Sett fatet på tørris og dekk til pre-cool.
      5. Flash-fryse formen i to-methylbutane på tørris og oppbevares ved -80 o C innsiden av acontainer for å unngå dehydrering.
    7. Når du er klar, seksjon vev ved 16 mikrometer med en cryostat og montere på elektrostatisk ladede lysbilder. Sett hver 10. seksjonen på et lysbilde hver for hjernen og ryggmargen (for eksempel ved å skyve en vil ha §§ 1, 11 og 21, og skyv 2 vil ha del 2, 12 og 22, og så videre). Oppbevares lysbilder ved -80 ° C eller bruk med en gang for farging.
  2. Farging av reaktiv gliose og myelin
    1. Når du er klar til farging, velge ett lysbilde hver for hjernen og ryggmargen per flekken for alle dyr i samme (eller så likt som mulig) region. For hjernen, velge lysbilder som viser corpus callosum og cingulum bunt.
    2. Sted glir med vev på en varmeblokk ved 70 ° C i 7 minutter. Etter 7 min slå av varmen blokken og la lysbildene kjølig på varme blokk for en annen 10 - 15 min. Dette vil hindre vevssnitt fra å falle av lysbildene under fargingsprosedyren.
    3. Vask glir 3 ganger hver i 1x PBS med 0,1% ionisk vaskemiddel (for intracellulære antigener) eller 1x PBS (for antistoffer rettet mot overflateantigener) i 5 min.
      MERK: Siden antistoffene som anvendes i denne protokollen er intracellulære, vil ikke-ioniske vaskemidler brukes i påfølgende trinn. La aldri lysbilder tørke helt etter dette trinnet.
    4. Plasser lysbilder i en beholder og dekk med citratbuffer pH 3,0. For å gjøre citrat-buffer, tilsett 0,192 g vannfri sitronsyre til et sluttvolum på 100 ml i vann. Juster pH med eddiksyre hvis over pH 3,0 eller NaOH hvis nedenfor.
    5. Inkuber objektglass ved 37 ° C i 30 minutter og vaskes 3 ganger i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk vaskemiddel i 5 minutter.
    6. Circle et område rundt vevet med en hydrofob barriere penn og plassere lysbilder i en fuktet kammer (for eksempel et lysbilde boks som inneholder våt papirhåndklær). Legg blokkeringsbuffer til vevet. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
      MERK: Blokkering buffer består av 1x PBSpluss 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel og det passende serum (5%), basert på verten av det sekundære antistoff, dvs. hesteserum for myelin basisk protein (MBP) og glial fibrillært surt protein (GFAP), og geiteserum for Iba1.
    7. Flick blokkeringsbuffer av lysbildene og tilsett primære antistoff (1: 1000 eller 0,2 ug / ml geite-anti-myelin basisprotein for oligodendrocytter, 1: 1000 eller 1 pg / ml til 3 ug / ml muse-anti-GFAP for astrocytter, eller ett : 750 eller 0,67 ug / ml kanin-anti-Iba1 for mikroglia) fortynnet i den respektive blokkerende buffer (se trinn 4.2.6) til sirklet området. La det 4 o C over natten i fuktet kammer.
    8. Flick antistoff i blokkeringsbuffer av lysbildene og vaske objektglassene 3 ganger i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk vaskemiddel i 5 minutter.
    9. Legg sekundært antistoff (1: 200 eller 7,5 ug / ml biotinylert heste anti-mus for MBP og GFAP, eller biotinylert geite-anti-kanin for Iba1) fortynnet i den respektive blokkerende buffer (se step 4.2.6) til sirklet området og la lysbilder å inkubere i fuktet kammer i 1 time ved RT.
    10. Flick antistoff i blokkeringsbuffer av lysbildene og vaske objektglassene 3 ganger i 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk vaskemiddel i 5 minutter.
    11. Forbered avidin-biotin-peroksidase kompleks (ABC) i immunoperoxidase (se materialer liste) 30 min før bruk og agitere på en shaker inntil nødvendig i 4.2.12. Legg 0,3% H 2 O 2 i metanol for å sirklet området i 10 minutter for å stanse endogen peroksidaseaktivitet.
    12. Flick oppløsning av lysbildene og vask i 2 ganger i 1 x PBS eller 1 x PBS med 0,1% ikke-ionisk vaskemiddel i 5 minutter, deretter en gang i 1 x PBS. Legg ABC-reagens til den sirklet område i 30 minutter.
