Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sammenligning af tre forskellige metoder til bestemmelse celleproliferation i brystcancercellelinier

Published: September 3, 2016 doi: 10.3791/54350
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

Introduction

Tumorsuppressorgenet, p53, er en væsentlig regulator af en række cellulære processer, herunder cellecyklusstop, apoptose og senescens 1. Den er ansvarlig for at opretholde genomisk stabilitet, og er derfor afgørende for at opretholde balancen i celledød og cellevækst. Mutationer i p53 er almindelige i kræft og er den væsentligste årsag til p53-inaktivering fører til ukontrolleret cancercelleproliferation 2. Interessant mutationer i p53 kun udgør omkring 25% af brystcancere 3, hvilket antyder, at andre mekanismer er ansvarlige for tab af p53-funktion. De nyligt opdagede p53-isoformer er blevet vist at være overudtrykt i en række humane cancere, og kan modulere p53-funktion 4,5. Vi har tidligere vist, at p53-isoform, Δ40p53, er den mest højt udtrykt isoform i brystcancer, og er signifikant opreguleret i brystcancerceller, sammenlignet med normale tilstødende Tissue 6. Efter dette, vi stabilt transduceret human brystcancer MCF-7 at overudtrykke Δ40p53 hjælp LEGO-IG2-puro + vektor (GFP +) 7. Disse celler blev anvendt til at undersøge, om høj Δ40p53 ekspression øger celleproliferation satser i brystcancerceller.

Der er mange direkte og indirekte metoder til måling celleproliferation af dyrkede celler in vitro 8,9. Disse kan udføres enten som kontinuerlige målinger over tid, eller som endpoint analyser 10. Konventionelle metoder er stadig nyttigt, såsom celletælling under anvendelse af et hæmocytometer. Dette assay er en billig og direkte mål for celletal, men det er afhængig af store celletal og højtuddannet træning for at minimere fejl og store standardafvigelser fra tællingerne. Behovet for at udføre målinger, der er kompatible med high-throughput formater har ført til udviklingen af ​​flerbrøndspladens-plade-assays. Disse luminescens assays measure celletal baseret på et luminescerende signal, der er proportionalt med den metaboliske aktivitet af cellen 11,12. På det seneste har indførelsen af høje indhold imaging platforme tilladt for nye værktøjer, der overvåger celleproliferation samtidig give kvantitative og kvalitative indsamling fænotypiske data, og omfatter en række forskellige systemer 13. Alle disse metoder giver muligheder for at måle cellevækst, enten ved kontinuerlig måling eller endpoint assays, og hver har en række fordele og ulemper med hensyn til følsomhed, gennemløb af prøven tal og celleinformation, som alle kan vejes i overensstemmelse hermed afhængigt på forskning spørgsmål.

Denne protokol beskrives tre forskellige metoder til måling af celleproliferation in vitro, med hver metode benytte forskellige intervaller af følsomhed, reproducerbarhed og multi-brønds plade formater. Denne protokol, hvis formål at sammenligne anvendelsen af ​​en hæmocytometertælling chamber, en luminescens-baserede celleviabilitetstest, og celle billeddanner, ved måling af celleproliferation over en 96 timer tidsforløb. For at gøre dette, blev væksten af ​​vektor-transducerede celler (MCF-7-LeGO) sammenlignet med celler transduceret at overudtrykke Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), ved hjælp af tre forskellige celledensiteter. Celleproliferation blev målt hver 24 timer op til 96 timer. Hver metode viste sig at have sine egne fordele og ulemper, og afhængig af formålet med eksperimentet, hver stadig er en værdifuld metode til at give oplysninger om hastigheden for proliferation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse Celler til proliferationsassays

Bemærk: Der laves de to cellelinier på samme måde og frø i samme format for hver metode, der skal analyseres.

