Introduction
Tumörsuppressorgenen, p53, är en viktig reglerare av ett antal cellulära processer, inklusive cellcykelstopp, apoptos och åldrande 1. Det är ansvarig för att upprätthålla genomisk stabilitet, och är därför av avgörande betydelse för att upprätthålla balansen mellan celldöd och celltillväxt. Mutationer i p53 är vanliga i cancer och är den största orsaken till p53 inaktive leder till okontrollerad cancercelltillväxt 2. Intressant nog mutationer i p53 endast står för cirka 25% av bröstcancer 3, vilket tyder på att andra mekanismer är ansvariga för förlusten av p53-funktion. De nyligen upptäckta p53-isoformerna har visats vara överuttryckt i ett antal humana cancerformer, och kan modulera p53-funktion 4,5. Vi har tidigare visat att p53 isoformen, Δ40p53, är den mest uttryckt isoformen i bröstcancer och signifikant uppregleras i bröstcancerceller, jämfört med normala intilliggande tissue 6. Efter detta, stabilt omvandlade vi human bröstcancer MCF-7 att överuttrycker Δ40p53 använda Lego-IG2-puro + vektor (GFP +) 7. Dessa celler användes för att undersöka om hög Δ40p53 expression ökar cellförökningshastigheter i bröstcancerceller.
Det finns många direkta och indirekta metoder för att mäta cellförökning av odlade celler in vitro 8,9. Dessa kan utföras antingen som kontinuerliga mätningar över tid, eller som endpoint analyser 10. Konventionella metoder är fortfarande användbara, såsom cellräkning med användning av en hemocytometer. Denna analys är en låg kostnad och direkt mått på antalet celler, men det förlitar sig på stora celler och högkvalificerad utbildning för att minimera fel och stor standardavvikelser från räknas. Behovet att utföra mätningar som är kompatibla med hög genomströmning format har lett till utvecklingen av flerkälls-plattanalyser. Dessa luminiscens-baserade analyser measure cellantalet baserat på ett luminiscent signal som är proportionell mot den metaboliska aktiviteten hos cellen 11,12. På senare tid har införandet av hög halt avbildningsplattformar tillåtet för nya verktyg som övervakar celltillväxt samtidigt som samling kvantitativa och kvalitativa fenotypiska data och innehåller en mängd olika system 13. Alla dessa metoder ger vägar för att mäta celltillväxt, antingen genom kontinuerlig mätning eller slutpunktsanalyser, och var och en har en rad fördelar och nackdelar med avseende på känslighet, genommatning av provnummer, och cellinformation, som alla kan vägas i enlighet därmed beroende på frågeställningen.
Detta protokoll beskriver tre olika metoder för att mäta cellproliferation in vitro, med varje förfarande som utnyttjar olika sortiment av känslighet, reproducerbarhet och flerbrunnsplattformat. Detta protokoll som syftar att jämföra användningen av en hemocytometer räknings chamber, en luminiscens-baserade cellviabilitet assay, och cell imager, i mätningen av cellproliferation under en 96 timmars tidsförlopp. För att göra detta, var tillväxten av vektor-transducerade celler (MCF-7-LEGO) jämfört med celler som transducerats för att överuttrycka Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), med användning av tre olika celldensiteter. Cellproliferation mättes varje 24 h under upp till 96 timmar. Varje metod befanns ha sina egna fördelar och nackdelar, och beroende på syftet med experimentet, ändå är varje en värdefull metod för att tillhandahålla information på hastigheten för proliferation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Celler för proliferationsanalyser
Notera: Förbered de två cellinjerna på samma sätt och utsäde i samma format för varje metod som skall analyseras.
- Växer MCF-7-LEGO och MCF-7-Δ40p53 7-celler till 75-80% sammanflytning i T 75 cm 2 vävnadsodlingsflaskor med användning av fenol-röttfritt Dulbeccos modifierade Eagles Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 | ig / ml insulin och 1 | j, g / ml Puromycin vid 37 ° C med 5% CO2. Hantera celler i en steril biosäkerhet skåp klass II.