    13. Flick løsning av lysbilder og vask 3 ganger i 1x PBS i 5 minutter, deretter 2 ganger i vann i 5 min. Gjør 3,3'-diaminobenzidin (DAB) løsning (se Materialer List) og legge den til å dekke deler.
      MERK: Dette trinnet krever et mikroskop for å observere optimal oppdageion tid for farging og må gjøres for samme mengde tid for objektglass som skal sammenlignes.
    14. Vask glir 3 ganger i vann i 5 minutter hver. Dehydrere vevet ved å plassere i de følgende løsninger i 2 min hver: 70% etanol i vann, 95% etanol i vann, 100% etanol i vann, 50% xylen og 50% etanol, 100% xylener. Forsegle en dekkglass på lysbildet med et harpiksholdig monteringsmedium.
    15. Alternativt kan utføre immunofluorescerende flekker som tidligere beskrevet, 11 for å vurdere reaktiv gliose anvendelse av antistoffer mot Iba-1 og GFAP.
    16. Ta bilder av hver ryggmarg seksjon (farget med respektive antistoffer som bruker DAB) med en 4X, 0,13 NA objektiv og lagre bildene som .tiff. Alternativt kan du ta bilder av corpus callosum og cingulum bunt i venstre eller høyre hjernehalvdel ved hjelp av en 20X, 0,50 NA objektiv og lagre bildene som .tiff. For en mer omfattende bestemmelse av lesjon last i hjernen, er det fordelaktig å inkludere både hemispheres i analysene.
  3. Måling gjennomsnittlig brøkdel område for reaktiv gliose (Iba1 og GFAP farging)
    1. Last ned NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) og åpne på en datamaskin. På ImageJ programvare, bruk menyen strengen Fil> Åpne, og velg et bilde fra trinn 4.2.16. Tegn et område ved hjelp av "Polygon valg" verktøy på menylinjen. For ryggmargen, spore hele delen; for hjernen, corpus callosum og cingulum bunt. Konverter bildet til 16-bit ved å gå til Image> Tekst og klikke på "16-bit."
    2. De-støy på bildet ved å gå til prosess> Trekk Bakgrunn og sette "Rolling ball radius" til minst størrelsen på den største gjenstand som ikke er en del av bakgrunnen (se ImageJ brukerhåndboken på http: //rsbweb.nih gov / ij / docs / guide / 146-29.html).
      MERK: For en 4X bilde av Iba-en farging bruker vi 4,0 og for GFAP vi bruker 50,0, men disse tallene kan variere avhengig av bildeforstørrelsen og farging intensity.
    3. Sjekk "Sliding hyperbolsk paraboloide" og klikk "OK". Gå til Image> Adjust> Threshold ... og sette lavere terskelnivået (øverst) ved hjelp av glide barer. Ta bare flekker som er mobil og være konsekvent på tvers av bilder. For bilder med mørk bakgrunn (gjelder fluorescerende flekker bare), sikre at "Dark bakgrunn" er merket av.
    4. Gå til Analyser> Set Målinger ... og velg "Area brøkdel" (gir prosent av terskelområdet i regionen av interesse). Sørg for at «Begrens til terskel" er ukontrollert og "Display label" er merket. Klikk "OK" når du er ferdig.
    5. For å oppnå målene, gå til Analyze> Mål. En "Resultater" popup boks vises, og disse dataene kan lagres som er eller kopiert til et annet program. For analyse, sammenligne "Område brøk" verdier mellom behandlingsgruppene.
  4. Kvantifisering av MBP farging av optical tetthet
    1. Åpne bildet og tegne et område av interesse som beskrevet i trinn 4.3.1. Gå til Analyser> Set Målinger ... og velg "Mean grå verdi" (summen av gråverdier innenfor valg dividert på antall piksler). Sørg for at «Begrens til terskel" er ukontrollert og "Display label" er merket. Klikk "OK" når du er ferdig.
    2. For å oppnå målene, gå til Analyze> Mål. Observere en "Resultater" popup boks. Kopier disse dataene og lagre som er eller kopiere inn i et annet program.
    3. For analyse, kopiere og lime inn verdier i et annet program. Konvertere midlere grå verdi i optisk tetthet (OD) ved hjelp av formelen: OD = log 10 (255 / bety grå verdi).