  1. Grow MCF-7-Lego og MCF-7-Δ40p53 7-celler til 75-80% konfluens i T 75 cm2 vævskulturkolber anvendelse af phenol-rød fri Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 ug / ml insulin og 1 ug / ml puromycin ved 37 ° C med 5% CO2. Håndtag celler i en steril biosikkerhed kabinet klasse II.
    Bemærk: Den tid, det tager at dyrke cellerne til konfluens varierer afhængigt af seeding fortynding. Som forberedelse til udpladning af cellerne i de proliferationsassays, frø cellerne i en 1: 3-fortynding i suppleret DMEM og opretholde normale vækstbetingelser i 3 dage indtil 75-80% sammenløb.
  2. At fjerne cellerne fra kolben, hæld mediet ien affaldsbeholder. Umiddelbart vaske cellelaget med 2 ml forvarmet 2x trypsin. Aspirer trypsin. Tilføj yderligere 2 ml forvarmet trypsin til cellelaget og placer i en inkubator i 5 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
    1. Når cellerne løsnes, vask af cellerne med 10 ml varmet frisk suppleret DMEM. Overfør cellesuspensionen til et sterilt 15 ml rør og centrifugeres ved 491 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. aspirere og bortskaffe supernatanten forsigtigt.
  3. Resuspender cellepelleten i 5 ml frisk DMEM. Udfør en celletælling at bestemme den korrekte densitet til podning af cellerne i plader med 96 brønde.
    1. Fortynd 100 pi af cellesuspensionen i 900 pi 1x Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS). Placer en ny 60 pm sensor på automatiserede celletæller. Hold stemplet og nedsænkes sensoren i den fortyndede cellesuspension. Slip langsomt stemplet på den celle tæller. Fjern sensoren fra cellen counter når det står færdigt.
      Bemærk: celletal vises på cellen tæller i celler / ml.
  4. Seed celler ved et endeligt volumen på 100 pi (i DMEM) i en 96-brønds plade ved ~ 20% sammenflydning at give plads til cellevækst og måling af proliferation over 3-5 dage (se tabel 1). Seed alle cellelinjer i tre eksemplarer.
    Bemærk: Til dette forsøg blev tre forskellige celledensiteter vurderes at bestemme den optimale celledensitet. De krævede celleantal er opsummeret i tabel 1. Seed celler ved en lavere densitet, hvis der kræves målinger af mere langsigtet vækst.
    1. For hæmocytometeret og luminescens-assays, forberede én plade pr tidspunkt (dvs. 4 plader per assay). For cellen billeddanner assay forberede kun én plade under hele forsøget.
  5. Opretholde celler ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer.

2. Bestemmelse celletal osing et hæmocytometer

  1. Pre-varm både medium og trypsin til 37 ° C i en cellekultur inkubator, ovn eller vandbad. Aspirer medier fra celler i en affaldsbeholder, vaskes en gang med 30 pi 2x trypsin, og aspirere trypsin.
  2. Vask cellerne igen med 30 pi 2x trypsin, og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C. Forsigtigt trykke kanten af ​​pladen at løsne celler fra pladen. Der tilsættes 50 pi suppleret DMEM og bland celler ved pipettering indtil cellerne danner en enkelt cellesuspension.
  3. Forbered hæmocytometer ved at rense overflade og glasafdækning med 70% ethanol.
  4. Placer glasset cover-slip løbet tælle kamre og anbringe indtil 'Newtons brydning ringe' kan ses mellem cover-slip kanter og hæmocytometeret.
    Bemærk: Disse viser, at cover-slip korrekt har levet op til hæmocytometeret.
  5. Forsigtigt pipette 20 ul cellesuspension under cover-slip, fylde optælling kammer ved kapillær bevægelse.Placer hæmocytometer under 10x forstørrelse af et mikroskop og visualisere tælle kamre i nettet layout.
  6. Tæl celler i de 4 yderste pladser i nettet layout. For at forbedre nøjagtigheden, gentagne tællinger af yderligere ydre firkanter, hvis det kræves, eller indtil greven har nået 70 - 100 celler 14,15.
    1. Beregn koncentrationen celle pr ml som følger: Gennemsnitlig celletal pr x fortynding firkantet faktor (hvis anvendt) x 10 4
  7. Gentag trin 2,1-2,8 hver 24 time i 96 timer efter såning.

