Summary
인지질의 지방산 토양 미생물 커뮤니티의 구조에 대한 정보를 제공한다. 우리는 단상 클로로포름 혼합물을 고체상 추출 칼럼을 사용하여 추출한 지질의 분류 및 모세관 가스 크로마토 그래피로 분석 지방산 메틸 에스테르를 생성하기 위해 메탄과 토양 시료로부터 추출하기위한 방법을 제시한다.
Abstract
인지질의 지방산 (PLFAs)는 미생물의 세포막의 주요 성분이다. 토양에서 추출 PLFAs의 분석은 지상파 미생물 지역 사회의 전체 구조에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. PLFA 프로파일 광범위 전체 토질의 생체 지표로 생태계의 범위에서 사용되고, 토양 반응의 정량적 지표로 관리 및 기타 환경 스트레스 착륙.
단상 클로로포름 혼합물로 토양 시료로부터 (1) 지질 추출, 2. 분획 다른 추출 된 지질로부터 인지질을 분리 고상 추출 컬럼을 사용하여 지방산을 생산하는 인지질 3. 메탄 : 여기에 제시된 표준 방법은 네 가지 주요 단계를 설명 메틸 에스테르 (FAMES) 및 불꽃 이온화 검출기 (GC-FID)를 사용하는 캐 필러 리 가스 크로마토 그래피 분석 4. FAME. 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (PC (19을 포함하여 사용되는 두 개의 기준 :이 0/19 : 0))를 추출 방법의 전반적 회복을 평가하고, 메틸 데 카노 에이트 (MeC10 : 0) GC 분석에 대한 내부 표준 물질 (ISTD)로서.
Introduction
인지질 지방산 (PLFAs)는 도메인 박테리아와 Eukarya에서 미생물 세포막의 일부입니다. 미생물 즉각적인 환경 조건에 따라 세포막 무결성 및 세포 기능을 유지하기위한 수단으로서 다양한 사슬 길이 및 조성물 PLFAs 생산; 따라서이 비슷한 토양 조건에 지리적으로 분리되어 있지만, 대상이되는 미생물 지역 사회가 비슷한 PLFAs을 표현하는 것이라고 주장 할 수있다. 14 20 C 원자 사이의 사슬 길이와 토양 PLFAs는 일반적으로 주로 세균 및 진균 기원 (1)로 간주된다. 혼합 배양에서 PLFA 분석은 개별 미생물 종을 식별하는 데 사용될 수 있지만, 토양에있는 미생물 군집의 전체 지문을 제공 할 수있다. PLFAs 빠르게 세포 사멸에 분해되기 때문에, 또한, 이들은 살아있는 토양 미생물 집단이 나타내는 것으로 간주 될 수있다. 이 절반hnique 광범위 5-6 대초원 숲 3-4 이르기까지 다양한 환경에서 발견되는 미생물 군집, 및 농업 분야 (7)의 구성 성분을 특성화하는데 사용되어왔다. 그것은 성공적으로 숲은 금속 (14)와 탄화수소 (15)에 의해 화재 13, 오염 등의 장애뿐만 아니라, 매립 10-12, 8 명확한 절단 9 석회를 포함하여, 관리 변경 토지 토양 반응의 특성을 적용하고, 곤충 발생 16 한 .
현대 PLFA 분석 방법은 연구 그룹의 숫자에 의해 몇 가지 주요 발전을 통해 마지막 여섯 년 동안 진화. 이상성 시스템 (17)에 단상에서 혼합물 시프트 추출 용액에 물 비율 : 메탄올 : 1958 년 상당한 개선 클로로포름 조정에서 일어났다. 이 최적화 된 지질 추출 및 개정 된 분리 프로로토콜은 후 Bligh와 다이어 방법으로 알려지게되었다. 이 프로토콜은이 시간 동안, 화이트와 동료 방법에 상당한 발전에 기여, 향후 몇 년 동안 많은 실험실에 의해 채택되었다; 예를 들어, 이들은 물 인산 완충액 교환에 의한 추출 공정을 개선하고 향상된 피크 식별 및 정량화를 통하여 가스 크로마토 그래피 (GC)에 의한 분석을 최적화. 아마도 토양 과학에 더 관련성, 그들은 해양 퇴적물 (18)의 미생물 생물량을 조사 할 때 상기 추출 된 지질을 미생물 구조의 지표로 사용될 수 있음을 1979 결정.
이 방법이 더 널리 특히 근권 (19)과 관련하여, 토양 과학에 사용되었다으로 추가 개발은 1980 년대에 발생했습니다. 이 때,이 방법은 메틸 nonadecanoate 포함 (MeC19 : 0) 내부 표준 (19) 및 지질 분획 21 <대한 규산 컬럼의 사용과 같은/ SUP>. 화이트 19, 21와 그의 작품에 따라, Tunlid 스웨덴으로 돌아와 바트와 Frostegård와 공동 연구를 시작했다. 유기물 함량의 변화 토양 제품군의 다른 추출 버퍼의 효율을 조사함으로써, 그룹은 구연산 완충액은 포스페이트 버퍼 (22)에 비해 추출 된 지방 인산의 양이 증가 된 것으로 나타났다. 또한, 토양 미생물 커뮤니티에 석회의 영향에 대한 자신의 1993 간행물 (23)는 토양 생물학 및 생화학 (24)에서 인용 고전이 될했다. 연구자들은 데이터 처리에 대한 주성분 분석을 이용했다. PLFA 분석, 방법은 현재 호출되면, 대용량 데이터 세트를 생성하고, 이러한 데이터를 처리하기위한 다 변수 통계 방법의 사용에 매우 많은 시간을 혁신적 영감이었다. 작품에 동시 스웨덴에서 수행되며, 상기 PLFA 절차에 대한 수정이 조사되고 있었다독일에 의해 Zelles와 동료 25 ~ 26. 절차 이들 버전은 전체적으로 더 실험실 집약적이고, 고상 추출 (SPE) 컬럼 대신에 규산 칼럼의 사용을 위해 주목할했지만.
화이트 & Ringelberg (27)에 의해 상세한 방법론과 함께 Frostegård의 종이 (23)는, 토양 과학에 대한 근본적인 질문을 조사 할 PLFA 기술의 사용에 폭발에 대한 기초를 제공했다. 및 C19 : 이후 파이어 동료에 의한 방법의 더욱 세분화 내부 GC 표준 (0 C10) : 추가 포함했다 부량 (28)을 개선하기 위해 대리 기준으로 0과 분액의 사용을 대체가 단순화 둥근 바닥 튜브 퍼널 추출 29. 최근 Chowdhury 딕 30 메틸화 단계를 조사 토양 과학 문헌 코 / 메탄올 방식 식별자에 사용 된 두 개의 메틸화 절차의보고지방산의 더 큰 범위를 지정한 본.
제시된 방법은 크게 후 Bligh 및 다이어 의해 개발 된 기존 방법에 따라, 이러한 메틸화 단계 KOH 메탄올의 사용과 같은 상기 언급 된 변형을 포함한다. 두 기준은 각각의 샘플에 사용되어, 제 1 추출 전에 토양 시료에 첨가 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (: 0/19 0) PC (19) ()의 대리 표준 효율성과 전체 프로토콜의 복구, 메틸 데 카노 에이트의 구 규격 평가할 (MeC10 : 0), GC에 의해 식별 및 정량화하기에 앞서 추가된다.
우리는 PLFA 방법은 일반적으로 전 세계적으로 많은 미생물 생태 연구소에 의해 사용되며, 표준화 2 국제기구를 포함, 여러 번 기록되어 있음을 인정합니다. 본 논문의 목적은 토양에 유용 할 수있는 프로토콜 따라하기 쉽고 강력한을 제시하는 것입니다PLFA 기술을 배우려고 노력하는 과학자.
Protocol
참고 : 항상 그 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 보장하는 프로토콜에 걸쳐 착용한다. 유리는 맨손으로 접촉 할 수 없습니다. 손가락, 머리카락, 그리스, 오일 및 탄화수소의 지질은 모든 잠재적 인 오염 물질이다. 깨끗한 유리를 취급 할 때는 항상 70 % 알코올로 니트릴 장갑, 린스 장갑을 착용하십시오.
분석을위한 유리 1. 준비
- 일회용 유리 (예를 들어, 원심 분리기 튜브)
- 450 ºC에서 4.5 시간 동안 머플로 알루미늄 포일에 감싸 열.
- 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)은 캡; 라이닝
- 인산염 세제에서 한 시간 동안 뚜껑을 만끽 한 다음 뜨거운 물과 인산염 세제 스크럽 브러시로 세척한다. 수돗물과 비누를 씻어.
- 만 (이상 라이너들이 너무 오래 담가하는 경우 캡에서 떨어질 수로 남겨 않는다. 세 번 씻어 산 욕조에 넣어 한 시간 (5 % HCl)수돗물한다. 증류수에 세 번 씻어. 40 ºC에서 오븐에서 건조.
- 재사용 유리 (예를 들어, 10 ㎖, 15 ml에 45 ml의 유리 병 / 항아리)
- 뜨거운 물과 인산염 세제 스크럽 브러시로 세척. 산 목욕 (5 % HCl) 하룻밤에 수돗물과 장소 비누를 씻어. 다음 40 ºC에서 오븐에서 세 증류수 시간 후 건조 린스, 수돗물에 세 번 씻어.
- 깨끗한 알루미늄 호일에 싸서 (50 ㎖ 항아리 개별 포장하고 다른 유리 샘플 일괄 적으로 싸여있다, 예를 들어, 20) 450 ºC에서 4.5 시간 동안 머플로에서 열.
- 체적 유리 (예를 들어, 부피 플라스크)
- 뜨거운 물과 인산염 세제 스크럽 브러시로 세척. 산 목욕 (5 % HCl) 하룻밤에 수돗물과 장소 비누를 씻어. 수돗물에 세 번 씻어 증류수에 세 번 헹구고, 40 ℃에서 오븐에서 다음 건조# 186; C.
- 머플의 체적 유리 넣지 않도록 - 용매를 소량 (예 : 메탄올)로 3 회 씻어 사용하기 전에.
이전 PLFA 분석 2. 수집 및 토양 샘플의 처리
- 멸균 봉지에 토양 시료를 수집하고, 이러한 즉시 분석 할 수없는 한, 가능한 한 빨리 동결. 준비가 될 때까지 냉동 (-80 ° C)에 보관 샘플은 샘플의 동결 건조를 진행합니다. 동결 건조기의 지침에 따라 샘플의 건조 배치를 고정.
- 새로운 표지 멸균 가방에 각각의 동결 건조 샘플을 전송합니다. PLFA 추출을위한 사전 표지 숨막히는 원심 분리기 튜브로 가방에 동결 건조 재료 샘플을 달다.
주 : 일반적인 지침은 유기물 (탄소 함량> 17 % 중량) 및 광물질 토양 시료 3.0 g을 0.5 g을 사용하는 것이다. 각 샘플 녹음 샘플 무게. - 매 10 샘플의 경우,도를 무게분석을 위해, 모든 샘플을 20 추가 중복에는 빈 (즉, 그것의 임의의 샘플이없는 원심 관 - PLFA 추출 과정 중에 오염 가능성을 식별하기위한 대조군으로 사용). 동시에 샘플링 튜브의 배치 방법.
참고 : 20 샘플의 세트는 23 샘플 관의 배치에 대응하는 것 (샘플 1 내지 10, 시료 (10)의 하나의 중복, 샘플 12 (22), 시료 (22)의 하나의 중복, 23 샘플 관의 한 빈 = 배치).
참고 : GC 분석을 준비하고 함께 그들 모두를 실행하기 전에 샘플의 일괄 다음 다음 추출, 분리, 메틸화를 실시한다. 이것은 아무것도 잘못되면 실수가 일어난 위치를 파악하고, 필요한 반복 추출의 수를 줄이는데 도움이 될 수 있습니다.
3. PLFA 기법 (단계를 한 번에 각각의 샘플하지만 완전한 하나의 전체 배치 용입니다)
주의 : 단계들에서 설명 된 PLFA 기술의 모든 단계1-3 아래에 적절한 PPE를 사용하여 실험실 안전 지침을 다음과 흄 후드에서 수행되어야한다.
- 추출 (단계 1)
- 증류수 50 ㎖의 KOH의 14g, 탈 이온수 (DH 2 O)을 용해하여 5.0 M KOH를 준비합니다.
- DH 2 O. 400 ㎖에 31.52 g 시트르산 일 수화물을 용해하여 0.15 M 시트 레이트 완충액을 준비 5.0 M KOH를 첨가하여 pH를 4.00 ± 0.02로 조정한다; 약 5.0 M KOH의 45 ~ 50 ml를 4.00로 pH를 조정하기 위해 요구 될 것이다. pH를 조정할 때, 메스 플라스크를 이용하여 1,000 ml의 시트르산 완충액 희석. 사용하지 않을 (최대 1 개월) 냉장고에 시트 레이트 버퍼를 저장합니다.
- (이 23 샘플들의 배치 충분한 대리 표준을 제공) 25 ㎖의 클로로포름에 원액 (10 ㎎ / ㎖) 250 ㎕의 희석 nonadecanoate 대리 표준 매일 PC (0 : 0/19 19)을 준비한다. PC의 0.5 ml의 추가 (19 : 0/19 : 0) 샘플 원심 관에 대리 표준 용액.
- 에이다음 순서에 따라 토양 샘플에 대한 후 Bligh 다이어 및 추출 제를 dd는 : ⅰ) 2.0 mL의 시트 레이트 완충액, ⅱ) 2.5 ml의 클로로포름, 및 ⅲ) 5.0 mL의 메탄올. 30 초에 대한 PTFE 늘어선 모자와 소용돌이와 모자 샘플; 2 시간 동안 엔드 오버 엔드 통에 넣습니다.
- 에 모자와 15 분 동안 226 XG에 원심 분리기. 레이블이 45 mL 유리 병에 파스퇴르 피펫 및 전송과 상층 액을 그립니다.
- 각 샘플에 후 Bligh와 다이어 추출 제의 두 번째 라운드를 추가하고 위의 4 단계와 5 단계를 반복합니다. 같은 레이블 45 ㎖의 유리 병에 파스퇴르 피펫 및 전송과 상층 액을 그립니다.
- 레이블이 45 mL 유리 병 포함하는 상층 액에 추가 ⅰ) 5.0 ml의 클로로포름하고, ⅱ) 5.0 ml의 시트 레이트 버퍼를. 흰색 PTFE가 늘어선 모자와 소용돌이 유리 뚜껑 30 초 동안 유리 병. 이 (산화를 피하기 위하여) 어둠 속에서 실온에서 밤새 앉아 보자.
- 조심스럽게 45 ml의 유리 병의 상부 수성 상 (더 진공을 사용할 수없는 경우, 피펫을 통해 aque 저하한다을 진공유기 상을 피펫 팅 할 때 매우 신중 같은 OU에 단계) 피펫의 모든를 수집하지합니다. 레이블이 15 ml의 유리 병에 피펫 낮은 유기상.
- 상온에서 압축 된 N 2 (산화를 방지하기 위해)에서 15 ㎖의 유리 병의 장소에 배치. 바이알 내의 액체 표면 프릴하지만 바이알의 측면을 상승하지 않도록 N 2 흐름 설정 해제 천천히 클로로포름을 증발시켰다.
- -20 냉동실에 PTFE가 늘어선 모자 및 저장 샘플에 나사 ºC 2 단계를 진행하기 위해 준비가 될 때까지 알루미늄 호일 (개별적으로 배치하는 대신에 랩)에 싸여.
- 지질 분류 (단계 2)
- 유리 탱크에 스피와 SPE 컬럼 홀더를 배치합니다. 스피에 새 SPE 컬럼 (실리카, 500 ㎎, 6 ml)에 삽입합니다. 필요에 따라 라벨 열 (샘플을 혼합하지 않도록 권장).
- (아세톤 5 mL를 첨가하고,이를 통해 배출 시켜서 각 열을 컨디셔닝하고 5 ㎖의 클로로포름을 첨가 개의 추가총 용적 = 10 mL)을 첨가 하였다. 두 번째 클로로포름 세척은 1 ~까지 mm 프릿 이상 유출 후 마개를 닫으 할 수 있습니다.
- 부드럽게 유리 병 및 소용돌이 0.5 ml의 클로로포름을 첨가하여 (1 단계의 마지막에 15 ml의 유리 병에 저장) 샘플을 다시 녹인다. 전송 파스퇴르 피펫을 사용하여 SPE 칼럼에 샘플을 재 용해; (2) 전송의 총 (샘플 당 1 ml의 클로로포름의 총 전송 용량)에 대해 반복합니다.
- 열 센터에 직접 지질 샘플을 놓고 탱크에 완전히 배출 용매 수 있습니다.
- 각 컬럼에 클로로포름 5 ㎖을 첨가하여 중성 지질 용출. 탱크에 완전히 배출 용매 허용합니다.
- 각 컬럼에 아세톤 5 mL를 추가하여 당지질을 용출. 수집 탱크에 완전히 배출 용매 허용합니다.
- 열이 탱크에서 서서 진공 장치와 탱크 드레인 제거합니다. 탱크에 깨끗하고 표시된 원심 분리기 튜브 랙을 삽입합니다. 열이 탱크에 서 교체; 표시된 열은 상기 표시 CENTR으로 정렬한다아래 ifuge 튜브.
- 각 컬럼에 메탄올 5 ㎖를 첨가하여 원심 분리 튜브에 인지질을 용출. 이를 폐기하기 전에 흄 후드에서 건조 SPE 열 때까지 기다립니다. 압축 N 2하에 실온에서 건조 아래 인지질 분수.
- -20 ºC에서 냉장고에 PTFE가 늘어선 모자와 매장 샘플에 N 2. 나사와 퍼지 튜브는 3 단계로 진행하기 위해 준비가 될 때까지 알루미늄 호일 (개별적으로 배치하는 대신에 랩)에 싸여.
- 지질 메틸화 (단계 3).
- 37 ºC로 설정 온수 욕조를 켭니다. 1,000 mL의 메스 플라스크를 사용하여 1,000 ml의 DH 2 O의 57.1 ml의 빙초산을 용해하여 (이미 만들어진되지 않은 경우) 1M 초산을 준비합니다. 이 용액을 최대 석 달 동안 실온에서 저장 될 수있다. .
- 메탄올 KOH의 배치를 준비합니다. 40 ml의 메탄올에 0.45 g의 KOH를 용해하여 0.2 M KOH 용액을 준비합니다. A에 따라 KOH의 볼륨과 메탄올을 조정3 단계 매일이 솔루션을 준비에 nticipated 배치 크기; 오랜 기간 동안 저장하지 않습니다.
- 냉동고에서 (2 단계 후 저장 원심 분리기 튜브에서) 샘플을 제거하고 시료를 실온에 올 수 있습니다. 1.0 ml의 메탄올 KOH 다음에 0.5 ml의 클로로포름, 각 시료 0.5 ml의 메탄올을 추가합니다. 캡 튜브 단단히 PTFE 일렬로 세워진 모자. 혼합 소용돌이 친다.
- 30 분 동안 37 ºC 욕조에 밀봉 된 샘플을 놓습니다. 수위가 샘플 액체의 수준보다 1-2mm 최소인지 확인. 제거하고 시료를 냉각 할 수 있습니다. 샘플을 물을 욕조에있는 동안, 샘플 ID를 (PTFE 일렬로 세워진 모자 10 ml의 유리 병)와 작은 유리 병 레이블을 붙입니다.
- 각각의 샘플과 소용돌이에 2.0 ml의 헥산을 추가합니다. 그런 다음 각각의 샘플에 다시 섞어 소용돌이 1.0 M 아세트산 0.2ml를 추가; 상 분리가 볼 수있게한다.
- 상을 깰 각 샘플에 DH 2 O의 2.0 ML을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 샘플. 2 분 동안 226 XG에 다음 원심 분리기 샘플.
- 사용짧은 파스퇴르 피펫은 상위 단계 10 ml의 튜브를 표시 청소하려면 전송합니다. 하부 (수성) 단계 중 하나를 전송하지 않도록주의하십시오.
- 각 샘플의 원심 분리기 튜브와 소용돌이에 2.0 ml의 헥산을 추가합니다. 30 초 동안 소용돌이 샘플. 2 분 동안 226 XG에 다음 원심 분리기 샘플.
- 짧은 파스퇴르 피펫을 사용하여 다시 라벨링 10 mL 유리 바이알에 가기 위상을 추가한다.
- N 2하에 실온에서 표지 된 10 ㎖의 유리 바이알에 용매를 증발시켰다. -20 냉동실에 PTFE가 늘어선 모자 및 저장 샘플에 나사 ºC GC 분석을 진행 할 준비가 될 때까지 알루미늄 호일 (개별적으로 배치하는 대신에 랩)에 싸여. 모든 샘플 라벨을해야합니다.
- 가스 크로마토 그래피 (GC) 분석
참고 : 개별 PLFAs의 식별 및 정량은 FID 또는 MS 검출기 중 하나에 연결된 GC를 사용하여 수행됩니다. 지시 아래 GC-FID에 대한 있지만, 샘플 준비 GC-MS 유효 것이다 w로엘. 초기 온도 285 ºC 190 ºC, 램프 10 ºC / 분하십시오 GC-FID 시스템의 예 설정은 0.33 μm의 (5 % 페닐) × -methylpolysiloxane 다음의 온도 프로토콜에 열을 0.2 mm × 25 미터 포함 할 것 , 램프 (60) 310 ºC로 ºC가 / 분, 0.42 분 (31)를 유지, 9.5 분을 개최합니다.- MeC10 한 방울 추가하여 GC 내부 표준 물질 (ISTD)를 준비 : 100 ㎖ 헥산 0 (메틸 카노 에이트를) (기록은 0.1 mg의 무게를 추가). GC에 가스를 켠 다음 GC의 전원을 켭니다. H 2, N 2, 공기 실린더가 열려 및 분석을 실행할 수있는 충분한 가스가 있다는 것을 확인하십시오 (H 2는 500 psi의 아래 결코한다).
- 좋은 교정의 조건 헥산 빈 다음에 지방산의 혼합을 포함하는 교정 표준을 실행하여 충족되는지 확인합니다. 개인 지방산의 신원 수동 표준 수득 유지 시간과의 비교에 기초하여 할당 될 수 있거나,이 될 수 AUTOMATICA에서야 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 (31)를 사용하여 할당. 모든 경우에, 명확한 식별이 MS 검출기 (2)를 사용하여 달성 될 수있다.
참고 : 좋은 교정의 추가 징후는 평면 기준 및 헥산 린스에 어떤 오염을들 수있다. - 샘플 응답이 같은 매우에서와 같이, 약한 것으로 예상되는 경우 대안으로 50 ~ 75 μl를 사용합니다 (ISTD 용액 150 μL에 (지질 메틸화 3 단계에서 10 mL 유리 바이알에 포함 된) 각 PLFA 샘플 잔류 물을 용해 GC 유리 병에 넣고 모래 토양).
- 2 μL로 시료 주입 볼륨을 설정합니다. 300 ºC로 FID 온도를 설정합니다. 캐리어 가스 (유량 1.3 ml / 분) 및 (30)의 분할 비로서 H 2 250 ºC의 입구 온도를 이용하여 샘플을 실행 한.
Representative Results
X는 탄소 원자의 수를 나타낸다 YωZ는, Y는 이중 결합의 수를 나타내고, Z는 분자의 지방족 (ω) 단부로부터 제의 이중 결합의 위치를 나타낸다 : 지방산 X로 지정된다. 접미사 'C'와 't'는 시스 및 트랜스 기하 이성체를 나타냅니다. 'i'를 접두사와 접미사 '이'와 안테 이소 이소 나를 분기와와 OH 각각 메틸 그룹 및 하이드 록실 그룹을 지정을 참조하십시오.
후 GC 실행, 샘플 10을보고 적절한 ISTD을 받았는지 확인합니다 : 0 피크. 또한 GC 표준의 응답을 확인, 즉 추가 ISTD 헥산 용액을 함유하는 바이알; 이들은 다른 피크가 없어야한다. 내부 표준 응답은 모든 실행에 걸쳐 유사해야합니다.
그림 1은 representa을 제시적인 샘플 실행됩니다. 큰 헥산 용매 피크가 특징적으로 1.8 분 주위에 머무름 시간 (RT)에 나타납니다. 0 16.2 분의 RT가 다음 ISTD 표준 피크 : C19는 동안 (C10 0), 3.4 분의 RT에 나타납니다. GC 분석의 긴 체인이 더 느리게 용출과의 쇄 길이에 기초하여 PLFAs 분리; 예를 들면, C18 : 0 C16 동안 14.4 분에서 용출 : 0 10.8 분에서 용출된다. 또한,이 분석 프로토콜 및 불포화 이중 결합의 위치를 그 정도에 기초 PLFAs을 분리 할 수있다; 예를 들면, C18 : 0, 14.4 분에서 용출하면서 C18 : 1 9C 및 C18 : 1 14.0 14.1 7C 용출 분을 각각 (도 1). 마지막으로, 유사한 사슬 길이 및 분지 포화하지만 다른 구성 (안테 이소 대 ISO)의 PLFAs을 분리 할 수있다; 예를 들어, C15 : 0I 및 C15 : 각각 8.6 및 8.7 분에서 0A의 용출 (그림 1).
다른 GC 피크의 영역은 메신저가 될 수상기 가스 크로마토 정보를 처리하기 위해 스프레드 시트로 이식. 각 식별 PLFA은 (nmol의 건조 토양의 g -1)은 다음의 방정식을 사용하여 정량화 하였다 :
F는 계정 FID 선택성 및 지방산 (32) 사이의 몰 농도의 차이를 취하는 조정 인자이고, areaPLFA 각 식별 PLFA, areaC10 피크 면적이 0이 ISTD의 피크 면적이다 (MeC10 : 1), C10 : 0 추가 STD는 ISTD (nmol의)의 양은 앞서 GC 실행으로 각각의 샘플에 첨가하고, 비율 (C19은 0 성병 / C19 첨가 : 0 샘플)는 PC의 복구에 대응한다 (C19 : 0 / C19 : O) 대리 표준 및 시료 중량을 오븐 건조 토양 (g)의 양이 원래 샘플 원심 분리 튜브에 첨가하고 PLFAs를 추출하는데 사용된다.
참고 : differe 아래 지역NT 피크는 GC 시스템에 따라 피크 영역 반응 또는 반응 %로서 표현된다. 토양 PLFA 특성과 관련된 범위 내에서, 지역은 지방산의 중량에 선형 비례하는 것으로 가정 될 수있다; 대안 적으로, 작은 보정 계수는 32 FID 선택성을 고려하여 적용 할 수있다. 결과는 초기 중량 % 기준으로 표시하기 때문에 또한, 그들은 몰량을 수득 정규화 될 필요가있다. 고려 개인 지방산의 분자량을 취함으로써 달성된다 몰 농도의 차이를 조절하는 단계; 게시 된 테이블 (32)와 상용 소프트웨어 (31)는 몰 농도에 대한 정상화 할 때 도움을 사용할 수 있습니다.
ISTD (nmol의)의 양은 추가로 계산 될 수있다 각각의 샘플에 첨가 :
C10 : V × = [ISTD] 추가 0std (STD 추가)
[ISTD]을 농도 MeC10의 (nmol의 리터 -1) 여기서 : 0 (메틸 데 카노 에이트) 헥산에 용해하고 (단계 3.4.1 참조), V는 (STD 첨가)이 볼륨 준비 ISTD 용액 (L)는 GC 실행하기 전에 각 샘플에 추가 (즉, 3.4.4 단계에있어서, 150 μL).
C19의 양 : 0 (nmol의) GC 분석시 각 샘플에 존재에 대응 :
여기서 areaC19 : 0 C19의 피크 면적은 : C19의 대응 량 중에 O : 0 (nmol의)가 PLFA 추출법의 시작에서 각 샘플 (참조, 단계 3.1.3)를 첨가 하였다 :
여기서, [19 : 0] 표준 (mg을 L -1 (19 : 0 STD 첨가)되는 PLFA 추출의 시작 부분에서 각 샘플에 첨가 준비된 대리 표준 용적 방법 (참조, 단계 3.1.3), M (19) : 0 1,2- dinonadecanoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린의 분자량 (: 0/19 : PC (19 0)).
참고 : C19 1 몰 : 0 nonadecanoate 대리 표준 수확량이 C19의 몰 : 메틸화 단계 다음 공은 C10 동안 : 0 표준 메틸화 후 추가됩니다.
다음 PLFAs는 일반적으로 토양 미생물 커뮤니티 분석에서 제외된다 : I)의 길이 <14 C 및> 20 C이다 PLFAs 및 피크 면적의 합계의 0.5 % 미만으로 II) PLFAs. 이러한 PLFAs 제외 되었다면, 나머지 PLFAs 모두의 응답은 총 PLFA 양방향을 구하는 합산 될 수있다omass (건조 토양을 nmol의 g-1). PLFA 데이터 변량 분석 (예, ANOVA 테스트가 수행되는 가정에 부합하도록 적절한 데이터 변환 후) 총 PLFA 바이오 매스 및 / 또는 샘플 그룹 / 치료제 중에서 선택된 그룹 PLFA 생물량과 비교하는데 사용될 수있다. 예를 들어,도 2를 제시한다 어느 중쇄 (10- 메틸) 또는 말단 분기와 같은 직쇄 포화 PLFAs 상이한 PLFA 기, 포화 PLFAs의 상대적 분포 결과 및 불포화 PLFAs,뿐만 아니라 모노 - 또는 총 PLFAs의 합 (건조 토양을 nmol의 g-1). 이 특정 예에서, (역 1 내지 3 역으로 감소) 나무의 연령 총 PLFAs 및 다른 PLFA 기의 상대적인 분포 모두에 영향을 알 수있다.
샘플 중 PLFA 조성물의 전체 패턴을 평가하기 위해, 모든 PLFAs의 다변량 분석의 행위와 할 수있다33 cted. PLFA 데이터는 Hellinger 변환은 종종 데이터를 상대화하는 데 사용되는 예를 들면, 어드레스되는 통계적 시험 및 연구 문제의 가정을 만족하기 전에 선택된 다변량 분석에 필요한 변환 될 필요가있다. 비로부터도 3의 결과를도 그림 2에 사용 된 동일한 데이터의 -metric 다차원 스케일링 (NMDS) 조정; NMDS 샘플 사이 득점 랭킹의 유사성에 기초하여 데이터 요소의 2 또는 3 차원 위치 결정을 생성하는 비모수 다변량 기술이다.
도 1 주제 GC-FID 크로마토. 재배 갈색 Chernozemic 토양에서 얻은 샘플이 분석을 위해 사용 하였다. 체류 시간 및 대응 PLFAs (괄호) 및 피크 면적 (PA)을대표 피크의 그림에 표시된 다시. 이 특정 샘플 (33) 확인 PLFAs를 산출하지만 명확하게하기 위해, 모든 피크가, 그림에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PLFAs (총 PLFAs의 %)의 여섯 가지 종류의 그림 2. 상대 풍부, 총 PLFA의 바이오 매스 (nmol의 g -1 ) 건조 토양의. 샘플 숲 Luvisolic 토양에서이 분석에 사용 하였다. 결과는-중간 세 (이십오년) 다음에 오래된 나무 (> 오십년) 아래에있는 사이트 1에서 토양에 대한 더 큰 총 PLFAs, 나무 (사이트 2)를 표시하고 마지막으로 막내 (10 년) 나무 ( 사이트 3). 상대적으로 포화 PLFAs는 막내에 존재하는사이트, 불포화 PLFAs 가장 오래된 사이트에 존재하는 동안. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PLFAs 그림 3. 비 메트릭 다차원 스케일링 (NMDS) 조정 축 (2) 및 3 차원 용액 3 (총 PLFAs 데이터 % 사용).이 조정은도 2에 대해 사용되는 것과 동일한 데이터를 사용하여 계산 하였다. 막내 사이트 (사이트 3) (사이트 2, 3) 매우 명확하게 이전이 사이트에서 분리, 자신의 PLFA 미생물 군집 구성에 중복을 표시한다. 괄호에 포함 된 각 축에 의해 설명 된 PLFA 커뮤니티 데이터의 변화의 양; 변동의 72.5 %는 3 DIMEN 이러한 두 축으로 설명한다적인 NMDS 솔루션입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
토양 미생물 커뮤니티에서 발견되는 일부 PLFAs는 또한 식물 뿌리, 조류, 토양 동물과 같은 단일 및 다세포 진핵 생물에 존재하기 때문에 최소화하고 PLFA 데이터의 잘못된 해석을 방지하기 위해주의 데이터 검사가 수행해야합니다. 또한, 고세균은 PLFAs를 포함하지 않는; 대신, 고세균 막을 인지질 알콕시 글리세롤 (PLELs)로 구성된다. 따라서, PLFA 프로토콜 토양 고세균 커뮤니티의 특징을 사용할 수 없다.
특정 미생물 그룹에 개별 PLFAs를 연결하는 것은 신중하게 행사해야합니다 (PLFA 방법의 한계 중 일부의 훌륭한 토론 Frostegård 및 동료 (34)에 의해 2011 년 출판물을 참조하십시오). 중간 차이와, 그 화학 구조에 기초한 그룹 PLFAs에,도 2에 예를 들면, ⅰ) 직쇄 포화 PLFAs, ⅱ) 포화 PLFAs을 수행되었을 대신 더 적절할 수있다N (10 메틸) 분지, ⅲ) 말단 분지 포화 지방산, ⅳ) 불포화 PLFAs, V) 불포화 PLFAs 및 VI)의 히드 록시 지방산.
샘플 중량은 주어진 토양 시료에 함유 추출 PLFAs의 양에 기초하여 조절 될 필요가있다. 이하 미생물 활성 토양에서 추출 된 토양의 양을 조정하지 않음으로써, 사용자가 정확하게 전체 미생물 군집을 나타내는 PLFA 반응 (피크)의 충분한 수를 얻기없는 위험이있다. PLFAs의 높은 농도가 높은 미생물 활성 토양에서 사용자는 이에 PLFAs의 정확한 정량을 방지 GC 열 과부하의 위험이 있습니다. 두 경우 모두에서 토양 시료 PLFAs 재 해석되어야한다. 좋은 출발점 (예 : 숲 바닥 등) 유기 토양 시료 0.5 g, 미네랄 토양 시료 3 g을 추가하는 것입니다. 추출 PLFAs의 금액은 일반적으로 토양 샘플 우리 함유 유기 탄소의 양에 상관되기 때문에ight 토양 탄소 함량을 기준으로 조절 될 수 있으며, 탄소 함량이 0.5 ≤ 경우> 5g 필요할 수 있지만 예를 들면, 미네랄 토양 시료 1g을 취하여, 탄소 함량이 10-15 % 일 때 양호한 PLFA 정량을 얻기에 충분할 수있다 %. 항상 전체 세트가 실행되기 전에 샘플 무게를 최적화하기 위해 몇 가지 샘플로 시험 실행을 수행하는 것이 좋습니다.
다음과 같이 PLFA 프로토콜 및 GC 분석을위한 일반적인 문제 해결 전략이다. GC의 크로마토 그램의 기준선이 너무 높으면, H 2 가스 실린더가 변경되어야한다. 용매 또는 ISTD 피크 크로마토 그램에서 누락 된 경우, 시료 주입에 문제가있을 수 있습니다 (예를 들어, 주사기, 자동 시료 주입기에 문제가 비어 있거나 누락 된 유리 병, 유리 병 위치와 오류를 연결). 세 개 이상의 피크 방법 / 빈 샘플에서 검출하는 경우, 블랭크가 오염과 같은 오염 물질 (들)이 샘플 GC C가 존재할 수 있다는 가능성이 높다hromatograms. 오염원 (일반적으로 수성 매질)을 찾거나 적어도, 오염물에 대응하는 피크는 샘플 크로마토 그램에서 이러한 피크는 PLFA 데이터의 통계적 분석에 포함되지 않도록 제거되도록. 또한, 이월이 의심되는 경우 헥산 샘플 사이에 린스를 실행하는 것이 좋습니다. 헥산 린스의 추가 피크는 이월 (이전 실행에서 용출 즉, 무거운 부품)을 나타냅니다.
지질의 산화에 특히 민감하며, 특히 치료는 암에 저장하고 질소하에 그들을 유지하는 등 공기와 노광로부터 시료를 보호하기 위해 프로토콜에 걸쳐 발휘되어야한다. 0 대리 표준 : 모든 샘플 및 공백은 충분한 C19이 있어야합니다. 누락 된 C19 : 0 피크, 하나의 샘플 또는 공백에는 가난한 복구 또는 분석의 전체 손실을 나타냅니다. 제 m보다 상당히 낮은 샘플에서 0 : C19의 응답ethod / 샘플 공백은 PLFA 방법에 어떤 점에서 분석의 손실을 나타냅니다. 불량한 C19에 직면했을 때 0 복구 절차의 모든 측면에는 격리하기 위해 초기 추출 시료 전송의 모든 단계, SPE 추출 지방산 메틸화, 건조, 저장 및 샘플 조작 포함 신중하게 고려되어야 할 및 검사 단계 또는 분석이 손실 단계. 대리 표준의 경우 복구를 과대 평가 될 수있는 0 : 한편, 일부 토양 시료의 추출은 C19을 수득 수 일 수있다. 0/19 : ((PC (19이 표준을 사용하는 동안 0)과 MeC10 : 0) 절대 요구, 우리는 문제를 해결하기 위해 필요로 할 때 매우 유용하다는 것을이 발견되지 않은만큼 MeC10과 같습니다. 0 응답이 적절하다 문제 해결은 GC 분석 이전 단계에 초점을 맞출 수 있습니다.
이전에 언급 한 바와 같이,주의는 전적으로 바이오 마커가 유도에 따라 생태 학적 중요성과 생태계의 관계를 해석 할 때 사용합니다PLFA 데이터로부터 D, 순수 문화 연구 고립 된 박테리아 균주는 PLFAs의 다른 종류를 포함하는 것을 공개하기 때문이다. 광범위한 생태 학적 추론을 할 때 대신, 바이오 마커 PLFAs 증거의 스위트 룸에 유용한 추가로 볼 수 있습니다. 문헌 개별 PLFAs 제안 된 다른 미생물 그룹에 대한 바이오 마커로 이용했다. 포화 PLFAs는 일반적 그람 양성균을 나타내는 데 사용되는 그람 음성균에 사용 PLFA을 불포화된다. 1ω7, C18 : 1ω7 및 C18 : 그람 음성균에 대한 인식 바이오 마커는 C16과 ω5 또는 ω7 위치에서 불포화과 지방산을 불포화 포함 1ω5합니다. 또한, 시클로 지방산은 그람 음성균 (35)을 대표 할 수있다. 1ω5 + A : 1ω7 + A : 0cyclo 따라서, 그람 음성균으로는 PLFAs의 합으로 계산 될 수있다. 그람 양성 세균에 대한 인식 바이오 마커는 말기 사 분지된다turated 지방산, 이소 지형 C15 등 : 0I, C16 : 0I, C17 : 0I; 0A 및 C17 : 0A 또는 C15로, 안테 이소는 분지. 포화 중간 체인 (10 메틸) 분기와 PLFAs 같은 10Me16 : 0 10Me18 : 0 방선균 (36)에서 특징적으로 존재한다. 따라서, 그램 양성 세균으로부터 PLFAs는의 합과 동일한 것으로 계산 될 수있다 : 0 (ISO, 안테 이소 10 - 메틸).
곰팡이 PLFA과 관련된 많은 바이오 마커들은 고도 불포화되어 있지만, 일부 곰팡이 바이오 마커는 단일 불포화된다. 예를 들어, 곰팡이 단일 불포화 바이오 마커의 관점에서, C16 : 1ω5가 arbuscular 균근 곰팡이의 지표 (AMF) (37), C18로 확인되었습니다 1ω9는 잡균 곰팡이에서 일반적이고, ectomycorrhizae는 일반적으로 C16를 포함 : 1ω9합니다. 디 - 불포화 C18의 존재 : ectomycorr 2ω6,9 적절하게 나타낼 수 2ω6,9 자주 C18와 함께 발생합니다 1ω9 또한 C18이 있음을 나타냅니다 곰팡이 스테롤 에르고 스테롤, 잘 상관 관계hizae 및 잡균 곰팡이 38. 트라이 - 불포화 C18 : 3ω 6,9,12은 곰팡이 (10)에 대한 바이오 마커로 사용되었다; 그러나, C18 : 그것은 일반적으로 박테리아에서 발견되지 않는다 3ω6c는 식물 및 조류를 포함하는 다른 진핵 생물에서 찾을 수있다. 토양 원생 생물의 용어에서, C20 : 다른 작업이 C20를 검출하는 데 실패,하지만 4ω6c는 원생 생물의 바이오 마커 (39)로 인식되었습니다 가능한 원생 생물 집단이 광학 현미경 (40)를 사용하여 시각적으로 확인되었다에도 4ω6c.
많은 연구는 PLFA 데이터 분석 도구로 다변량 조정 기술을 이용하여 전체 토양 미생물 커뮤니티 관련 생태 질문 다룬다. 이 방법을 사용할 때, 몇몇 저자가 시료 (4)의 5 % 미만으로 존재 PLFAs를 제거하여 데이터 세트에서 희귀 PLFAs 제외하도록 선택했습니다. 일반 포화 C16 : 0, C18 : 0 원핵 생물과 EUK을 포함한 모든 토양 미생물에 풍부aryotes. 따라서, 일부 연구자들은 이전에 그들이 토양 미생물 커뮤니티의 구성의 민감한 지표하지 않을 수 기준으로 통계 분석이 PLFAs을 제거 할 수 - 비록 C16 : 0, C18 : 0의 모든 PLFAs를 합산 할 때 포함되어야 여전히 미생물 바이오 매스의 인덱스입니다. 이 기술은 일반적으로 33을 배포 할 수 없습니다 데이터에 적합으로 통계 분석의 용어, 많은 연구자들은 비 통계 다차원 스케일링 (NMDS) 조정을 수행하기 위해 선택합니다. 범주 형 변수와 관련된 자세한 분석은 범주 그룹에 할당 된 미생물 지역 사회 사이의 유사성이나 차이점을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다 범주 그룹 및 다중 응답 순열 절차 (MRPP)에 특정 PLFAs의 발생을 관련시킬 수 지표 종 분석을 포함 할 수있다. 또한, 다 변수 회귀 나무 (MRT)이 특히 유용 할 수있을 때 여러 실험 변수의 영향 또는치료 가능한 설명 변수 (5)로 평가 될 필요 (예를 들면, 토양 질감, 습도, 교정 나이).
확립되면 PLFA 프로토콜 환경 변화 인위적 교란 토양 미생물 반응을 정량 할 때 매우 유용 할 수있는 비교적 간단한 분석 방법이다. 이러한 유전자 지문 분자 기법 미생물 군집의 상세한 특성에 더 적합하지만, PLFA 방법은 총 미생물 바이오 매스 (34)에 정량의 정보를 제공하는 장점을 제공한다. 우리의 연구 실험실에서 한 사람이 편안하게 사일에 걸쳐 20 샘플 세트를 처리 할 수 있습니다, 우리는 토양의 생물학적 품질을 평가하는 강력하고 재현 기술이 될 여기에 제시된 프로토콜을 발견했다.
PLFA 방법의 힘은 매우 안정 동위 원소 분석 41 (42)에 연결함으로써 확장 될 수있다. 특히, 부가 O를F 토양에 13 C 표지 기판 토양 미생물에 기판 통합의 정량화를 허용 개별 PLFAs (41)의 동위 원소 분석하지만. 또한,이 방법은 토양 먹이 사슬 42 영양 링크를 규명하는 도구 매우 유망한 것으로 보인다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