Representative Results

Her brukte vi to modeller av EAE å forstå hvis en farmakologisk middel gir CNS beskyttelse ved enten å dempe CNS-infiltrere T-celler eller hindre myelin og aksonal skade under angrep av inflammatoriske immuncelleinfiltrasjon. For å bestemme om et terapeutisk middel hindrer immuncelleinfiltrasjon inn i ryggmargen, er C57BL / 6 mus modell for kronisk EAE anvendes hvor immuncelleinfiltrasjon og sykdomspatologien hovedsakelig lokalisert i ryggmargen (figur 1A). For å bestemme om et terapeutisk legemiddel gir CNS beskyttelse under inntrengning av immunceller inn i CNS, i SJL dyremodell av remitterende EAE anvendes, noe som viser sykdomspatologien både i hjernen og ryggmargen (figur 1B).

kliniske vurderinger

Relevante kliniske vurderinger er gjort i henhold til følgende rubrikken for typisk (figur 1C) eller atypisk (figur 1D) EAE. For typisk klinisk sykdom, en score på 0 er ingen unormal atferd. Når plukket opp av haleroten, kan halen rotere hurtig (omtrent som en helikopterrotor) og bakbena vil spre seg fra hverandre. En klinisk score på 1 er en delvis slapp hale, som kan bestemmes ved å løfte musa ved haleroten. Den normale helikopterlignende roterende kan bli svekket eller fraværende, og en del av halen kan være helt slapp. En nyttig måte å fastslå omfanget av hale lammelse er å kjøre en finger opp lengden av halen, som en unparalyzed hale vil vanligvis krølle rundt fingeren mens en delvis lammet hale vil være ute av stand til å gjøre det. En klinisk score på to representerer en helt lammet hale. Ingen bevegelse av halen forekommer i det hele tatt når rørt musen opp ved haleroten. En klinisk score på tre representerer delvis hind lem lammelse. Fastsettelse av denne poengsummen krever at musen være fri til å bevege seg på en flat overflaten. Hvis en hind lem er å dra som musen beveger seg fremover, eller hvis en eller begge bakbena ser ut til å være delvis lammet, kan en score på 3 gis. En klinisk score på 4 representerer komplett hind lem lammelse. Med dette resultatet, vil en mus være ute av stand til å flytte sin bakbena og vil dra seg frem ved hjelp av sine foran lemmer. En klinisk score på 5 representerer en døende mus eller en mus med vanskeligheter med å bevege seg på tvers av buret sitt eller puste. Hvis en mus ikke kan flytte seg langs bunnen av buret, eller hvis dens pust er anstrengt, bør mus humant avlives. En klinisk score på 6 representerer en mus funnet død i buret sitt. En score på 6 er uvanlig og dødsårsaker enn EAE bør undersøkes.

Atypisk klinisk sykdom kan eller ikke kan være ledsaget av lammelse. Det kan være nødvendig å ta med to separate scoring systemer hvis en mus presenterer med atypisk sykdom pluss typiske symptomer. En score på 0 er ingen unormal atferd, ens med den typiske scoring system. En klinisk score på en representerer en liten hode sving eller tilt mens musen er å vandre. Dette kan bestemmes ved at musen til å gå frem og observere en konstant venstre eller høyre retningen for sin bevegelse. En klinisk score på 2 representerer en mer markert hode sving og dårlig rettende evne. Som med en atypisk score på 1, har musen retningen for sin bevegelse og kan ha liten problemer med balansen. En klinisk score på tre representerer en manglende evne til å gå i en rett linje. Musen vil ha problemer med å balansere og kan bruke den siden av buret for å hjelpe akkurat seg selv som det går. En klinisk score på 4 representerer en mus liggende på sin side, ute av stand til å gå på grunn av balansering problemer. Musen kan være i stand til å dra seg langs bunnen av buret, men kan ha retningen for sin bevegelse. En klinisk score på 5 representerer kontinuerlig rullende mindre støttes. En mus som når dette resultatet bør bli humant avlivet. En klinikkal score på 6 representerer en mus funnet død i buret sitt. En score på 6 er uvanlig og dødsårsaker enn EAE bør undersøkes.

Det kan være nødvendig å tillate "i mellom" score, f.eks legge 0,5 til en score hvis en mus tilstand endres litt, eller hvis du velger mellom to score er vanskelig. For eksempel vil en mus som begynner bevege seg saktere enn sine normale kolleger, men viser ingen lammelser, eller en mus som hekter bakbena med fronten i stedet for utsyinging bena ut når plukket opp av halen kan gis en score på 0,5 . En mus som bare kan flytte seg langs bunnen av buret og er bare i stand til å nappe sine bakben periodisk eller ved berøring kan bli gitt en score på 3,5.