3. Bestemmelse Cell Proliferation Ved hjælp af en Luminescens-baserede assay

Bemærk: Dette er en endpoint måling. Når reagenset sættes til cellerne, kan pladen kun kvantificeres gang.

  1. Thaw luminescens reagens i et 22 ° C vandbad i 30 min.
  2. Bland forsigtigt reagens ved at vende flasken for at opnå en homogen blanding.
  3. Ækvilibrere én plade af sederede celler (fra trin1.5) ved stuetemperatur i 30 minutter.
  4. Tilsæt 100 pi luminescens reagens til hver brønd. Blande indholdet på en orbitalryster i 2 min. Tillad plade at inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur.
  5. Opsætning af en luminescens eksperiment ved hjælp af multi-mode pladelæser software.
    1. Aktiver multi-mode pladelæser og åbne softwaren. Vælg I "Jobliste" eksperimenter "og" skabe new'.Select 'filen' fra side værktøjslinje og under 'protokol' fanen, skal du vælge "forsøg".
    2. Vælg 'Grenier 96 flad bund' plade type, og marker afkrydsningsfeltet "brug låget«. Vælg 'læse' indsats i henhold box «læses metode«. Vælg 'luminescens "påvisningsmetode. Klik på 'OK'.
    3. I det læste trin Marker brøndene skal scannes under fanen 'fuld plade ", og vælg brønde til at fungere som tomme brønde.
    4. Sæt filteret sat til tomme filter (fx stik, Em: hul, spejl: ingen). Indstil forstærkningen til135, med en integrationstid på 0,5 sek pr brønd og en læse højde på 6,5 mm. Klik på 'OK' for at gemme indstillingerne for luminescens læse.
  6. Udførelse af en Selvlysende Læs
    1. Skub pladen holder ved at vælge fanen 'instrument kontrol' og klik på 'plade out'.Place 96 brønde på indehaveren pladen, sikrer låget er på. Luk holderen pladen ved at klikke på 'plade i' under fanen 'instrument kontrol «. Klik på 'læses nu "fra værktøjslinjen for at udføre selvlysende læse.
    2. Eksportere de relative luminescerende enhed (RLU) målinger til hver brønd til et regneark til yderligere analyse.
  7. Gentag trin 3,1-3,6 optage proliferation hver 24 timers op til 96 timer efter podning celler.

4. Bestemmelse celletal Ved hjælp af en celle Imager

  1. Opsætning af en cell imaging eksperiment ved hjælp af multi-mode celle imager software
    1. Aktiver multi-mode celle Imager og åben the software.
    2. Vælg I "Jobliste" fanen 'eksperimenter "og" skabe new'.On den "filen' værktøjslinje, skal du klikke på '' fanen og åbne" protokol procedure «tab.Select 'indstillede temperatur indsats. Indstil inkubator til 'on' og sæt temperaturen til 37 ° C og tjek "forvarme" før du fortsætter med 'boks næste trin. Klik på 'OK' for at gemme indstillingerne.
    3. Vælg 'læse' handling. Klik på 'billede' afsløring, skal du vælge 'endpoint / kinetisk' læse typen og "filtre" optik type. Klik 'OK'.Click på' fanen fuld plade "og vælg brønde på pladen, der skal afbildes. Klik på 'OK' for at gemme indstillingerne.
    4. Vælg 2,5X mål fra drop down 'mål' muligheder. Under fanen 'kanaler', vælge to kanaler: GFP 469, 525 og Bright Field. Check 'auto' eksponering for begge kanaler, og vælg den automatiske eksponering godt.
    5. For at bestemme auto fokus, skal du vælge 'autofokus' og klik på 'indstillinger'. For autofokus indstillinger, skal du vælge 'scanne og derefter automatisk fokusering' metode. Klik på 'OK' for at gemme indstillingerne.
    6. Indstil den horisontale og vertikale forskydning fra midten af ​​godt (um) til 0.Select at scanne flere billeder pr brønd i en 3 x 2 montage, med vandret afstand (um) = 2881 og lodrette afstand (um) = 2127. Klik på 'OK' for at gemme procedure indstillinger.
      Bemærk: Se tabel 2 for læse parametre.
  2. Udførelse Læs Eksperimenter på Selected Plate
    1. Klik på fanen 'instrument kontrol "og vælge' plade out 'function.Place 96 brønde i plade holder, sikrer låget er på. Under fanen 'instrument kontrol' skal du vælge 'plade i' funktion. Vælg 'læses nu "fra fanen plade. Gentag læse hver 24 timers op til 96 timer efter såning.
  3. Analyse af celletallet Brug afCell Imager Software.
    1. For at analysere et billede, skal du klikke på fanen "data" på det afbildede plade, skal du vælge 'billede [GFP 469, 525 + Bright field] «. Dobbeltklik på en afbildet godt.
    2. Klik på en indlæst billede. Vælg 'analysere', og vælg et enkelt billede af montage, der skal analyseres. Klik på 'OK'.Check den "GFP" kanal kun vejledende, og der er parametre som skitseret i tabel 3. Klik på "START" for at anvende parametre på de afbildede celler.
    3. Observere celletælling maske placeret over det afbildede celler, som anvendes til at bestemme celletallet per billede. Klik på 'anvende ændringerne «og fastholde disse indstillinger for hver plade afbildet hele eksperimentet.
    4. Når tilbage på det afbildede plade, skal du klikke på "data" drop down menuen og vælg 'celletal «. Dette vil generere den totale celletal per brønd.
    5. Eksporter alle data til et regneark ved at klikke på fanen "eksport" til videre analyse of de celletællinger pr brønd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge forskellige metoder til måling af proliferationen af ​​dyrkede celler, celle proliferation af MCF-7-Δ40p53 transducerede celler blev sammenlignet med den ikke-transducerede MCF-7-LeGO brystcancercellelinie. De tre metoder, der blev sammenlignet - den konventionelle hæmocytometer metode, cellelevedygtighed luminescens-assay, og cell imaging analyse- er skitseret i det skematiske diagram (figur 1). Hver metode har fordele og ulemper til præcist at måle celletælling over tid, og den mest effektive metode afhænger af de endpoint krav i forsøget og de oplysninger, der kan erhverves for en celle population.

Væksten af ​​MCF-7-Lego og MCF-7- Δ40p53 celler blev målt efter 24 timer i 4 dage. Som vist i figur 1 blev de to cellelinier podet ved tre forskellige celledensiteter (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 celler / brønd) og celletælling blev udført 24, 48, 72 og 96 timer efter podning. Hver metode vist øget celleproliferation, ved anvendelse af et hæmocytometer, en luminescens-baseret assay, og en celle billeddanner (figurerne 2a, b og c, henholdsvis) i løbet af 96 timer. Den største stigning i celleproliferation blev set ved den højeste celletæthed (5 x 10 3 celler), og viste også de mest reproducerbare resultater ved hvert tidspunkt, hvilket antyder, at dette er den optimale celledensitet til måling proliferation i disse celler. Der var ingen signifikant forskel i celleproliferation mellem cellelinierne.

Målingen af celleproliferation mellem de forskellige metoder blev sammenlignet ved en lineær regressionsanalyse 6 (figur 3; tabel 4). Der var en signifikant korrelation mellem hver af de forskellige metoder afprøvet, når man sammenligner cell proliferation på alle de celletætheder i begge cellelinier (figur 3a og b). Iagttoges den stærkeste korrelation mellem sammenligningen af luminescens-assay, og cellen billeddanneren (R2 = 0,8899, s ≤0.0001; R2 = 0,9805, s ≤0.0001, figur 3a og b, henholdsvis).

En visuel repræsentation af celleproliferation ved hjælp af cellen imager er vist (figur 4). Da denne fremgangsmåde anvender løbende målinger af en enkelt plade, kan cellerne afbildes hver 24 timer, indtil cellerne når tæt på 100% konfluens. Som vist i figur 2, vækstraterne i MCF-7-Lego og MCF-7-Δ40p53 celler var sammenlignelige på tværs af alle tidspunkter. Denne metode giver nyttige cellulære oplysninger, herunder at kunne visuelt overvåge cellevækst på tværs af flere dage, og sammenligne cellestørrelse og celle morfology mellem forskellige cellelinier.

figur 1
Figur 1: et skematisk diagram af de tre forskellige målemetoder celleproliferation Celler blev podet ved tre forskellige celledensiteter i flere 96-brønds plader og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO2 i op til 96 timer.. Hver 24 timer, celledeling blev målt ved enten at bruge et hæmocytometer, en luminescens-baserede assay eller cell imaging. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Celleproliferation Målinger efter 96 timer Cell tællinger blev målt hver 24 timer til 96 timer i MCF-7-benO og MCF-7-Δ40p53 celler podet ved tre forskellige celledensiteter. Celletællinger blev målt under anvendelse af et (a) hæmocytometer i celler / ml, (b) anvendelse af en luminescens-assay i relative luminescerende enheder (RLU), eller (c) en kontinuerlig celletælling under anvendelse af en celle billeddanner i celler / billede. Betingelser for cellen imager er vist i tabel 2. Alle forsøg repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, ± SD Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Sammenligning af tre forskellige metoder til at måle celleproliferation i brystcancercellelinier En lineær regressionsanalyse blev udført for at sammenligne de korrelative relationer mellem de forskellige m etoder undersøgt til måling af celleproliferation i (a) MCF-7-LEGO celler og (b) MCF-7-Δ40p53 celler. En Pearsons korrelationskoefficient blev beregnet, og signifikans blev bestemt (p <0,05) mellem de forskellige metoder til at måle celleproliferation. Alle resultater repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Billeder af GFP-positive MCF-7-Lego og MCF-7-Δ40p53 Breast Cancer Cells Repræsentative billeder af celler fra 5 x 10 3 sederede celler taget med et celle imager hver 24 timer. Skalaen søjle repræsenterer 1000 um. Parametre for cell imaging er opsummeret i tabel 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Celledensitet (celler / brønd)
celletype 1,5 x 10 3 3,0 x 10 3 5 x 10 3
MCF-7-LeGO 76 pi i 8,4 ml medium 152 pi i 8,3 ml medier 254 pi i 8,2 ml medier
MCF-7-Δ40p53 93 pi i 8,4 ml medium 185 pi i 8,3 ml medier 308 pi i 8,2 ml medier

Tabel 1: Cell Seedning Mængder til plader med 96 brønde.

"Fo: holde-med-next.within-page =" altid "> Læs parametre Plate typen 96 brønd Mode Billede Objektiv 2,5X Farve GFP (469, 525), Bright Field Udsættelse Auto Fokus Auto (Scan derefter autofokus)

Tabel 2: Læs parametre for Cell Imaging Brug af Cell Imager.

Tabel 3: Imaging Parametre for Cell Counting Analysis.

Imaging parametre
Grænseværdi 5000
Mindste objekt størrelse (um) 30
Maksimal objekt størrelse (um) 300
MCF-7-LeGO
R firkantet p-værdi
Hæmocytometer vs. luminescens-baserede assay 0,6301 0,0021
Cell kamera vs. hæmocytometer 0,7524 0,0003
Luminescens-baserede assay vs. celle imager 0,8899 <0,0001
MCF-7-Δ40p53
R firkantet p-værdi
Hæmocytometer vs. luminescence-baserede assay 0,8983 <0,0001
Cell kamera vs. hæmocytometer 0,9303 <0,0001
Luminescens-baserede assay vs. celle imager 0,9805 <0,0001

Tabel 4: lineær regressionsanalyse af de tre forskellige Spredning Metoder Testet.

Metode Fordele Ulemper Tekniske noter endelige output
hæmocytometer Lavpris Høj menneskelige fejl Pipette flere gange for at fremstille enkelt cellesuspension Celler / ml
Kræver minimal udstyr Kræver enkelt cellesuspension Udfør flere tællinger for at opnå nøjagtighed
Direkte tælling celle Høj antal celler kræves for præcis vurdering af celletal
endpoint
Luminescens-baserede assay Brug med flere brønde-plade-formater Dyre reagenser Beskyttes mod lys Relativ Luminescent Units (RLU) / brønd
Let at udføre Kræver luminescerende pladelæser Omfatte kontrolbrønde at bestemme baggrunden luminescens
Hurtig assay Temperatur-følsomme
Giver oplysninger cellernes levedygtighed Variabel afhængig metabolisk aktivitet af celler
indirekte måling
endpoint
Cell imager Kontinuerlig måling Dyrt imager Sikre celle imager er indstillet til 37 ° C Celler / billede
kontrol Temperatur Skill intensiv Undgå unødvendige rystelser eller forstyrrelser af celler
Giver cellulære information Variabel afhængig sammenløbet af celler
Omkostningseffektiv (hvis du har imager) Relativ optælling
direkte måling
Automatiseret billeddannelse af multibrønd-plade-format

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol tre forskellige metoder til måling af celleproliferation i dyrkede celler blev undersøgt. Hver metode var i stand til reproducerbare og nøjagtige målinger af celleproliferation over 96 timer, og resultaterne var sammenlignelige mellem hver af de testede metoder (figur 2 og 3). Både luminescens-assay og cell imaging metode producerede de mest robuste resultater, der viser lineære stigninger i celleproliferation efter 96 timer (figur 2b, c). Derudover cell imaging over tid afbildet ingen signifikant forskel i vækstraterne mellem de transducerede og ikke-transducerede cellelinjer (figur 4).

Der er mange fordele og ulemper for hver metode undersøges i denne protokol, se tabel 5 for et resumé. Den konventionelle celletælling fremgangsmåde under anvendelse af et hæmocytometer er en billig metode, der kræver meget lidt yderligere reagenser eller effort for at forberede og køre. Desuden er denne metode kvantificerer en absolut celletal i celler / ml 14. Der er imidlertid alvorlige ulemper, som omfatter tidskrævende karakter af celletælling, høje fejlrater, der resulterer i store standardafvigelser mellem tællinger, og den omstændighed, at en høj række celleantal er nødvendige for at opnå nøjagtige celletællinger. Dette kan ses i figur 2a, hvor celletælling under anvendelse hæmocytometeret viste variable resultater ved de lave celletætheder og store standardafvigelser på senere tidspunkter. Disse ulemper gør denne metode anvendelig til celletælling af små stikprøvestørrelser, og utilstrækkelig til større high throughput målinger, hvor der kræves mindre plade størrelser og såning tætheder. Disse begrænsninger kunne afhjælpes, hvis celledensiteten blev forøget, således at det mindste antal talte celler begyndte ved en tærskel på mere end 100 celler. Jo mere fortyndede cellesuspensionen, eller sænke celle density, jo større chance for at tælle mindre end 100 celler og derfor forøge variabiliteten mellem replikater 15. Men denne metode er uegnet til en plade med 96, på grund af den lave celle overfladeareal, og dermed det utilstrækkelige antal celler, som kan anvendes i analysen. Dette understreger manglen på høje gennemløb kapaciteter af denne metode, og en klar ulempe for brugere, der kræver denne evne.

Luminescensen-baserede assay bestemmer cellelevedygtighed ved at måle mængden af ATP, som er et mål for tilstedeværelsen af metabolisk aktive celler 16. Dette assay er designet til high throughput screening af flere prøver i en 96 brønds pladeformat at bestemme celleproliferation. Denne simple metode kvantificerer celleproliferation som en relativ luminescens enhed (RLU) ved anvendelse af en pladelæser, som er proportional med ATP til stede i de metabolisk aktive celler. Men den største ulempe ved denne metode er than koster af reagenset, og afhængigheden af ​​målingen på den metaboliske aktivitet af cellerne. Forskellige celle Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur eller cellecyklus tidspunkter, kan let påvirke mængden af ATP produceres af de celler, som er direkte proportional med det luminescerende signal, der genereres af assayet 17. Derfor er det vigtigt at empirisk bestemme, at betingelserne for eksperimentet ikke forstyrrer den metaboliske aktivitet af cellerne og potentielt hæmme den relative luminescerende signal frembragt af cellerne.

Den tredje metode undersøges til bestemmelse af celleproliferation var en levende celle billeddanner og software til at udføre en relativ celletal. Cellen imager har high-throughput kapaciteter, som det kan automatiseres til at fange flere billeder for hver brønd, i realtid sammen med temperaturregulering, under anvendelse af de samme celler over varigheden af ​​assayet. Som vist i figur 4, kan celleproliferation være monitored i samme plade over et tidsforløb, der kan give yderligere oplysninger om cellepopulationen sammen med celletælling analyse. Dette er meget fordelagtigt, da det eliminerer cross-plade variabilitet og cellepodning fejl, hvilket er almindeligt i 96-brønds plade formater. Den software, der ledsager celle imager muliggør kvantificering af celletællinger ved hjælp af parametrene skitseret i tabel 2 og 3. Det er derfor nyttigt i en high-throughput indstilling og kan let multiplekses til andre assays til måling af cellulære funktioner, såsom apoptose eller cytotoksicitet. En væsentlig ulempe ved systemet er den software, der er begrænset i sin evne til at splitte røre objekter. Mens det kan udføre denne funktion i lavere Confluence celler, er det en væsentlig begrænsning af assayet og kræver derfor celletypespecifik optimering. Også, mens enkelte eksperimenter ved hjælp af en imager er meget lave omkostninger på en plade-by-plade skala, denne metode ville påly være omkostningseffektiv, hvis instrumentet allerede er sat op i et laboratorium. Derfor er dette en hidtil ukendt fremgangsmåde til måling af celleproliferation af dyrkede celler, og har den store fordel, at den kræver ingen yderligere reagenser, og er i stand til pladen med 96 brønde automatiseret optælling, hvilket gør denne fremgangsmåde egnet til high-throughput analyse. Dette er en væsentlig forbedring af den konventionelle hemocytometer celletælling metode, og er en mere omkostningseffektiv løsning til luminescens-assay.

Det kritiske trin ved brug af cellen imager er under analysen af ​​de optagne billeder og efterfølgende celletal per billede. Disse billeder kan blive behandlet i en række cell imaging platforme. Det er derfor helt afgørende at bestemme den mest hensigtsmæssige software til celletype, der undersøges. Det ville være nyttigt at validere celletal fra de billeder, der er erhvervet af cellen imager ved hjælp af forskellige imaging software. Denne protokol kan anvendes på eny dyrkede celler, men de analyseparametre skulle defineres for hver cellelinje. Dette kan være tidskrævende i starten, men når parametrene er indstillet, kan fremgangsmåden automatiseres at afbilde hele plader ad gangen.

Det er vigtigt at bemærke, at disse assays er faktisk et indirekte mål for spredning, som de måler celletal (hæmocytometer, celle billeddanner), eller metabolisk aktivitet (luminescens-assay), over en periode. Disse fremgangsmåder kan let ændres til at måle andre vigtige faktorer, der kan påvirke proliferation. For eksempel kan den trypan metode blue udelukkelse let inkorporeres i enten hæmocytometeret eller celle billeddanner metode til at udelukke døde celler og dermed bestemme cellelevedygtighed 13. Den luminescens-baserede assay kan multiplekses med en cytotoksicitet assay at give yderligere oplysninger om celle sundhed, og den metaboliske aktivitet målt i løbet af denne analyse er også en måling af celle viabiheden 12. Derfor, for at fleksibiliteten af ​​disse assays multiplekses med andre assays til at give yderligere cellulære information er en stærk fordel ved hver af disse metoder.

Denne protokol anvendes den humane brystcancer-cellelinie MCF-7, der er blevet stabilt transduceret med LEGO-IG2-puro + vektor indeholdende GFP-genet. Dette tillader anvendelse af GFP optik filter til afbildning af celler, uden at det er nødvendigt at tilføje nogen farvning agenter i dyrkningsmediet. Denne fremgangsmåde kan let modificeres til at afbilde GFP-negative celler eller endog primære cellelinier, enten ved billeddannelse af celler ved anvendelse af lyse felt optik type, eller ved at mærke cellerne med en proliferationsmarkør. Sammenlignes metoderne i denne protokol er robuste nok til at blive anvendt i en lang række forskellige cellelinjer, men de optimale protokolindstillinger for hver enkelt cellelinje bør bestemmes først. Imaging af celler ved hjælp af den lyse felt kanal repræsenterer den bedste mulighed for primær ceLLS eller dem, der er langsomt voksende, på grund af den langsigtede karakter af denne metode. End-point assays, såsom luminescensen-baseret assay, er ikke velegnet til analyse af langsigtede cellevækst.

Denne protokol er beskrevet tre forskellige metoder til måling af celleproliferation in vitro. Hver metode kan rutinemæssigt udføres i laboratoriet for at måle cellevækst, og de fleste laboratorier vil have den nødvendige kapacitet til at udføre en af ​​disse metoder. Der er imidlertid også en række andre assays tilgængelige til måling delende celler. Disse kan omfatte metoder, der måler DNA-syntese, metaboliske aktivitet, associerede antigener af proliferation eller ATP-koncentration 9. For eksempel har en række assays blevet udviklet til at måle hastigheden af ​​DNA-syntese af celler ved mærkning af celler med et radioaktivt stof, såsom 3H-thymidin. En ulempe ved denne metode er det indlysende anvendelse af radioaktive stoffer, og bortskaffelse. Andremetoder, der rutinemæssigt anvendes til måling af celleproliferation indbefatter anvendelse af BrdU mærkning af nydannede DNA, der kan måles ved anvendelse af flowcytometri 18. Flowcytometri kan anvendes til at analysere både celleantal samt cellecyklus information. Dette kan være en fordelagtig resultat for særlige eksperimenter, men ulemperne ved denne metode omfatter den ekstra tid og trin, kostbare reagenser og øget bruger-trænede færdigheder for at betjene flowcytometeret og analysere de resulterende data 18. Derfor er der mange forskellige assays til rådighed for forskere til at vurdere væksten af ​​celler, og den valgte metode er meget afhængig af den anvendte celletype, brugeren og deres sværhedsgrad og typen af ​​data, der kræves i endepunktet af eksperimentet.

Som konklusion blev tre forskellige metoder til måling af celleproliferation sammenlignet under anvendelse brystcancerceller. Hver metode har mange fordele og disadvantages, og er derfor brugerafhængig og baseret på deres behov for hvert forsøg med hensyn til at bestemme den mest hensigtsmæssige assay til at udføre celletælling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red ThermoFisher Scientific 21063-045 Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin
L-glutamine solution (100x) ThermoFisher Scientific 25030-081
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278-5ML
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen Biologicals SFBS-F-500ml
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
0.5% trypsin-EDTA solution (10x) ThermoFisher Scientific 15400-054 Dilute to 2x in DPBS
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) ThermoFisher Scientific 30028-02
Tissue culture flask, 75 cm2 growth area Greiner Bio-One 658175
Scepter 2.0 Cell Counter Merck Millipore Automated cell counter
96 well multiwell plate, flat bottom Nunc 167008
Improved Neubauer Hemocytometer BOECO Germany BOE 01
Olympus IX51 inverted microscope Olympus IX51
CellTiter-Glo 2.0 Assay Promega G9242 Luminescence-based assay
Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader BioTek Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging
Gen5 Data Analysis Software BioTek GEN5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
  3. Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
  4. Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
  5. Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
  6. Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
  7. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
  8. Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
  9. Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
  10. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
  11. Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
  12. CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
  13. Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
  14. Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
  15. Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
  16. Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
  17. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  18. Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).

Tags

Cancer Biology molekylærbiologi celleproliferation brystcancer cell imaging cancer biologi celletælling
Sammenligning af tre forskellige metoder til bestemmelse celleproliferation i brystcancercellelinier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morten, B. C., Scott, R. J.,… More

Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (115), e54350, doi:10.3791/54350 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter