Introduction
Ген - супрессор опухолей р53, является существенным регулятором ряда клеточных процессов, в том числе остановки клеточного цикла, апоптоза и старении 1. Он отвечает за поддержание стабильности генома, и, следовательно, имеет решающее значение для поддержания баланса гибели клеток и роста клеток. Мутации в p53 являются общими в рак и являются основной причиной инактивации р53 приводит к пролиферации клеток рака неконтролируемое 2. Интересно отметить , что мутации в р53 составляют лишь около 25% случаев рака молочной железы 3, предполагая , что другие механизмы ответственны за потерю функции р53. Недавно открытые изоформы р53 , как было показано быть избыточно экспрессируется в ряде злокачественных опухолей человека, и могут модулировать функцию p53 4,5. Ранее мы показали, что р53 изоформы, Δ40p53, является самым высоким уровнем экспрессии изоформ при раке молочной железы, а также значительно усиливает свою активность в клетках рака молочной железы, по сравнению с нормальными смежного TISS6 уе. Вслед за этим, мы стабильно трансдуцированная человеческой линии клеток рака молочной железы MCF-7 гиперэкспрессией Δ40p53 с использованием Лего-IG2-Puro + вектор (GFP +) 7. Эти клетки были использованы для исследования, если высокий уровень экспрессии Δ40p53 увеличивает скорость пролиферации клеток в клетках рака молочной железы.
Есть много прямых и косвенных методов измерения клеточной пролиферации культивируемых клеток в пробирке 8,9. Они могут быть выполнены либо в виде непрерывных измерений с течением времени, или в качестве конечной точки анализов 10. Обычные методы по-прежнему полезны, например, подсчета клеток с помощью гемоцитометра. Этот анализ является низкая стоимость и прямой мерой числа клеток, но он полагается на больших кровяных клеток и высококвалифицированной подготовки для минимизации ошибок и больших стандартных отклонений от подсчетов. Необходимость проведения измерений, совместимых с форматами высокой пропускной способности привело к разработке анализов многоямный тарелками. Эти люминесценции на основе анализов колбыRe числа клеток на основе сигнала , люминесцентный , который пропорционален метаболической активности клетки 11,12. Совсем недавно, введение платформ формирования изображений с высоким содержанием позволило новых инструментов , которые контролируют пролиферацию клеток, обеспечивая количественный и качественный сбор фенотипических данных, и включает в себя множество систем 13. Все эти методы обеспечивают пути для измерения роста клеток, либо путем непрерывного измерения или конечных точек анализов, и каждый обладает целым рядом преимуществ и недостатков в отношении чувствительности, пропускная способность номера образцов, а также информацию ячейки, все из которых могут быть весила соответствующим образом в зависимости на вопрос исследования.
Этот протокол описывает три различных метода измерения пролиферации клеток в пробирке, с каждым способом , использующим различные диапазоны чувствительности, воспроизводимости и многолуночных форматов пластин. Этот протокол направлен сравнить использование подсчета гемоцитометр CHAmber, жизнеспособность клеток анализ на основе люминесценции, а ячейка тепловизор, при измерении пролиферации клеток с течением времени курс 96 часов. Для этого, рост вектор-трансдуцированных клеток (MCF-7-Лего) сравнивали с клетками трансдуцированных что экспрессия Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), с использованием трех различных плотностей клеток. пролиферации клеток измеряли каждые 24 ч в течение до 96 часов. был найден Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и в зависимости от цели эксперимента, каждый по-прежнему является ценным методом для предоставления информации о скорости пролиферации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Клетки для анализа пролиферации
Примечание: Подготовьте две клеточные линии таким же образом, и семя в том же формате, для каждого метода для анализа.
- Grow MCF-7-Лего и MCF-7-Δ40p53 7 клеток до 75-80% слияния в Т 75 см 2 флаконах для культуры ткани с использованием фенола-красный свободный Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) , , 200 мМ L-глутамина, 2 мкг / мл инсулина и 1 мкг / мл пуромицина при температуре 37 ° с с 5% CO 2. Обрабатывать клетки в стерильный биозащитой класса II.
Примечание: количество времени, которое требуется, чтобы вырастить клетки до слияния варьирует в зависимости от посевного разведения. В процессе подготовки к металлизации клеток для анализа пролиферации, семенные клетки в отношении 1: 3 разведением в среде DMEM, дополненной и поддерживать в нормальных условиях роста, в течение 3-х дней, пока 75-80% сплошности. - Для удаления клеток из колбы, слейте носитель вотходов контейнер. Немедленно промыть слой клеток с 2 мл подогретого 2x трипсина. Отберите трипсина. Добавить еще 2 мл подогретого трипсин к слою клеток и место в термостате в течение 5 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- После того, как клетки отделить, промыть клетки с 10 мл утепленные свежей DMEM, дополненной. Передачи клеточной суспензии в стерильный 15 мл пробирку и центрифугируют при 491 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Тщательно аспирата и распоряжаться супернатанта.
- Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл свежей среды DMEM, дополненной. Выполнить подсчет клеток, чтобы определить правильную плотность потомству клеток в 96-луночные планшеты.
- Разбавляют 100 мкл суспензии клеток в 900 мкл 1x Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS). Установите новый датчик 60 мкм на автоматизированный счетчик клеток. Удерживая поршень и погрузить датчик в разбавленной клеточной суспензии. Медленно отпустите поршень на прилавке клетки. Извлеките датчик из ячейки CouNTER после их завершения.
Примечание: Количество клеток будет отображаться на счетчике клеток в клетках / мл.
- Разбавляют 100 мкл суспензии клеток в 900 мкл 1x Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS). Установите новый датчик 60 мкм на автоматизированный счетчик клеток. Удерживая поршень и погрузить датчик в разбавленной клеточной суспензии. Медленно отпустите поршень на прилавке клетки. Извлеките датчик из ячейки CouNTER после их завершения.
- Семенной клетки в конечном объеме 100 мкл (в DMEM) , в 96-луночный планшет при ~ 20% сплошности , чтобы места для роста клеток и измерения пролиферации в течение 3-5 дней (таблица 1). Семенной все клеточные линии, в трех экземплярах.
Примечание: Для этого эксперимента три разные плотности клеток оценивали для определения оптимальной плотности клеток. Требуемые номера ячеек приведены в таблице 1. Семенной клеток при более низкой плотности , если измерение более долгосрочной роста требуется.- Для гемоцитометра и анализов люминесценции на основе, подготовить одну пластину за каждую единицу времени (т.е. 4 пластин в анализе). Для анализа клеточных тепловизора, готовят только одну пластину, на время эксперимента.
- Поддерживать клетки при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 24 часов.
2. Определение Cell Count UsING гемоцитометра
- Предварительно теплой и средней и трипсин до 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур, духовой шкаф или водяную баню. Аспирируйте средств массовой информации из клеток в контейнер для отходов, мыть один раз с 30 мкл 2x трипсина и аспирация трипсина.
- Промыть клетки снова с 30 мкл 2x трипсина, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Осторожно постучите краем пластины, чтобы вытеснять клетки от пластины. Добавьте 50 мкл среды DMEM, дополненной и смешать клетки пипеткой до тех пор, пока клетки не образуют суспензии отдельных клеток.
- Подготовка гемоцитометра путем очистки поверхности и стеклянной крышкой с 70% этанола.
- Поместите стеклянную крышку скольжения над счетных камер и наклейте до тех пор, пока можно увидеть "Ньютона рефракции кольца" между краями крышки проскальзывания и гемоцитометра.
Примечание: Они указывают, что крышка скользит правильно приклеена к гемоцитометра. - Аккуратно пипеткой 20 мкл клеточной суспензии под покровным стеклом, заполняя счетнокамерное с помощью капиллярного движения.Поместите гемоцитометра под 10-кратным увеличением микроскопа и визуализировать счетные камеры в макете сетки.
- Количество клеток в 4-х внешних квадратов макета сетки. Для повышения точности повторить подсчет дополнительных внешних квадратов , если требуется, или до подсчета не достигнет 70 - 100 клеток 14,15.
- Рассчитать концентрацию клеток на мл следующим образом : Среднее количество клеток на квадратный коэффициент разбавления х (если используется) х 10 4
- Повторите шаги 2.1-2.8 каждые 24 ч в течение 96 часов после высева.
3. Определение клеточной пролиферации при использовании люминесценция на основе Пробирной
Примечание: Это измерение конечной точки. После того, как реагент добавляют к клеткам, пластина может быть количественно определена только один раз.
- Оттепели люминесценцию реагента в водяной бане при 22 ° С в течение 30 мин.
- Аккуратно перемешайте реагент, перевернув бутылку, чтобы получить однородную смесь.
- Равновесие одну пластину из посеянных клеток (из стадии1,5) при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавьте 100 мкл реагента люминесценции в каждую лунку. Смешайте содержимое на орбитальном шейкере в течение 2 мин. Разрешить пластины инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Настройка свечения эксперимент с использованием многомодового программного обеспечения на планшет-ридер.
- Включите многорежимный ридере и откройте программное обеспечение. В "диспетчере задач", выберите "эксперименты" и "создать new'.Select 'файл' из боковой панели, а под" протокола "вкладки, выберите« процедура ».
- Выберите 'Гренье 96 плоское дно "пластинчатого типа, и установите флажок" Использовать крышку ". Выберите "читать" действия в графе "метод чтения". Выберите метод обнаружения "люминесценции". Нажмите 'OK'.
- В ступенчатой коробкой для чтения, выберите лунки, которые будут проверяться на вкладке "полную тарелку" и выберите колодцы, чтобы действовать как пустые скважины.
- Установите фильтр установлен на пустой фильтр (например, пробки, Em: отверстие, зеркало: нет). Установить усиление на135, со временем интегрирования 0,5 сек на лунку и для чтения высотой 6,5 мм. Нажмите "OK" для сохранения настроек для чтения люминесценции.
- Выполнение Люминесцентные Read
- Извлечь держатель пластин, выбрав вкладку "Управление прибором" и нажмите на "тарелку out'.Place 96-луночного планшета на держателе, обеспечивая крышку на. Закройте держатель пластины, нажав на "тарелку" на вкладке в разделе "управления прибором". Нажмите на «читать сейчас» из панели инструментов, чтобы выполнить люминесцентный чтения.
- Экспорт относительных измерений люминесцентный блок (РОС) для каждой скважины в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
- Повторите шаги 3.1-3.6 для записи пролиферации каждые 24 ч до 96 ч после посева клеток.
4. Определение ячеек Count с помощью мобильного тепловизора
- Настройка эксперимента визуализации клеток с использованием многомодового ячейки Imager программного обеспечения на
- Включите томографа ячейки многорежимный и открытой гое программное обеспечение.
- В "диспетчере задач", выберите вкладку "Эксперименты" и "создать new'.On на '' панель инструментов, нажмите на" Файл "вкладку и открыть 'протокол процедуры' tab.Select 'заданной температуры' действий. Установить инкубатор 'на' и установить температуру до 37 ° C и проверьте "Прогрев" перед продолжением следующего шага 'коробки. Нажмите "OK" для сохранения настроек.
- Выберите "читать" действия. Нажмите на метод обнаружения 'изображения', выберите 'конечной точки / кинетическое' прочитать тип и тип оптики "Фильтры". Нажмите на ссылку "OK'.Click на" вкладке полную тарелку "и выберите лунки на планшете для включения в образ. Нажмите "OK", чтобы сохранить настройки.
- Выберите цель 2.5x из выпадающего вариантов "целей". На вкладке "каналы", выберите два канала: 469, GFP 525 и светлом поле. Проверить "Auto" экспозиции для обоих каналов и выбрать автоматическую экспозицию хорошо.
- Для определения Autо настройки фокусировки, выберите "автофокус" и нажмите на кнопку "Параметры". Для вариантов автоматической фокусировки, выберите метод "сканирования, а затем автоматической фокусировки '. Нажмите "OK" для сохранения настроек.
- Установите горизонтальное и вертикальное смещение от центра скважины (мкм) до 0.Select для сканирования нескольких изображений на лунку в 3 х 2 монтажа с горизонтальным шагом (мкм) = 2,881 и вертикальное расстояние между ними (мкм) = 2,127. Нажмите "OK" для сохранения настроек процедуры.
Примечание: смотри таблицу 2 для параметров чтения.
- Выполнение чтения эксперимент по Selected Plate
- Нажмите на вкладку "управления прибором" и выберите "осаждаются" function.Place 96-луночного планшета в держателе, обеспечивая крышку на. На вкладке "управления прибором", выберите "тарелку в" функции. Выберите «читать сейчас» на вкладке пластины. Повторите прочитать каждые 24 ч до 96 ч после засева.
- Анализ клеток графа ИспользованиеCell Imager Программное обеспечение.
- Для анализа изображения, нажмите на вкладку "данные" на распечатанных пластине, выберите "картинка [469 GFP, 525 + Светлое поле] '. Двойной щелчок по снятое хорошо.
- Нажмите на загруженном изображении. Выберите 'анализ' и выберите одно изображение монтажа для анализа. Нажмите 'OK'.Check на' 'GFP канала только, и установить параметры , как указано в таблице 3. Нажмите кнопку "Start" , чтобы применить параметры к изображаемых клеток.
- Обратите внимание на маску подсчета клеток помещается над изображаемых клеток, который используется для определения количества клеток для каждого изображения. Нажмите кнопку "Применить изменения" и сохранить эти настройки для каждой пластины изображаемого на протяжении всего эксперимента.
- Однажды в распечатанных пластине, нажмите на падение "данные" вниз меню и выберите "количество клеток". Это будет генерировать общее число клеток на лунку.
- Экспорт всех данных в электронную таблицу, нажав на вкладку "Экспорт" для дальнейшего анализа состояне количества клеток на лунку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изучить различные методы измерения пролиферации культивируемых клеток, пролиферацию клеток в клетках MCF-7-Δ40p53 приемными клетками сравнивали с не-трансдуцированных клеток MCF-7-Лего клеток рака молочной железы линии. Эти три метода , которые сравнивали - обычный метод гемоцитометр, анализ люминесценции жизнеспособность клеток и клеток визуализации analysis- описаны на схеме (рис 1). Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки для точного измерения подсчета клеток с течением времени, и наиболее эффективный метод зависит от конечных требований эксперимента и информации, которые могут быть приобретены для клеточной популяции.
Рост MCF-7-Лего и клеток линии MCF-7 Δ40p53 измеряли через 24 ч в течение 4-х дней. Как показано на фиг.1, две клеточные линии были посеяны в трех различных плотностях клеток (1,5 х 10 3 3; 5 х 10 3 клеток / лунку) и клеток подсчета проводили 24, 48, 72 и 96 ч после засева. Каждый метод продемонстрировал повышенную пролиферацию клеток, с помощью гемоцитометра, анализа на основе люминесценции и клеточный томографа (рис 2а, б и в, соответственно) в течение 96 часов. Наибольшее увеличение пролиферации клеток наблюдалось при самой высокой плотности клеток (5 × 10 3 клеток), а также показал наиболее воспроизводимые результаты в каждый момент времени, предполагая , что это оптимальная плотность клеток для измерения пролиферации в этих клетках. Там не было никаких существенных различий в клеточной пролиферации между клеточными линиями.
Измерение пролиферации клеток между различными методами сравнивали с помощью линейного регрессионного анализа 6 (рис 3, таблица 4). Был значительная корреляция между каждым из различных методов испытания, при сравнении спролиферация ELL на всех плотности клеток в обеих клеточных линиях (рис 3а и б). Наиболее сильная корреляция наблюдалась между сравнением анализа люминесценции на основе и томографа клеток (R 2 = 0,8899, р ≤0.0001, R 2 = 0,9805, р ≤0.0001, рис 3а и б соответственно).
Визуальное представление пролиферации клеток с использованием тепловизора клеток показано (рисунок 4). Поскольку этот метод использует непрерывные измерения одной пластины, клетки могут быть отображены каждые 24 ч до тех пор, пока клетки не достигнет почти 100% слияния. Как показано на рисунке 2, темпы роста клеток MCF-7-Лего и MCF-7-Δ40p53 были сопоставимы во всех временных точках. Этот метод позволяет получить полезную информацию сотовой, в том числе возможность визуально контролировать рост клеток через несколько дней, и сравните размер клеток и клеток морфология между различными клеточными линиями.
Рисунок 1: принципиальная схема трех различных измерительных методов клеточной пролиферации Клетки высевали при трех различных плотностях клеток в несколько 96-луночные планшеты и инкубировали при 37 ° С с 5% CO 2 в течение до 96 часов.. Каждые 24 ч, пролиферации клеток измеряли с помощью либо с помощью гемоцитометра, люминесценции на основе анализа или визуализации клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Измерение пролиферации клеток после подсчета 96 ч клеток измеряли каждые 24 ч в течение 96 ч в MCF-7-LegO и MCF-7-Δ40p53 клетки высевали при трех различных плотностях клеток. Подсчет клеток измеряли с помощью (а) в гемоцитометра клеток / мл, (б) с использованием анализа люминесценции на основе относительных единицах люминесцентными (RLU), или (с) непрерывный подсчет клеток с использованием клеток томографа в клетках / изображения. Условия для клеточного томографа приведены в таблице 2. Все эксперименты представляют собой среднее из трех независимых экспериментов, ± СД Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Сравнение трех различных методов измерения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях Линейный регрессионный анализ для сравнения корреляционного отношения между различными т ethods исследовали для измерения пролиферации клеток на стадии (а) MCF-7-Лего клеток и (б) клеток линии MCF-7-Δ40p53. Коэффициент корреляции Пирсона A рассчитывалось и значимость определяли (р <0,05) между различными методами измерения пролиферации клеток. Все результаты представляют собой среднее ± СД трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Изображения GFP-положительных MCF-7-Лего и MCF-7-Δ40p53 Клетки рака груди Характерные изображения клеток от 5 × 10 3 посеянных клеток захвачена с помощью мобильного тепловизора через каждые 24 ч. Шкалы представляет 1000 мкм. Параметры для визуализации клеток приведены в таблице 2. HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Плотность клеток (клеток / лунку) | |||
| Тип клетки | 1,5 х 10 3 | 3,0 х 10 3 | 5 х 10 3 |
| MCF-7-Лего | 76 мкл в 8,4 мл среды | 152 мкл в 8,3 мл среды | 254 мкл в 8,2 мл среды |
| MCF-7-Δ40p53 | 93 мкл в 8,4 мл среды | 185 мкл в 8,3 мл среды | 308 мкл в 8,2 мл среды |
Таблица 1: посева клеток Объемы на 96 - луночные планшеты.
"ВОК: Keep-с-next.within-странице =" всегда ">Таблица 2: Параметры чтения для ячейки изображения с использованием клеточной Imager.
| параметры изображения | ||||
| порог | 5000 | |||
| Минимальный размер объекта (мкм) | 30 | |||
| Максимальный размер объекта (мкм) | 300 | |||
| MCF-7-Лего | ||
| R квадрат | р-значение | |
| Гемоцитометра против анализа люминесценции на основе | 0,6301 | 0,0021 |
| Cell тепловизор против гемоцитометра | 0,7524 | 0.0003 |
| Свечение на основе анализа по сравнению с клеточной томографа | 0,8899 | <0,0001 |
| MCF-7-Δ40p53 | ||
| R квадрат | р-значение | |
| Гемоцитометра против луАнализ несценции на основе | 0,8983 | <0,0001 |
| Cell тепловизор против гемоцитометра | 0,9303 | <0,0001 |
| Свечение на основе анализа по сравнению с клеточной томографа | 0,9805 | <0,0001 |
Таблица 4: Анализ линейной регрессии трех методов нераспространению обследованы.
| метод | преимущества | Недостатки | Технические примечания | Окончательный вывод |
| гемоцитометра | Бюджетный | Высокая человеческой ошибки | Пипетировать несколько раз, чтобы подготовить суспензии отдельных клеток | Клеток / мл |
| Требует минимального оборудования | Требуется суспензии одноклеточных | Выполните несколько счетчиков для достижения точности | ||
| Количество клеток Прямая | Большое количество клеток, необходимое для точной оценки количества клеток | |||
| Конечная точка | ||||
| Анализ люминесценция на основе | Использование с форматами многоямный-пластинчатых | дорогие реагенты | Защита от света | Относительная Люминесцентные Единицы (РОС) / лунку |
| Легко для того чтобы выполнить | Требуется люминесцентный планшет-ридер | Включить контрольные лунки для определения фонового свечения | ||
| Быстрый анализ | Чувствительный к температуре | |||
| Предоставляет информацию жизнеспособности клеток | Переменный в зависимости от метаболической активности клеток | |||
| Косвенное измерение | ||||
| Конечная точка | ||||
| сотовый тепловизор | Непрерывное измерение | Дорогой тепловизор | Обеспечение клеток Imager установлен на 37 ° C | Клетки / изображения |
| Контроль температуры | Умение интенсивно | Избегайте ненужных встряхиванием или разрушение клеток | ||
| Обеспечивает клеточную информацию | Переменная в зависимости от слияния клеток | |||
| Экономичное (если у вас есть тепловизор) | Относительное кол | |||
| Прямое измерение | ||||
| Автоматизированная визуализация формата многоямный пластины |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. В этом протоколе были рассмотрены три различных метода измерения пролиферации клеток в культуре клеток. Каждый метод был способен воспроизводимые и точные измерения пролиферации клеток в течение 96 часов, а результаты были сравнимы между каждым из методов тестируемых (рис 2 и 3). Оба анализа люминесценции на основе и способ формирования изображения клеток получены наиболее надежные результаты, показывающий линейные увеличение пролиферации клеток после 96 ч (рис 2, б). Кроме того, визуализация клеток с течением времени не изображали никакого существенного различия в темпах роста между трансдуцированная и не трансдуцированных клеточных линий (рисунок 4). Есть много преимуществ и недостатков для каждого метода , рассмотренного в этом протоколе, см таблицу 5 для краткого изложения. Традиционный метод подсчета клеток с использованием гемоцитометра является метод низкой стоимости, что требует очень мало дополнительных реагентов или effoRT для подготовки и запуска. Кроме того, этот метод quantitates абсолютное количество клеток в клетках / мл 14. Тем не менее, существуют серьезные недостатки, которые включают в себя много времени характер подсчета клеток, высокий процент ошибок, что приводит к большим стандартных отклонений между подсчетов, а также тот факт, что высокий диапазон числа клеток необходимы для точного подсчета клеток. Это можно видеть на рисунке 2а, где подсчета клеток с помощью гемоцитометра показал различные результаты при плотностях низких клеток и большие стандартные отклонения в более поздних временных точках. Эти недостатки делают этот метод полезен для подсчета клеток небольших размеров выборки, а также недостаточно для больших измерений с высокой пропускной способностью, где меньшие размеры пластин и плотности посева необходимы. Эти ограничения могут быть облегчены, если плотность клеток была увеличена, таким образом, что минимальное число подсчитанных клеток началось у порога более 100 клеток. Более разбавленный суспензии клеток, или опустить клетку Density, тем больше вероятность подсчета менее 100 клеток и , следовательно , увеличивая изменчивость между размножается 15. Тем не менее, этот способ не подходит для 96-луночного планшета, из-за низкой площадью поверхности клеток, и, следовательно, недостаточное количество клеток, которые могут быть использованы в анализе. Это подчеркивает отсутствие высоких возможностей пропускной способности этого метода и явно невыгодном для пользователей, которым требуется такая возможность. Анализ люминесценции на основе определяет жизнеспособность клеток путем измерения количества АТФ, которое является показателем наличия метаболически активных клеток 16. Этот тест предназначен для высокопроизводительного скрининга нескольких образцов в луночного пластины 96, чтобы определить клеточную пролиферацию. Этот простой метод quantitates пролиферации клеток в качестве относительной люминесценции единицы (RLU) с использованием планшет-ридера, который пропорционален текущей АТФ в метаболически активных клетках. Тем не менее, основным недостатком этого метода является то, тон стоит реагента, а также зависимость измерения от метаболической активности клеток. Различные условия культивирования клеток, такие как точки температуры или времени клеточного цикла, может легко повлиять на количество АТФ производимого клетками, которые прямо пропорционально люминесцентного сигнала , генерируемого с помощью анализа 17. Поэтому, важно, чтобы эмпирически определить, что условия эксперимента не мешают метаболической активности клеток и потенциально препятствовать относительного люминесцентного сигнала, генерируемого клетками. Третий метод исследовали для определения пролиферации клеток был живой Imager клеток и программное обеспечение для выполнения относительного количества клеток. Клетка Imager имеет возможности с высокой пропускной способностью, как это может быть автоматизирована, чтобы захватить несколько изображений для каждой скважины, в режиме реального времени, а также с контролем температуры, с использованием тех же клеток в течение длительности анализа. Как показано на рисунке 4, пролиферации клеток может быть мonitored в той же пластине в течение времени курс, который может предоставить дополнительную информацию о популяции клеток наряду с анализом подсчета клеток. Это очень выгодно, так как она исключает изменчивость поперечного листа и ошибка высева клеток, что является обычным явлением в 96-луночные форматов пластин. Программное обеспечение , сопровождающее устройство формирования изображения клеток позволяет количественному определению подсчитанных клеток с использованием параметров , описанных в таблице 2 и 3. Поэтому полезно в условиях высокой пропускной способностью и могут быть легко мультиплексированы с другим анализам для измерения клеточных функций, таких как апоптоз или цитотоксичности. Основным недостатком системы является программное обеспечение, которое ограничено в его способности разделить трогательные объекты. В то время как он может выполнять эту функцию в нижних клетках впадения, это главное ограничение анализа и, следовательно, требует клеточного типа специфической оптимизации. Кроме того, в то время как отдельные эксперименты, использующие тепловизор очень низкая стоимость по шкале пластинчатый по пластине, этот метод наLY быть экономически эффективным, если прибор уже установлен в лаборатории. Таким образом, это обеспечивает новый способ измерения пролиферации клеток, культивируемых клеток, и имеет основное преимущество, что не требуется дополнительных реагентов, а также способен 96-луночный планшет автоматизированного подсчета, что делает этот метод подходит для анализа с высокой пропускной способностью. Это значительное улучшение по сравнению с обычным методом подсчета гемоцитометр клеток, и является более экономически эффективным вариантом для анализа люминесценции на основе. Критической стадией при использовании томографа клеток находится в процессе анализа захваченных изображений и последующего подсчета клеток на одно изображение. Эти изображения могут быть обработаны с использованием ряда платформ визуализации клеток. Поэтому первостепенное значение для определения наиболее подходящего программного обеспечения для данного типа клеток исследуемого. Было бы полезно для проверки количества клеток из изображений, полученных с помощью томографа клеток с использованием различных программ визуализации. Этот протокол может быть применен кY культивируемые клетки, однако параметры анализа должны быть определены для каждой клеточной линии. Это может потребовать много времени сначала, но после того, как параметры были установлены, способ может быть автоматизирован на изображения цельных пластин одновременно. Важно отметить, что эти анализы на самом деле являются косвенной мерой пролиферации, так как они измеряют количество клеток (гемоцитометра, клетка Imager) или метаболическую активность (люминесценция на основе анализа), в течение определенного периода времени. Эти методы могут быть легко внесены поправки для измерения и другие важные факторы, которые могут влиять на пролиферацию. Например, трипанового синего методом исключения легко могут быть введены в любой из гемоцитометре или клеточного формирователя изображения методом , чтобы исключить мертвые клетки и , следовательно , определить жизнеспособность клеток 13. Анализ люминесценции на основе могут быть мультиплексированы с помощью анализа на цитотоксичность, чтобы обеспечить дополнительную информацию о здоровье клеток, и метаболическую активность, измеренная во время этого анализа также измерение клеточного viabiмируемости 12. Таким образом, гибкость этих анализов, чтобы быть мультиплексированы с другими анализами для предоставления дополнительной информации сотовой является сильным преимуществом каждого из этих методов. Этот протокол используется человеческой линии клеток рака молочной железы MCF-7, которые были стабильно трансдуцированную Лего-IG2-Puro + вектор, содержащий ген GFP. Это позволяет использовать фильтр GFP оптики для изображения клеток, без необходимости добавления каких-либо красителей, агентов, в культуральную среду. Этот метод может быть легко модифицирован для изображения GFP-негативных клеток или линий даже первичных клеток, либо путем визуализации клеток, используя яркий тип поля оптики, или помечая клетки с маркером пролиферации. Методы по сравнению с этим протоколом, достаточно, чтобы быть использованы в самых разнообразных различных клеточных линий надежными, тем не менее оптимальные настройки протокола для каждой отдельной клеточной линии должны быть определены в первую очередь. Визуализация клеток с использованием канала светлого поля представляет собой оптимальный вариант для первичного CELLS или те, которые медленно растут, в связи с долгосрочным характером этого метода. Оконечная анализы, такие как анализ на основе люминесценции, не очень хорошо подходит для анализа долгосрочного роста клеток. Этот протокол описывает три различных метода для измерения пролиферации клеток в пробирке. Каждый метод может быть регулярно проводится в лаборатории для измерения роста клеток, и большинство лабораторий будет обладать необходимыми навыками для выполнения одного из этих методов. Тем не менее, есть также целый ряд других анализов, доступных для измерения делящихся клеток. Они могут включать в себя методы , которые измеряют синтез ДНК, метаболической активности, связанные антигены пролиферации или концентрации АТФ 9. Например, ряд анализов были разработаны для измерения скорости синтеза ДНК в клетках путем мечения клеток с радиоактивным веществом, таким как 3Н-тимидина. Недостатком этого способа является очевидным использование радиоактивных веществ, а также их утилизации. Другиеметоды , которые обычно используются для измерения пролиферации клеток включают в себя использование BrdU маркировки вновь образованной ДНК, которая может быть измерена с помощью проточной цитометрии 18. Проточная цитометрия может быть использован для анализа как число клеток, а также информацию клеточного цикла. Это может быть выгодным результатом для конкретных экспериментов, однако недостатки этого метода включают дополнительное время и шаги, дорогие реагенты и увеличение числа пользователей обученных навыков для того , чтобы управлять потоком цитометр и анализа полученных данных 18. Таким образом, существует множество различных методик, доступных для ученых, чтобы оценить рост клеток, а выбранный метод в значительной степени зависит от типа клеток, используемых, пользователем и их уровня квалификации, а также от типа данных, необходимых в конечной точке эксперимента. В заключение, сравнивали три различных способа измерения пролиферации клеток с использованием клеток рака молочной железы. Каждый метод имеет много преимуществ и disadvantagЕ. С., и, следовательно, зависит от пользователя и в зависимости от их требований для каждого эксперимента, с точки зрения определения наиболее подходящего анализа для выполнения подсчета клеток. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Discussion
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
- CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
- Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
- Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).
Tags
Рак Биология выпуск 115 Молекулярная биология клеточная пролиферация рак молочной железы визуализации клеток биологии рака подсчета клеток View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