Obs: Den tid det tar att odla cellerna till konfluens varierar beroende på seeding utspädning. Som en förberedelse för plätering av cellerna för proliferationsanalyser, utsäde cellerna vid en 1: 3 utspädning i kompletterat DMEM och upprätthålla normala odlingsbetingelser under 3 dagar tills 75-80% konfluens. - För att avlägsna cellerna från kolven, häll bort mediet ien avfallsbehållare. Tvätta omedelbart cellagret med 2 ml förvärmd 2x trypsin. Aspirera trypsin. Tillsätt ytterligare 2 ml förvärmd trypsin till cellskiktet och placera i en inkubator under 5 min vid 37 ° C med 5% CO2.
- När cellerna lossnar, tvätta cellerna med 10 ml värmas färskt kompletterat DMEM. Överför cellsuspensionen till ett sterilt 15 ml rör och centrifugera vid 491 xg under 5 min vid RT. Försiktigt aspirera och kasta supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml färskt kompletterat DMEM. Utföra en cellräkning för att bestämma den korrekta densiteten för att ympa cellerna i 96-brunnsplattor.
- Späd 100 pl av cellsuspensionen i 900 pl 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Placera en ny 60 pm sensor på den automatiska cellräknare. Håller ned kolven och dränka sensorn i utspädd cellsuspension. Släpp långsamt kolven på cellräknare. Ta bort sensorn från cell counter när den är klar.
Obs: Den celltalet kommer att visas på cellräknaren i celler / ml.
- Späd 100 pl av cellsuspensionen i 900 pl 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Placera en ny 60 pm sensor på den automatiska cellräknare. Håller ned kolven och dränka sensorn i utspädd cellsuspension. Släpp långsamt kolven på cellräknare. Ta bort sensorn från cell counter när den är klar.
- Utsädes celler vid en slutvolym av 100 | il (i DMEM) i en 96-brunnars platta vid ~ 20% konfluens för att tillåta utrymme för celltillväxt och mätning av proliferationen över 3-5 dagar (se tabell 1). Seed alla cellinjer i tre exemplar.
Notera: För detta experiment, användes tre olika celltätheter bedömas att bestämma den optimala celltätheten. De erforderliga cellantal är sammanfattade i tabell 1. Seed celler vid en lägre densitet om det krävs mätning av mer långsiktig tillväxt.- För hemocytometer och luminiscens-baserade analyser, förbereda en platta per tidpunkt (dvs 4 plattor per analys). För cellen imager-analysen, förbereda endast en platta för varaktigheten av experimentet.
- Bibehålla cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 under 24 timmar.
2. Fastställande Cell Count Using en hemocytometer
- Pre-warm både medium och trypsin till 37 ° C i en cellkultur inkubator, ugn eller vattenbad. Aspirera media från celler i en avfallsbehållare, tvätta en gång med 30 pl 2x trypsin, och aspirera trypsin.
- Tvätta cellerna igen med 30 pl 2x trypsin, och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C. Knacka försiktigt på kanten av plattan för att lösgöra celler från plattan. Tillsätt 50 pl av kompletterat DMEM och blanda cellerna genom pipettering tills cellerna bildar en enkelcellsuspension.
- Förbered hemocytometer genom rengöring yta och glaskupa med 70% etanol.
- Placera glastäckglas över räkna kammare och anbringa tills "Newtons brytningsringarnas kan ses mellan cover-slip kanterna och hemocytometer.
Obs: Detta indikerar att den täckglas korrekt har anslutit sig till hemocytometer. - pipett försiktigt 20 l cellsuspension under täckglas, fylla räknekammaren genom kapillär rörelse.Placera hemocytometer i 10x förstoring av ett mikroskop och visualisera räkna kamrarna i nätet layout.
- Räkna celler i 4 yttre rutorna i nätet layout. För att förbättra noggrannheten, antal upprepningar av ytterligare yttre rutor om det behövs, eller tills räkningen har nått 70 - 100 celler 14,15.
- Beräkna cellkoncentrationen per ml enligt följande: Genomsnittlig celltalet per kvadrat x spädningsfaktor (om sådan används) x 10 4
- Upprepa steg 2,1-2,8 varje 24 timmar för 96 h efter sådd.
3. Fastställande Cell Proliferation hjälp av en Luminiscens baserad analys
Obs: Detta är en slutpunkt mätning. När reagenset sättes till cellerna, kan plattan endast kvantifieras gång.
- Tö luminiscens reagens i ett 22 ° C vattenbad i 30 min.
- Blanda försiktigt reagens genom att vända flaskan för att erhålla en homogen blandning.
- Jämvikt en platta med sådda celler (från steg1,5) vid RT under 30 min.
- Tillsätt 100 pl av luminiscens reagens till varje brunn. Blanda innehållet i en orbital shaker i 2 min. Att plattan inkubera under 10 min vid RT.
- Att sätta upp en luminiscens experiment med användning av multi-mode plattläsare programvara.
- Slå på multi-mode plattläsare och öppna programvaran. I "Task Manager", välj "experiment" och "skapa new'.Select" fil "från sida verktygsfältet och under" protokoll ", välj" förfarande ".
- Välj "Grenier 96 plan botten" platta typ, och kontrollera sista förbrukningsdag lock rutan. Välj "läsa" åtgärder enligt "läsa metod rutan. Välj "luminiscens" detektionsmetod. Klicka på "OK".
- I läsa steg markerar brunnarna som ska skannas under fliken "full tallrik", och välj brunnar för att fungera som tomma brunnar.
- Ställ in filtret satt till tom filter (t.ex. plugg, Em: hål, spegel: none). Ställ in förstärkningen till135, med en integrationstid av 0,5 sek per brunn och en läs höjd av 6,5 mm. Klicka på "OK" för att spara inställningarna för luminiscens läsning.
- Utföra en Luminescent Läs
- Mata hållare genom att välja "instrument kontroll" -fliken och klicka på "platta out'.Place 96-brunnar på plåthållaren, se till att locket är på. Stäng plåthållaren genom att klicka på "plattan i" under "instrument kontroll" -fliken. Klicka på "Läs nu" från verktygsfältet för att utföra självlysande läsning.
- Exportera relativa självlysande enhet (RLU) mätningar för varje brunn till ett kalkylblad för vidare analys.
- Upprepa steg från 3,1 till 3,6 för att spela in proliferation varje 24 timmar upp till 96 timmar efter sådd celler.
4. Fastställande Cell räkna med en cell Imager
- Att sätta upp en cell imaging experiment med användning av multi-mode cell kameran programvara
- Slå på multi-mode cell kameran och öppe programvara.
- I "Task Manager", välj fliken "experiment" och "skapa new'.On den" fil "i verktygsfältet, klicka på" protokoll "fliken och öppna" förfarandet "tab.Select" inställda temperaturen insatser. Ställ inkubator att "om" och ställ in temperaturen till 37 ° C och kontrollera "förvärmning" innan du fortsätter med nästa steg "låda. Klicka på "OK" för att spara inställningarna.
- Välj "läsa" åtgärder. Klicka på "bild" detekteringsmetod, välj "endpoint / kinetiska" läsa typ och "filter" optik typ. Klicka på "OK'.Click om" full tallrik fliken och välj brunnar på plattan som ska avbildas. Klicka på "OK" för att spara inställningarna.
- Välj 2.5x mål från rullgardins "mål" alternativ. Under fliken "kanaler", välj två kanaler: GFP 469, 525 och Bright Field. Kontrollera "auto" exponering för båda kanalerna och välja den automatiska exponerings väl.
- Att bestämma auto fokusinställningarna, välj "autofokus" och klicka på "alternativ". För autofokus alternativ väljer du det "skanna och sedan autofokus metoden. Klicka på "OK" för att spara inställningarna.
- Ställ den horisontella och vertikala förskjutningen från centrum väl (nm) till 0.Select att skanna flera bilder per brunn i en 3 x 2 montage, med horisontella avståndet (nm) = 2881 och vertikalt avstånd (pm) = 2127. Klicka på "OK" för att spara förfarande inställningar.
Obs: Se tabell 2 för lästa parametrar.
- Utföra Läs Experiment på Vald Plate
- Klicka på "instrument kontroll" -fliken och välj "platta ut" function.Place 96-brunnar i hållare, se till att locket är på. Under "instrument kontroll", välj den "plattan i" funktion. Välj "läser nu" från fliken platta. Upprepa läsa varje 24 timmar upp till 96 timmar efter sådd.
- Analys av celltal AnvändaCell Imager Software.
- För att analysera en bild, klicka på fliken "uppgifter" på den avbildade plattan, välj "bild [GFP 469, 525 + Bright fält]. Dubbelklicka på en avbildas väl.
- Klicka på en laddad bild. Välj "analysera" och välj en enda bild av montage som skall analyseras. Klicka på "OK'.Check den" GFP "kanal bara och ställa in parametrar som beskrivs i tabell 3. Klicka på" START "för att tillämpa parametrar som de avbildade cellerna.
- Observera cellräkning masken placeras över de bildförsedda celler, som används för att bestämma cellantalet per bild. Klicka på "tillämpa ändringar" och behålla dessa inställningar för varje platta avbildas hela experimentet.
- Väl tillbaka på den avbildade plattan, klicka på "Data" rullgardinsmenyn och välj "celltal. Detta kommer att generera den totala celltalet per brunn.
- Exportera alla data till ett kalkylblad genom att klicka på "export" fliken för ytterligare analys of cellantalet per brunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att studera olika metoder för att mäta proliferationen av odlade celler, cellproliferation av MCF-7-Δ40p53 transducerade celler jämfördes med den icke-transducerade MCF-7-LEGO bröstcancercellinje. De tre metoder som jämfördes - den konventionella hemocytometer metoden, cellviabiliteten luminiscens analys och cell imaging analys- beskrivs i schemat (figur 1). Varje metod har sina fördelar och nackdelar att noggrant mäta cellräkning över tiden, och den mest effektiva metoden beror på den slutpunkt krav experimentet och den information som kan förvärvas för en cellpopulation.
Tillväxten av MCF-7-LEGO och MCF-7- Δ40p53 celler mättes efter 24 h under 4 dagar. Såsom visas i figur 1, de två cellinjerna såddes vid tre olika celldensiteter (1,5 x 10 3 3; 5 x 10 3 celler / brunn) och cellräknings utfördes 24, 48, 72 och 96 h efter sådd. Varje metod visat någon ökad cellproliferation, med användning av en hemocytometer, en luminiscens-baserad analys, och en cell imager (Figurerna 2a, b och c, respektive) under 96 h. Den största ökningen av cellproliferation observerades vid den högsta celldensitet (5 x 10 3 celler), och visade också de mest reproducerbara resultat vid varje tidpunkt, vilket tyder på att detta är den optimala celldensiteten för mätning av proliferation i dessa celler. Det fanns ingen signifikant skillnad i cellproliferation mellan cellinjer.
Mätningen av cellproliferation mellan de olika metoderna jämfördes genom en linjär regressionsanalys 6 (figur 3; tabell 4). Det fanns en signifikant korrelation mellan var och en av de olika metoder som testas, när man jämför cell proliferation vid alla de celltätheter i båda cellinjerna (figur 3a och b). Den starkaste korrelation observerades mellan jämförelsen av den luminiscens-baserad analys, och cell imager (R 2 = 0,8899, p ≤0.0001; R 2 = 0,9805, p ≤0.0001, figur 3a och b, respektive).
En visuell representation av celltillväxt med hjälp av cellkameran visas (Figur 4). Eftersom denna metod använder kontinuerliga mätningar av en enda platta, kan cellerna avbildas varje 24 timmar tills cellerna når nästan 100% konfluens. Såsom visas i figur 2, tillväxttakten för de MCF-7-LEGO och MCF-7-Δ40p53 celler var jämförbara mellan alla tidpunkter. Metoden ger användbar cellulär information, bland annat att kunna visuellt övervaka celltillväxt över flera dagar, och jämföra cellstorlek och cell Morphology mellan olika cellinjer.
Figur 1: Ett schematiskt diagram av de tre olika mätmetoder cellproliferation Celler såddes vid tre olika celltätheter i flera 96-brunnars plattor och inkuberades vid 37 ° C med 5% CO2 i upp till 96 h.. Varje 24 tim, celltillväxt mättes genom att antingen använda en hemocytometer, en luminiscens-baserad analys eller cell imaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Cellproliferations Mätningar efter 96 tim Cellräkningar mättes varje 24 h under 96 h i MCF-7-LegO och MCF-7-Δ40p53 celler såddes vid tre olika celldensiteter. Cellräkningar mättes med användning av en (a) hemocytometer i celler / ml, (b) med användning av en luminiscens-baserad analys i relativa luminiscerande enheter (RLU), eller (c) en kontinuerlig cellräkning med användning av en cell imager i celler / bild. Villkor för cellkameran visas i Tabell 2. Alla experiment representerar medelvärdet av tre oberoende experiment ± SD klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Jämförelse av tre olika mätmetoder celldelningen i bröstcancercellinjer En linjär regressionsanalys utfördes för att jämföra korrelat relationer mellan de olika m undersöktes etod för att mäta cellproliferation i (a) MCF-7-LEGO-celler och (b) MCF-7-Δ40p53 celler. En Pearson korrelationskoefficient beräknades och signifikansen bestämdes (p <0,05) mellan de olika metoder för att mäta cellförökning. Alla resultat representerar medelvärdet ± SD av tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Bilder av GFP-positiva MCF-7-Lego och MCF-7-Δ40p53 bröstcancerceller Representativa bilder av celler från 5 x 10 3 sådda celler tagits med en cell kameran varje 24 timmar. Skalstrecket representerar 1000 pm. Parametrar för cell imaging sammanfattas i tabell 2. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54350/54350fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Celldensitet (celler / brunn) | |||
| celltyp | 1,5 x 10 3 | 3,0 x 10 3 | 5 x 10 3 |
| MCF-7-LEGO | 76 pl i 8,4 ml medium | 152 pl i 8,3 ml medium | 254 pl i 8,2 ml medium |
| MCF-7-Δ40p53 | 93 pl i 8,4 ml medium | 185 pl i 8,3 ml medium | 308 pl i 8,2 ml medium |
Tabell 1: cellsådd Volymerna för 96 brunnar.
"Fo: keep-med-next.within-page =" always ">Tabell 2: Läs Parametrar för cell imaging Använda Cell Imager.
| avbildningsparametrar | ||||
| Tröskel | 5000 | |||
| Minsta objektstorlek (nm) | 30 | |||
| Maximal objektstorlek (nm) | 300 | |||
| MCF-7-LEGO | ||
| R kvadrat | p-värde | |
| Hemocytometer kontra luminiscens baserad analys | 0,6301 | 0,0021 |
| Cell imager vs. hemocytometer | 0,7524 | 0,0003 |
| Luminiscens baserad analys jämfört med cellkameran | 0,8899 | <0,0001 |
| MCF-7-Δ40p53 | ||
| R kvadrat | p-värde | |
| Hemocytometer vs. luminescence-baserad analys | 0,8983 | <0,0001 |
| Cell imager vs. hemocytometer | 0,9303 | <0,0001 |
| Luminiscens baserad analys jämfört med cellkameran | 0,9805 | <0,0001 |
Tabell 4: linjär regressionsanalys av de tre olika Proliferation metoder testas.
| Metod | fördelar | nackdelar | tekniska anmärkningar | slutresultatet |
| hemocytometer | Låg kostnad | Hög mänskliga faktorn | Pipettera flera gånger för att framställa enkelcellsuspension | Celler / ml |
| Kräver minimal utrustning | Kräver singel-cellsuspension | Utför flera fall för att uppnå noggrannhet | ||
| Direkt cellräkning | Stort antal celler som erfordras för korrekt utvärdering av cellräkning | |||
| Slutpunkt | ||||
| Luminiscens baserad analys | Använd med multispot-plattformat | dyrbara reagens | Skyddas mot ljus | Relativ Självlysande Units (RLU) / brunn |
| Lätt att utföra | Kräver luminescerande plattläsare | Inkludera kontrollbrunnar för att bestämma bakgrunds luminiscens | ||
| snabb analys | Temperaturkänsliga | |||
| Ger cellviabilitet informations | Varierar beroende på metaboliska aktiviteten hos celler | |||
| indirekt mätning | ||||
| Slutpunkt | ||||
| cell imager | kontinuerlig mätning | dyra imager | Säkerställa cell imager är inställd på 37 ° C | Celler / bild |
| Temperaturkontroll | skill intensiv | Undvika onödiga skakning eller störningar av celler | ||
| Tillhandahåller cellulära informationen | Varierar beroende på sammanflytning av celler | |||
| Kostnadseffektiv (om du har kameran) | relativ count | |||
| direkt mätning | ||||
| Automatiserad avbildning av flerkälls-plattformat |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. I detta protokoll tre olika metoder för att mäta cellproliferation i odlade celler undersöktes. Varje metod kunde reproducerbara och noggranna mätningar av celltillväxt över 96 timmar, och resultaten var jämförbara mellan var och en av de testade metoderna (Figur 2 och 3). Både luminiscens-baserad analys och cellavbildningsmetod producerade de mest robusta resultat, som visar linjära ökningar i cellproliferation efter 96 h (figur 2b, c). Dessutom cell imaging tiden avbildas ingen signifikant skillnad i tillväxttakten mellan de omvandlade och icke-omvandlade cellinjer (Figur 4). Det finns många fördelar och nackdelar för varje undersökt i detta protokoll metod, se tabell 5 för en sammanfattning. Den konventionella cellräkningsmetod med användning av en hemocytometer är en låg kostnad metod som kräver mycket lite ytterligare reagens eller effort att förbereda och köra. Vidare kvantifierar denna metod en absolut cellräkning i celler / ml 14. Det finns emellertid allvarliga nackdelar, som inkluderar den tidskrävande naturen hos cellräkning, hög felfrekvens som resulterar i stora standardavvikelser mellan räknas, och det faktum att en hög rad cellantal är nödvändiga för noggranna kroppar. Detta kan ses i figur 2a, där cellräkning med användning av hemocytometer visade varierande resultat vid de låga celldensiteter, och stora standardavvikelser vid senare tidpunkter. Dessa nackdelar gör denna metod användbar för cellräkning av små provstorlekar, och otillräcklig för större hög genomströmning mätningar där mindre plåtstorlekar och sådd tätheter krävs. Dessa begränsningar skulle kunna dämpas om celldensiteten ökades, så att det minsta antalet räknade celler började vid ett tröskelvärde som är större än 100 celler. Ju mer utspädda cellsuspensionen, eller sänka cell density, desto större chans att räkna mindre än 100 celler och därmed öka variationen mellan replik 15. Emellertid är denna metod olämplig för en 96-brunnsplatta, beroende på den låga cellytan, och följaktligen, det otillräckliga antalet celler som kan användas i analysen. Detta belyser bristen på hög genomströmning kapacitet denna metod och en klar nackdel för användare som behöver denna förmåga. Luminescensen baserade analys bestämmer cellviabilitet genom att mäta mängden av ATP, som är ett mått på närvaron av metaboliskt aktiva celler 16. Denna analys är utformad för high throughput screening av multipla prover i en 96-brunnsplattformat för att bestämma cellproliferation. Denna enkla metod kvantifierar cellproliferation som en relativ luminiscens enhet (RLU) med användning av en plattläsare, vilken är proportionell mot ATP närvarande i de metaboliskt aktiva celler. Emellertid är den största nackdelen med denna metod than kosta av reagenset, och beroendet av mätningen på den metaboliska aktiviteten hos cellerna. Olika cellodlingsbetingelser, såsom temperatur eller cellcykeltidpunkter, kan lätt påverka mängden av ATP produceras av cellerna, som är direkt proportionell mot den luminescerande signalen som genereras av analysen 17. Därför är det viktigt att empiriskt bestämma att villkoren i experimentet inte stör den metaboliska aktiviteten för cellerna och potentiellt hindra den relativa luminiscenta signal, som alstras av cellerna. Den tredje metoden undersöktes för bestämning av celltillväxt var en levande cell kameran och programvara för att utföra en relativ celltal. Cellkameran har hög genomströmning kapacitet eftersom det kan automatiseras för att fånga flera bilder för varje brunn, i realtid tillsammans med temperaturkontroll, genom att använda samma celler under hela analysen. Såsom visas i figur 4, kan cellproliferation vara monitored i samma platta över ett tidsförlopp, som kan ge ytterligare information om cellpopulationen tillsammans med cellräkning analys. Detta är mycket fördelaktigt eftersom det eliminerar tvärplatta variabilitet och cellsådd fel, vilket är vanligt i 96-brunnars plattformat. Programmet som medföljer cell imager medger kvantifiering av cellräkningar med hjälp av de parametrar som anges i tabell 2 och 3. Det är därför lämpligt i en hög genomströmning inställning och kan lätt multiplexeras till andra analyser för att mäta cellulära funktioner såsom apoptos eller cytotoxicitet. En stor nackdel med systemet är mjukvaran, som är begränsad i sin förmåga att dela röra föremål. Även om det kan utföra denna funktion i lägre confluence celler är det en stor begränsning av analysen och kräver därför celltypsspecifik optimering. Dessutom, medan enskilda experiment med användning av en avbildnings är mycket låg kostnad på en tallrik-by-platta skala, denna metod skulle påly vara kostnadseffektivt om instrumentet redan inrättat i ett laboratorium. Därför ger detta en ny metod för mätning av cellproliferation av odlade celler, och har den stora fördelen att den kräver inga ytterligare reagens, och är i stånd att 96 brunnars platta automatisk räkning, vilket gör denna metod lämplig för hög genomströmning analys. Detta är en betydande förbättring jämfört med konventionella hemocytometer cellräkning metod, och är ett mer kostnadseffektivt alternativ till luminiscens baserad analys. Det kritiska steget vid användning av cellkameran är under analys av de tagna bilderna och efterföljande cellräkning per bild. Dessa bilder kan bearbetas med hjälp av ett antal cellavbildningsplattformar. Det är därför av största vikt att fastställa den lämpligaste programmet för den celltyp som undersöks. Det skulle vara bra att validera cellräkningar från bilderna som förvärvas av cell-kameran med hjälp av olika bildbehandlingsprogram. Detta protokoll skulle kunna tillämpas på eny odlade celler, men analysparametrarna skulle behöva definieras för varje cellinje. Detta kan vara tidskrävande i början, men när parametrarna har ställts in, kan metoden automatiseras för att avbilda hela plåtar åt gången. Det är viktigt att notera att dessa analyser är i själva verket ett indirekt mått på spridning, eftersom de mäter cellantal (hemocytometer, cell imager), eller metabolisk aktivitet (luminiscens-baserad analys), över en tidsperiod. Dessa metoder kan lätt ändras för att mäta andra viktiga faktorer som kan påverka spridningen. Till exempel kan den trypanblått exklusionsmetoden lätt införlivas i antingen hemocytometer eller cell imager metod för att utesluta döda celler och därmed bestämma cellviabiliteten 13. Den luminiscens-baserad analys kan multiplexeras med en cytotoxicitetsanalys att ge ytterligare information om cell hälsa, och den metaboliska aktiviteten mätt under denna analys är också ett mått på cell viability 12. Därför flexibiliteten i dessa analyser som skall multiplexeras med andra analyser för att ge ytterligare cellulär information är en stark fördel för var och en av dessa metoder. Detta protokoll som används den humana bröstcancer-cellinjen MCF-7, vilka har stabilt transducerade med LEGO-IG2-puro + vektor innehållande GFP-genen. Detta möjliggör användning av GFP optik filter på bilden cellerna, utan behovet att lägga till några färgämnesmedel in i odlingsmediet. Denna metod kan lätt ändras till bild GFP-negativa celler eller ens primära cellinjer, antingen genom att avbilda de celler med ljusa fält optik typ, eller genom att märka cellerna med en spridning markör. De metoder som jämfördes i detta protokoll är robust nog att användas i en mängd olika cellinjer, men de optimala protokollinställningarna för varje enskild cellinje bör fastställas först. Avbildning av celler med hjälp av ljusa fält kanalen representerar det bästa alternativet för primär cells eller de som är långsamt växande, på grund av den långsiktiga natur med denna metod. Slutpunktsanalyser, såsom luminiscens-baserad analys, är inte väl lämpade för analys av långsiktig celltillväxt. Detta protokoll har beskrivits tre olika metoder för att mäta cellproliferation in vitro. Varje metod kan rutinmässigt i laboratoriet för att mäta celltillväxt, och de flesta laboratorier skulle ha de kunskaper som krävs för att utföra en av dessa metoder. Men det finns också en rad andra analyser finns för mätning av delande celler. Dessa kan bestå av metoder som mäter DNA-syntes, metabolisk aktivitet, associerade antigener av spridning eller ATP koncentration 9. Till exempel, har ett antal analyser utvecklats för att mäta graden av DNA-syntes av celler genom att märka cellerna med en radioaktiv substans såsom 3H-tymidin. En nackdel med denna metod är den uppenbara användningen av radioaktiva ämnen, och deras bortskaffande. Andrametoder, som rutinmässigt används för att mäta cellproliferation inkluderar användning av BrdU märkning av nybildade DNA, som kan mätas med användning av flödescytometri 18. Flödescytometri kan användas för att analysera både cellantalet såväl som cellcykelinformation. Detta kan vara ett fördelaktigt utfall för vissa experiment, men nackdelarna med denna metod innefattar den extra tid och steg, dyra reagens och ökad användar utbildade färdigheter för att driva flödescytometern och analysera resulterande data 18. Därför finns det många olika analyser som är tillgängliga för forskare att utvärdera tillväxten av celler, och den valda metoden är till stor del beroende på celltypen som används, användaren och deras kompetensnivå, och typen av data som krävs vid slutpunkten av experimentet. Sammanfattningsvis användes tre olika metoder för att mäta cellproliferation jämfört med användning av bröstcancerceller. Varje metod har många fördelar och disadvantages, och är därför användarberoende och baserat på deras krav för varje experiment, i termer av att bestämma den mest lämpliga analysen för att utföra cellräkning. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian. Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Discussion
Disclosures
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 µg/ml insulin and 1 µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Cell Biology. Celis, J. E. , Third Edition, Academic Press. 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , http://au.promega.com/resources/pubhub/automated-profiling-using-the-cybi-felix-instrument-cell-health-assays-and-thaw-and-use-cells (2014).
- CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/101/celltiterglo%202%200%20assay%20protocol.pdf (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. Application Guide: Automated Digital Microscopy. , http://www.biotek.com/resources/articles/automated-digital-microscopy.html (2015).
- Bastidas, O. Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , http://www.celeromics.com/en/resources/Technical%20Notes/cell-article-chamber.php (2016).
- Bastidas, O. Technical Note: Cell Count for Low Concentration Samples . , http://www.celeromics.com/en/resources/docs/Articles/Low-concentration-cell-counting.pdf (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H., et al. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/ (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , (2013 May 1 [Updated 2015 Jun 29]) https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSVerse_CellCycleAnalysis_AppNote.pdf 1-12 (2011).
Tags
Cancer Biology molekylärbiologi cellproliferation bröstcancer cell imaging cancerbiologi cellräkning View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