Vurdere en reduksjon i immuncelleinfiltrasjon

Etter induksjon av EAE i C57BL / 6 mus-modellen (figur 1A, dag 0), antigen presentatipå og proliferasjon av T-celler i milten oppstå på dagene 1 - 5, etterfulgt av immuncelleinfiltrasjon inn i CNS rundt dag 7. Omtrent 3 til 5 dager etter den innledende immuncelleinfiltrasjon mus stede med kliniske poengsummer. For å vurdere om et terapeutisk middel som blokkerer immuncelleinfiltrasjon inn i ryggmargen, blir legemidler eller kjøretøy innført på dag 7 etter at antigen presentasjon og proliferasjon i milten, men før immunceller begynner å infiltrere inn i ryggmargen. Dersom immuncelleinfiltrasjon er blitt svekket, bør det kliniske sykdomsforløpet reflektere forbedrede kliniske mål under den stigende fase av sykdommen fra dagene 10 og 15 (figur 2).

En reduksjon i immuncelleinfiltrasjon vil også resultere i redusert nevroinflammasjon. Reaktiv astrocytosis og microgliosis anses viktige kjennetegn for nevroinflammasjon. Farging for astrocytter med GFAP og mikroglia med Iba-en kan så brukes til å vurdere Changes i gjennomsnittlig areal brøkdel flekker å kvantifisere nevroinflammasjon (figur 3).

For å bestemme om immuncelleinfiltrasjon er redusert, blir ryggmarg fjernet og behandlet for strømningscytometri-analyse ved toppen av sykdom (figur 1A, ca dag 18). Dette sikrer at det største antallet immunceller har inngått ryggmargen. Inngang fra T-celler i CNS er regnet som den initiere inflammatorisk hendelse og både Th1 og Th17 celler er funnet i dyremodeller av EAE samt MS-pasienter. Tatt sammen, bør flowcytometrisk analyse omfatte vurdering av begge typer patogene T-celler. Videre Tregs er godt karakteriserte suppressor-T-celler som demper sykdom. Derfor må prosentandelen av Tregs fra en total CD4 + populasjonen bli evaluert i forhold til prosentandelen av effektor T-cellepopulasjoner. Dette vil avsløre om en samlet reduksjon i T-celle-infiltrering har funnet sted, eller hvis ndree er en forskyvning av T-celle-fenotyper i CNS. Representative prikkplotter (Figur 4A) viser en reduksjon i samlet antall CD4 + infiltrerende T-celler i ryggmargen fra narkotika-behandlede mus sammenlignet med ryggmargen fra kjøretøy-behandlede mus (tall i øvre høyre kvadrant). For å evaluere Th1, Th17, og treg celler følgende signatur proteinene blir evaluert: IFN-γ + IL-17 +, og foxp3 +, henholdsvis og bør reduseres (figur 4A). Statistisk analyse bør utføres på CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, og foxp3 + celletall å vise til en betydelig reduksjon (figur 4B). For å utelukke en forskyvning av T-celle-undergrupper, statistisk evaluering av andelen av IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17 -, IL-17 + IFN-γ -, og foxp3 + -celler blir utført ( Fifigur 4C).

For å eliminere muligheten av at en reduksjon i CNS-infiltrerende T-celler er et resultat av inhibering av proliferasjon, aktivering, differensiering og i periferien, trenger antall aktivt prolifererende T-celler, i tillegg til andelen av T-celle-undertyper som skal evalueres. Ingen endring i prosentandelen av CD4 +, IFN-γ + IL-17 +, eller foxp3 + bør finnes hvis aktivering og differensiering er upåvirket (figur 5A). Videre bør ingen endring i Ki67 + CD4 + celler funnet hvis proliferasjon er upåvirket (figur 5B). Medikamentbehandlinger er innført på dag 7 eller senere for å unngå å forandre initiale antigen presentasjon og T-celleaktivering i periferien. Men i genetiske modeller proteiner blir ofte slettet konstitutivt under embryogenese eller indusert før induksjon av EAE lage splenocytt assevurdering av stor betydning.

Vurdere CNS Protection

For å demonstrere om en bestemt terapeutisk middel modulerer sykdom patologi i CNS etter immun celle infiltrasjon, bør legemiddel intervensjoner gis under den første toppen i klinisk sykdom scoring. Den SJL modell av EAE er en fordel for disse eksperimentene siden disse musene viser en relapsing-remitting fenotype. Dersom et medikament behandling forebygger myelin-axon degenerasjon, vil en forbedring i kliniske poengsummer bli observert (figur 6). Patologisk vurdering av myelin må bekrefte en reduksjon i myelin skader forenlig med forbedrede kliniske score. Å kvantitativt vurdere myelin integritet, DAB farging av myelin basisk protein (MBP) er utført, etterfulgt av statistisk analyse av den optiske densitet for farging (figur 7). For ytterligere å underbygge at nevroinflammasjon opprettholdes eller reduseres med therapeutic intervensjoner, kan reaktivt gliose vurderes ved å måle midlere fraksjon område for reaktiv gliose som beskrevet ovenfor (figur 3). For å underbygge at en terapeutisk intervensjon er direkte beskytter CNS uten immunmodulerende effekter, må demping av immuncelleinfiltrasjon inn i CNS og spredning i milten bli diskontert. For å løse dette, bør fremgangsmåter for hjerne og ryggmarg vurdering av immuncelleinfiltrasjon og vurdering av perifere T-celle proliferasjon og aktivering utføres som beskrevet ovenfor (figur 4 og 5). Tatt sammen, terapeutiske midler som blokkerer celleskade i CNS uten tegn på en reduksjon i CNS-infiltrerende T-celler eller proliferasjon av T-celler i periferien er CNS-beskyttende behandlinger.

Figur 1
Figur 1. Representant RESUlts Kliniske Resultater fra EAE i C57BL / 6 og SJL-mus. (A) Kliniske score (gjennomsnitt ± SEM) fra C57BL / 6-mus (n = 10) indusert med MOG 35-55 for å fremstille EAE med kronisk sykdom. (B) Kliniske score (gjennomsnitt ± SEM) av SJL mus (n = 3) indusert med PLP 139-151 å produsere EAE med relapsing-remitting sykdom. (C) Den kliniske scoring rubrikken brukes til å spore typiske sykdomsprogresjon i EAE mus. (D) Den kliniske scoring rubrikken brukes til å spore atypisk sykdomsprogresjon i EAE mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 2. Farmakologisk behandling før immuncelleinfiltrasjon i C57BL / 6 mus med EAE. 35-55. Dataene er hentet fra tre sammenslåtte uavhengige eksperimenter. Statistisk forskjell ble bestemt ved anvendelse av en ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney U-test, * p <0,05. Re-print med tillatelse fra (11).

Figur 1
Figur 3. Immunofluorescent Farging og Kvantifisering av reaktiv gliose i ryggmargen av kontroll, EAE, og behandles C57BL / 6 mus. (A) Fluorescent merking for GFAP (astrocytter) og Iba-1 (microglia) i ryggmargen for kontroll (ikke-immunisert ) mus (venstre panel) og EAE mus behandlet med PBS (midterste paneler) eller SAS (høyre panel). Scale bar = 100 mikrometer. Kvantifisering av farging ble bestemt ved hjelp av området brøkdel teknikk for å måle prosent immunoutfellingsositive område for GFAP (B) og Iba-1 (C). Gjennomsnitt ± SEM, n = 3 kontroll, n = 3 SAS-behandlet, eller n = 4 PBS-behandlede mus, 6 snitt per mus. Statistiske forskjeller ble bestemt ved anvendelse av en enveis ANOVA, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Re-print med tillatelse fra (11). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 4. FACS Analyse av EAE C57BL / 6 mus ryggmargen demonstrere Redusert T-celle infiltrasjon i behandlede mus. C57BL / 6 mus ble behandlet med SAS eller PBS, som begynner 7 d postinduction av EAE. Ryggmargen ble oppnådd på dag 15. (A) Representative prikkplott viser Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) og Th17 (IFN-γ- / IL-17 +) celler i CD4 + port (øvre panel) og T-regulerende celler (foxp3 +) (nedre paneler). Prikkplott viser prosenter i øvre høyre kvadrant. (B) Absolutte tall av CD4 + celler, så vel som IFN-γ +, IL-17A +, og foxp3 + celler ble statistisk analysert. (C) Den endring i prosentandelen av T-cellepopulasjoner mellom-SAS og PBS-behandlede mus EAE ble også undersøkt. Gjennomsnitt ± SEM, n = 10 for PBS-behandlede, og n = 9 for SAS behandlede fra to uavhengige eksperimenter. Tosidige t-test ble anvendt for alle søylediagrammer. ** P <0,01. Re-print med tillatelse fra (11). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 5. FACS Analyse av EAE C57BL / 6 mus Milter gir tilsvar T-celle Expression Profiler og spredning i behandlede og ubehandlede mus. Milter fra PBS og SAS-behandlede mus ble analysert 15 d postinduction av EAE. (A) Prosentandelen CD4 + T-celler, Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), Th17 (IFN-y - / IL-17 +), og T regulatoriske celler (foxp3 +) i milter fra PBS- behandlet (n = 10) og SAS behandlede pasienter (n = 9) mus fra to uavhengige eksperimenter. (B, venstre panel) Prosentandelen av Ki-67 + celler i CD4 + populasjonen fra naive milt (n = 4) så vel som fra PBS (n = 5) og SAS-behandlede mus (n = 5) indusert med EAE. En enveis ANOVA testen viste statistisk signifikant sammenheng mellom andelen av Ki-67 + celler fra naive spleens sammenlignet med enten PBS eller SAS-behandlede EAE milten. Ingen signifikans ble observert mellom PBS og SAS-behandlede EAE milten. (B, panel høyre) Representative dot tomter; Tallene angir andelen av spredning. Prikkplott viser prosenter. Søylediagrammer representerer tosidige t test, *** p <0,001. Re-print med tillatelse fra (11). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 6. Farmakologisk behandling etter immuncelleinfiltrasjon i SJL-mus med EAE. Kliniske score (gjennomsnitt ± SEM) av SJL-mus behandlet med PBS (n = 8) eller SAS (n = 8) fra dag 24 postimmunization (stiplet linje) med PLP 139-151. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av kliniske score. Statistisk forskjell ble bestemt ved anvendelse av en ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney U-test, *** p <0,001. Topplinjen representerer verdier som brukes for statistiskanalyse. Re-print med tillatelse fra (11).

Figur 1
Figur 7. Kvantifisering av MBP Farging ved hjelp av optisk tetthet. (A) Representant farging av MBP i thorax ryggmargen fra en uspesifisert genetisk knockout mus sammenlignet med kull kontroll C57BL / 6 mus indusert med EAE. Bracket indikerer representant område med redusert MBP flekker indikerer demyelinisering. (B) MBP farging av thorax ryggmargen fra en uspesifisert genetisk knockout C57BL / 6 mus. (C) uspesifiserte genetiske knockout-mus indusert med EAE (KO; n = 6 mus, 2 - 4 lumbale og thorax snitt per dyr) oppviser en høyere optisk tetthet (OD) av MBP farging i ryggmargen enn villtype (WT; n = 3 mus, 2-4 korsrygg og thorax snitt per dyr) mus indusert med EAE. Statistisk analysert USIng en to-halet t-test, * p <0,05. Feilfelt representerer SEM. Scale bar 100 mikrometer.

Discussion

Pasienter med MS fortsetter å oppleve sykdoms tilbakefall mens du tar medisiner som demper T-celleaktivering og / eller infiltrasjon i CNS, beret utvikling av behandlingstilbud som direkte beskytter CNS. EAE har klassisk vært brukt til å modellere symptomer på MS og kan være et kraftig verktøy når man studerer naturen av interaksjoner mellom immunsystemet og CNS in vivo. Ved hjelp av timing av behandlings hensyn i EAE, for eksempel, før eller etter initiering av sykdom, i forbindelse med å undersøke immuncelleinfiltrasjon i CNS og proliferasjon og aktivering i periferien, er det mulig å avgrense effektene av behandlingene på både immunsystemet og CNS.

Mens EAE i C57BL / 6 mus er mer allment brukt, kan EAE i SJL mus være mer representative for flertallet av MS tilfeller, som disse musene har relapsing-remitting fenotype og infiltrasjon av immunceller i parenchymaav hjernen 10. SJL mus har klart bedring i løpet av remisjon i tillegg, noe som gjør det mulig å starte behandling etter at sykdommen har presentert, men i tider med redusert betennelse. Det er viktig å tenke på at SJL mus ikke alltid tilbakefall og tilbakeføre synkront, noe som resulterer i potensielt stor variasjon når resultatene er samlet. Derfor kan noen forskere velger å vise representative resultater for kliniske score fra ett dyr mens du tar mus for FACS analyse og histologi på individualisert punkter i sykdomsprogresjon.

Tatt i betraktning når manipulasjoner er gjort for å EAE mus kan bistå i bestemmelse av hvordan en behandling påvirker immunsystemet eller CNS. Det er mange alternativer for når behandlingen starter, hver med sin egen konnotasjon for om immunceller har kommet inn i CNS og hvordan de kan være i samspill med CNS. Behandling før symptomene innebærer at immunceller ennå ikke har skrevet eller forårsaket skader på sentralnervesystemet.Behandling etter symptomdebut innebærer at immunceller har kommet inn i CNS og har forårsaket noen skade. Ved hjelp av SJL-mus, behandling kan også begynne i løpet av et tilbakefall, hvor immunceller er aktivt infiltrering og forårsaker betennelse, eller i løpet av remisjon, hvor immunceller kan være mindre utbredt i CNS med mindre betennelse. Innledende hypoteser om hvordan behandlinger påvirker CNS og immunsystem kan gjøres når de vurderer hvor immunceller er i patologisk prosess under behandlingen.

Det finnes en rekke måter på hvilke behandlinger som kan påvirke immunceller og sentralnervesystemet, hver med resultatet av å redusere alvorligheten av EAE symptomer. Derfor er det nødvendig å bruke flowcytometrisk analyse og immunhistokjemi for å se på hvordan immuncellene blir påvirket i periferien og CNS, hvorvidt immunceller som har kommet inn i CNS, og hvor CNS reagerer på behandling. Mens flowcytometrisk analyse av ryggmargen kan bestemme hvor mange celler hahar kommet inn i CNS på et gitt tidspunkt, kan man ikke fastslå at denne effekten skyldes redusert immuncelletrafikken med mindre spredning av immunceller er upåvirket i milten. Det er derfor nødvendig å analysere både perifer og CNS vev og bestemme hva resultatene betyr mechanistically når begge vev sammenlignes. Det er også mulig for immunceller aktivitetsprofiler som skal endres ved behandling, for eksempel med en bryter i en sykdomsfremkallende hjelper-T-celle-tung profil til en regulatorisk T-celle-tung profil. Ser vi på markører for forskjellige celletyper og sammenligner prosent ekspresjon mellom behandlede og ubehandlede dyr er derfor også en viktig faktor. En voksende konsept i MS forskning antyder at B-celler spiller en viktig rolle i autoimmune demyelinisering. Dette er basert på studier som viser at B-celler er nødvendig for reaktivering av T-celler 20. Dette konseptet er støttet av suksessen til behandlinger som rituximab, et antistoff mot CD20 extrykket på overflaten av B-celler 21,22. Som demonstrert av suksessen til monoklonalt antistoff ocrelizumab i kliniske studier, kan medisiner rettet mot ulike epitoper av CD20 forbedre effekten av B-celle-rettet terapi 23.

En begrensning av teknikkene som presenteres her er at det er mulig for immunceller til å gå inn i CNS, men være ute av stand til å reise i parenchyma. Immunhistokjemi kan brukes til å detektere perivaskulær cuffing av immunceller og evaluere distanse i parenchyma mellom behandlede og ubehandlede dyr. En annen potensiell begrensning innebærer virkningene av mikrobiomer på EAE patogenesen. Commensal gut microbiota kan sterkt påvirke sykdom patogenesen 24; derfor mus plassert i ulike kolonier og selv i forskjellige bur kan ha store forskjeller i sykdommens alvorlighetsgrad. Følgelig er det alltid å foretrekke der det er mulig å bruke kull kontroller oppvokst i samme bur forforsøk med EAE. Helt til slutt er at hvis det er ønskelig eksperimentelt for å eliminere virkningene av immun celleproliferative endringer i periferien, kan det være mulig å gjøre dette ved hjelp av passiv overføring induksjon i stedet for den aktive induksjon som er beskrevet i denne protokollen.

Ytterligere bekreftelse for neurobeskyttelse kan oppnås ved hjelp av en ko-kultursystem 11 for å teste bestemte mekanismer for celledød eller gjennom bruk av betinget knockout-mus som gjør det mulig for sletting av proteiner selektivt på en celletype. Videre, for å forlenge utforskningen av farmakologiske midler som er neurobeskyttende, bør markører for aksonal transeksjon og neuronal død inkluderes. Et annet viktig område er remyelinisering. Skadde aksoner ikke klarer å remyelinate utlån ytterligere støtte at nervecellene behandling bør være en viktig del av Remyelinering terapi. I tillegg unmyelinated aksoner er mer utsatt for skader enn myelinated aksoner. Dette tyder på at når et akson blir demyelinerte terapeutiske intervensjoner som fremmer rettidig remyelinisering vil hindre aksonal skade. For å utforske disse veier, kan andre in vivo-modeller for demyelinisering og remyelinisering brukes (dvs. cuprizone og Lysolecithin). Fremgangsmåten beskrevet her fokusert på å vurdere neurobeskyttelse ved å kvantifisere myelin tap. For evalueringen av remyelinisering antall stamceller samt deres evne til å spre seg og modnes vil også være viktig å undersøke. Med omtale av disse alternative modeller, må man også vurdere ulike modeller for hjernebetennelse som er viralt mediert. Det er to velkarakteriserte RNA-virus-modeller som produserer myelin tap: en er Theiler s murine encefalomyelitt, et ikke-omhyllet Picornaviridae-virus, og den andre er mus hepatitt virus, et medlem av virusfamilien Coronaviridae 25,26.

EAE er et verdifullt verktøy for studies av hvordan manipulering eller behandlinger effekt på immunsystemet og sentralnervesystemet in vivo. Protokollen er beskrevet her kan bidra til å bestemme hvor behandlinger påvirker sykdomsprosessen, enten det er i periferien, i blod-hjerne-barrieren, eller i CNS. Ingen nåværende behandlinger for MS kurere sykdommen og pasientene ofte opplever nedgang over tid. Tilsvarende andre sykdommer som involverer immuncelleinfiltrasjon inn i CNS og nedbrytning av myelin, inkludert akutt disseminert encefalomyelitt, tverrgående myelitt, og neuromyelitt Optica, mangel behandlinger som beskytter CNS som det er direkte under angrep ved å infiltrere immunceller. Tatt i betraktning den tidspunktet for behandling og bruk av strømningscytometrisk analyse av milten og ryggmargen i forbindelse med immunhistokjemi i CNS for å vurdere inflammasjon og skade vil gi rom for mekanistiske bestemmelse gjøres angående behandlinger.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av ninds P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, The Civitan International Research Foundation, The Mike L. Jezdimir transvers myelitt Foundation, The University of Alabama Health Services Foundation - Generelt Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, og T32 AI007051 fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9719245
22 x 30 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9531194
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific  21985-023
2-Methylbutane Fisher Scientific O3551-4
30 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific 18-30
ACK Lysing Buffer Quality Biological 118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7 BD Biosciences 552775 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Foxp3-FITC eBioscience 11-5773-82 0.5 mg/ml stock concentration
anti-GFAP (Cocktail) Biolegend 835301 1 - 3 mg/ml stock concentration
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg) Wako 019-19741 0.5 mg/ml stock concentration
anti-IFN-γ APC eBioscience 17-7311-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-7177-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Ki-67 PE eBioscience 12-5698-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-MBP (D-18) Santa Cruz Biotechnology sc-13912 0.2 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ FITC eBioscience 11-5961-85 0.5 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ PE eBioscience 12-5961-83 0.2 mg/ml stock concentration
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Vector Labs BA-1000 1.5 mg/ml stock concentration
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG Vector Labs BA-2000  1.5 mg/ml stock concentration
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% Fisher Scientific AC42356-5000
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% Fisher Scientific AC446085000
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 Fisher Scientific 12-550-15
Golgi Plug BD Biosciences 555029 protein transport inhibitor
Immedge Hydrophobic Barrier Pen Fisher Scientific NC9545623
Ionomycin EMD Millipore 407952-5mg
L-Glutamine, 100x Corning 25-005-Cl
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-Cl
Near IR Live/Dead Staining Kit Life Technologies L10119 viability dye
Normal goat serum Vector Labs S-1000
Normal horse serum Vector Labs S-2000
Paraformaldehyde, 96% Fisher Scientific AC416785000
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 density gradient
Permount Fisher Scientific SP15-500 resinous mounting medium
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1mg
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody BioLegend 808401
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
Sodium Pyruvate Corning 25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 nonionic detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) Fisher Scientific NC9206402 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase 
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) Fisher Scientific NC9276270 DAB solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide. Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).
  2. Yednock, T. A., et al. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature. 356, 63-66 (1992).
  3. Ridge, S. C., et al. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone. Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).
  4. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).
  5. Kuerten, S., et al. MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum. J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).
  6. Brownell, B., Hughes, J. T. The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).
  7. Kidd, D., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis. Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).
  8. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).
  9. Geurts, J. J., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology. AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).
  10. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130, 2816-2829 (2007).
  11. Evonuk, K. S., et al. Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination. J Immunol. 195, 450-463 (2015).
  12. Rowse, A. L., et al. Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling. PloS one. 7, e52658 (2012).
  13. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. , (2014).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. , (2015).
  15. McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE. J Neuroinflammation. 12, 128 (2015).
  16. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. , (2012).
  17. Law, J. P., et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).
  18. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  19. Korn, T., et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature medicine. 13, 423-431 (2007).
  20. Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system. Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).
  21. Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).
  22. Bar-Or, A., et al. Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial. Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).
  23. Kappos, L., et al. Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet. 378, 1779-1787 (2011).
  24. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  25. Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
  26. Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis. The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).

Tags

Immunologi nevro sentralnervesystem beskyttelse autoimmune demyelinisering eksperimentell autoimmun encefalomyelitt T-celle oligodendrocyte myelin multippel sklerose
Bestemme Immune System Suppression versus CNS Beskyttelse for farmakologiske tiltak i Autoimmune Demyelinisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evonuk, K. S., Moseley, C. E.,… More

Evonuk, K. S., Moseley, C. E., Doyle, R. E., Weaver, C. T., DeSilva, T. M. Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination. J. Vis. Exp. (115), e54348, doi:10.3791/54348 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter