Comparaison de trois différentes méthodes pour la détermination de la prolifération cellulaire dans des lignées cellulaires de cancer du sein
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Le gène suppresseur de tumeur, p53, est un régulateur essentiel d'un certain nombre de processus cellulaires, y compris l' arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et la sénescence 1. Il est responsable du maintien de la stabilité génomique et il est donc essentiel pour le maintien de l'équilibre de la mort cellulaire et la croissance cellulaire. Des mutations dans p53 sont fréquents dans le cancer et sont la principale cause de l' inactivation de p53 menant au cancer de la prolifération cellulaire incontrôlée 2. Fait intéressant, les mutations dans p53 ne comptent pour environ 25% des cancers du sein 3, ce qui suggère que d' autres mécanismes sont responsables de la perte de fonction de p53. Les isoformes de p53 récemment découverts ont été révélés être surexprimé dans un certain nombre de cancers humains, et peuvent moduler la fonction de p53 4,5. Nous avons précédemment montré que l'isoforme de p53, Δ40p53, est l'isoforme la plus fortement exprimée dans le cancer du sein, et il est fortement régulée positivement dans les cellules du cancer du sein, par rapport à la normale adjacente tissue 6. Après cela, nous transduites de manière stable la lignée cellulaire de cancer du sein humain MCF-7 à surexprimer Δ40p53 utilisant le lego-IG2-puro + vecteur (GFP +) 7. Ces cellules ont été utilisées pour étudier si l'expression élevée Δ40p53 augmente le taux de prolifération cellulaire dans les cellules cancéreuses du sein.
Il existe de nombreuses méthodes directes et indirectes de la mesure de la prolifération cellulaire des cellules cultivées in vitro 8,9. Ceux – ci peuvent être effectuées soit en tant que mesures continues dans le temps, ou des essais comme point final 10. les méthodes classiques sont encore utiles, telles que le comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre. Cet essai est un faible coût et de la mesure directe du nombre de cellules, mais il ne repose sur de grands nombre de cellules et la formation hautement qualifiée pour minimiser les erreurs et un grand écart par rapport aux standards chiffres. La nécessité d'effectuer des mesures compatibles avec les formats à haut débit a conduit au développement d'essais multipuits-plaque. Ces analyses basées sur la luminescence mesure le nombre de cellules en fonction d'un signal luminescent proportionnel à l'activité métabolique de la cellule 11,12. Plus récemment, l'introduction de la haute teneur des plates – formes d'imagerie a permis de nouveaux outils qui contrôlent la prolifération cellulaire tout en fournissant la collecte quantitative et qualitative des données phénotypiques, et comprend une variété de systèmes 13. Toutes ces méthodes fournissent des pistes pour mesurer la croissance des cellules, soit par mesure ou finaux des essais continus, et possèdent chacun une gamme d'avantages et des inconvénients en ce qui concerne la sensibilité, le débit des numéros d'échantillons, et des informations de cellules, qui peuvent tous être pesé en conséquence en fonction sur la question de la recherche.
Ce protocole décrit trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire in vitro, avec chaque procédé utilisant des gammes différentes de sensibilité, la reproductibilité et les formats de plaque multi-puits. Ce protocole visait à comparer l'utilisation d'un hémocytomètre comptage chambre, un dosage à base luminescence viabilité cellulaire et d'imagerie cellulaire, dans la mesure de la prolifération cellulaire pendant un décours temporel de 96 heures. Pour ce faire, la croissance des cellules vecteur-transduction (MCF-7-lego) a été comparé à des cellules transduites pour surexprimer Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), en utilisant trois densités cellulaires différentes. La prolifération cellulaire a été mesurée toutes les 24 heures jusqu'à 96 heures. Chaque méthode a été constaté que ses propres avantages et inconvénients, et en fonction du but de l'expérience, chacun est encore une méthode utile pour fournir des informations sur le taux de prolifération.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole trois méthodes différentes pour mesurer la prolifération cellulaire dans les cellules cultivées ont été examinées. Chaque procédé est capable de mesures reproductibles et précis de la prolifération cellulaire pendant 96 heures, et les résultats étaient comparables entre chacune des méthodes testées (figure 2 et 3). À la fois le dosage à base de luminescence et un procédé d'imagerie de cellules ont produit des résultats les plus robustes, montrant une augmentatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
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