Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Published: August 26, 2016 doi: 10.3791/54360
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 5
1Department of Renewable Resources, University of Alberta, 2Department of Science, Augustana Faculty, University of Alberta, 3Laboratoire Génie Civil et géo-Environnement, Université de Lille, 4Department of Earth and Environmental Sciences, Mount Royal University, 5Forest Ecology & Production, Great Lakes Forestry Centre, Natural Resources Canada

Summary

חומצות שומן פוספוליפידים לספק מידע על המבנה של קהילות חיידקי אדמה. אנו מציגים שיטות חילוץ מתוך דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה של שומני חילוץ באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק, methanolysis לייצר אסטרים מתיל חומצות שומן, אשר מנותחים על ידי גז כרומטוגרפיה נימים.

Abstract

חומצות שומן פוספוליפידים (PLFAs) הם רכיבי מפתח של קרום התא של חיידקים. ניתוח PLFAs מופק קרקעות יכול לספק מידע על המבנה הכללי של קהילות מיקרוביאלי יבשתיות. פרופיל PLFA כבר נעשה שימוש נרחב במגוון של מערכות אקולוגיות כמדד ביולוגי של איכות קרקע הכולל, כאינדיקטור כמוני תגובת אדמה לנחות וניהול ולחצים סביבתיים אחרים.

הגישה הסטנדרטית המוצג כאן מתארת ​​ארבעה שלבים עיקריים: 1. מיצוי שומנים מן דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה 2. באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק לבודד פוספוליפידים מן שומני חילוץ אחרים, 3. methanolysis של פוספוליפידים לייצר חומצת שומן אסטרים מתיל (fames), ו -4 ניתוח FAME ידי גז כרומטוגרפיה נימים באמצעות גלאי יינון להבה (GC-FID). שני התקנים משמשים, כולל 1,2-dinonadecanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) כדי להעריך את ההתאוששות הכוללת של שיטת חילוץ, decanoate מתיל (MeC10: 0) כסטנדרט פנימי (ISTD) לניתוח GC.

Introduction

חומצות שומן פוספוליפידים (PLFAs) הם חלק של קרום התא של חיידקים מן חיידקים תחומים Eukarya. מיקרואורגניזמים לייצר PLFAs באורכי שרשרת שונים ורכב כאמצעי לשמור על שלמות תא קרום ותפקוד הסלולר בתגובה לתנאי הסביבה המיידית שלהם; ומכאן ניתן לטעון כי קהילות מיקרוביאלי כי הם מופרדים גיאוגרפית אלא כפופים לתנאי הקרקע דומה יביע PLFAs דומה. PLFAs קרקע עם אורך שרשרת בין 14 ו -20 אטומי C נחשב בדרך כלל להיות ממוצא חיידקים ופטריות בעיקר 1. בתרבויות מעורבות, ניתוח PLFA לא יכול לשמש לזיהוי מינים של חיידקים בודדים, אבל זה יכול לספק טביעת אצבע כוללת של קהילות חיידקים נמצאות באדמה. בנוסף, מאז PLFAs מפורק במהירות על מוות של תאים, הם יכולים להיחשב נציג של קהילת החיידקים בקרקע קיימא 2. tec זהhnique כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין את ההרכב המבני של קהילות חיידקים למצוא מגוון רחב של סביבות, החלו יערות 3-4 כדי Prairies 5-6 ושדות חקלאיים 7. זה כבר מיושם בהצלחה באפיון בתגובה אדמה לנחות שינויים בהנהלה, כולל יער ברור חיתוך 8 לסיד 9, טיוב 10-12, כמו גם הפרעות כגון אש 13, זיהום על ידי מתכות 14 ופחמימנים 15, ו -16 פרוץ חרקים .

שיטת האנליטית העכשווית PLFA התפתחה במהלך ששת העשורים האחרונים דרך התקדמות מרכזית על ידי מספר קבוצות מחקר. בשנת 1958, שיפור משמעותי נבע התאמת כלורופורם: מתנול: יחס מים בתמיסת החילוץ להעביר את התערובת מן monophasic למערכת diphasic 17. מיצוי השומנים אופטימיזציה זה ואת פרו בידוד המתוקןtocol נודע כשיטת בליי דייר. פרוטוקול אומצה על ידי מעבדות רבות בעשורים הקרובים, במהלך הזמן הזה, הלבן ועמיתיו תרמו שיפורים משמעותיים לשיטה; למשל, הם שיפרו את הצעד החילוץ על ידי החלפת חיץ פוספט למים, והם אופטימיזציה הניתוח על ידי גז כרומטוגרפיה (GC) באמצעות הזדהות השיא משופרת וכימות. אולי רלוונטי יותר מדעי קרקע, הם קבעו ב -1979 כי שומני החילוץ יכולים לשמש כמדד מבנה מיקרוביאלי כאשר הם בחנו את ביומסה מיקרוביאלית של משקעים ימיים 18.

התפתחויות נוספות שחלו בשנת 1980 כשיטה הפכה מנוצלת באופן נרחב יותר מדעי קרקע, במיוחד ביחס rhizosphere 19. באותו זמן, השיטה כללה מהתיל nonadecanoate (MeC19: 0) כסטנדרט פנימי 19 ושימוש טור חומצת silicic עבור חלוקת שומנים 21 </ Sup>. בעקבות עבודתו עם לבן 19,21, Tunlid חזר לשבדיה והחל מחקר משותף עם הבעת ו Frostegård. בחינת היעילות של מאגרי מיצוי שונים עבור חבילה של קרקעות הנבדלים בתכולת חומר אורגנית, הקבוצה הראתה כי חיץ ציטראט הגדיל את כמות הפוספט שומני חילוץ בהשוואה למאגר פוספט 22. יתר על כן, פרסומן 1993 23 על ההשפעה לסייד על קהילות חיידקי אדמה המשיך להיות קלסי ציטוט בביולוגית קרקע & ביוכימיה 24. החוקרים ניצלו ניתוח מרכיבים ראשיים בעיבוד הנתונים שלהם. ניתוח PLFA, כשיטה נקראת עכשיו, מייצר ערכות נתונים גדולות ושימוש נהלים סטטיסטיים רב משתנים לעבד נתונים אלה היה מאוד חדשני בפעם ומעוררת השראה לרבים. בד בבד עם העבודה הנעשית בשוודיה, שינויים בהליך PLFA נחקרים בגרמניה על ידי Zelles ועמיתיו 25-26. גרסתם של ההליך בלטה לשימושו של טור מיצוי מוצק שלב (SPE) במקום בעמודת silicic החומצה אבל, באופן כללי, הייתה יותר במעבדה אינטנסיבית.

23 הנייר של Frostegård, יחד עם מתודולוגיה מפורטת על ידי White & Ringelberg 27, היווה את בסיס פיצוץ השימוש בטכניקת PLFA לחקור שאלות יסוד במדע קרקע. מאז, ליטושים נוספים של שיטת פיירסטון ועמיתיו כללו הוספת תקן GC פנימי (C10: 0) ו C19: 0 כסטנדרט פונדקאי כדי לשפר כימות 28, ו החלפת השימוש separatory משפכים עבור צלוחיות תחתיות עגולות לפשט מיצוי 29. לאחרונה, Chowdhury ודיק 30 נחקר הצעד מתילציה דיווח כי שני ההליכים מתילציה בשימוש בספרות מדעי האדמה את הזיהוי בשיטה KOH / MeOHified מגוון של חומצות שומן גדול.

השיטה המוצגת מבוססת במידה רבה על השיטה המקורית שפותחה על ידי בליי דאייר, ומשלבת את השינויים שהוזכרו לעיל, כגון השימוש של KOH methanolic עבור שלב מתילציה. שני התקנים משמשים עבור כל דגימה: סטנדרט פונדקאי של 1,2-dinonadecanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)), אשר מתווסף דגימת הקרקע לפני החילוץ הראשון כדי להעריך את היעילות ואת ההתאוששות של הפרוטוקול כולו, ועל תקן מכשיר של decanoate מתיל (MeC10: 0), אשר מתווסף לפני זיהוי וכימות ידי GC.

אנו מכירים כי שיטת PLFA היא נפוצה על ידי מעבדות אקולוגיה מיקרוביאלית רבות ברחבי עולם, הועדה פעמים רבות, לרבות על ידי ארגון התקינה הבינלאומי 2. מטרת מאמר זה היא להציג פרוטוקול קל לעקוב ויציב שיכול להיות שימושי קרקעמדענים שמנסים ללמוד את טכניקת PLFA.

Protocol

הערה: ודא תמיד בציוד מגן אישי המתאים (PPE) שחוקה לאורך כל הפרוטוקול. כלי זכוכית אסור לגעת בידיים חשופות. ליפידים מאצבעות, שיער, גריז, שמנים ופחמימנים כולם המזהמים הפוטנציאלי. תמיד ללבוש כפפות ניטריל וכפפות שטיפה עם 70% אלכוהול במהלך הטיפול בו כלי זכוכית נקיות.

1. הכנת זכוכית עבור ניתוח

  1. כלי זכוכית פנויות (למשל, צינורות צנטריפוגה)
    1. עוטפים בנייר כסף וחום אלומיניום תנורי מופל במשך ארבע וחצי שעות ב -450 ºC.
  2. Polytetrafluoroethylene (PTFE) -lined כמוסות
    1. משרים כמוסים במשך שעה אחת דטרגנט פוספט, ולאחר מכן לשטוף עם מברשת לקרצף במים חמים וחומרי ניקוי פוספט. לשטוף סבון עם מי ברז.
    2. מקום באמבט חומצה (5% HCl) במשך שעה אחת בלבד (לא להשאיר יותר כמו הספינות עשויות הנפולת של הכמוסות אם הם טבולים במשך זמן רב מדי. יש לשטוף שלוש פעמיםבמי ברז. לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים. יבש בתנור ב 40 ºC.
  3. כלי זכוכית לשימוש חוזר (למשל, 10 מ"ל, 15 מ"ל, 45 מ"ל בקבוקונים / צנצנות)
    1. לשטוף עם המברשת לקרצף במים חמים וחומרי ניקוי פוספט. לשטוף סבון עם מי ברז ומניחים באמבט חומצה (5% HCl) לילה. לשטוף שלוש פעמים במי ברז, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן יבש בתנור ב 40 ºC.
    2. עוטף בנייר אלומיניום נקי (50 מ"ל צנצנות הם עטופים בנפרד וכלי זכוכית אחרת עטופה קבוצות מדגמות, למשל, 20) וחום תנורי מופל במשך ארבע וחצי שעות ב -450 ºC.
  4. כלי זכוכית נפח (למשל, בקבוק מדידה)
    1. לשטוף עם המברשת לקרצף במים חמים וחומרי ניקוי פוספט. לשטוף סבון עם מי ברז ומניחים באמבט חומצה (5% HCl) לילה. לשטוף שלוש פעמים במים ברז, לשטוף שלוש פעמים במים מזוקקים, ולאחר מכן יבש בתנור ב 40 &# 186; ג.
    2. לפני השימוש יש לשטוף 3 פעמים עם כמות קטנה של ממס (למשל, מתנול) - אין לשים זכוכית נפח בכבשן המופל.

איסוף ועיבוד 2. של דגימות קרקע לפני ניתוח PLFA

  1. לאסוף דגימות קרקע לשקיות סטרילי, ואם אלה ניתן לנתח מיד, להקפיא אותם בהקדם האפשרי. חנות דגימות במקפיא (-80 ºC) עד מוכן להמשיך עם ייבוש בהקפאה של דגימות. להקפיא קבוצות יבשות של דגימות בהתאם להוראות של מייבש ההקפאה.
  2. העברת כל מדגם מיובש בהקפאה שקית סטרילית חדש שכותרתו. תשקול מדגם מחומר מיובש בהקפאה בתיק לתוך צינור צנטריפוגות עמום מראש שכותרתו להפקת PLFA.
    הערה: הנחיה כללית היא להשתמש 0.5 גרם לחומרים אורגניים (תוכן פחמן> 17% wt) ועד 3.0 גרם במשך דגימות קרקע מינרליים. שיא משקל מדגם עבור כל דגימה.
  3. עבור כל 10 דגימות, גם לשקול החוצהכפול נוסף לניתוח, ובמשך 20 דגימות בכל כוללים ריק (כלומר, צינור צנטריפוגות כי אין שום מדגם זה - לשמש כביקורת לזהות כל אפשרות של זיהום במהלך תהליך החילוץ PLFA). אצוות תהליך של דוגמיות בעת ובעונה אחת.
    הערה: סט של 20 דגימות יתאים אצווה של 23 דוגמיות (דוגמאות 1 עד 10, אחד כפולות של מדגם 10, דגימות 12 עד 22, כפולים אחד מדגם 22, ו ריק = צרור אחד של 23 דוגמיות).
    הערה: ניהול חילוץ ולאחר מכן הפרדה, אז מתילציה בקבוצות של דגימות לפני והכנת לניתוח GC וריצה את כולם יחד. זה עוזר לזהות היכן טעויות קורות אם משהו ישתבש, ועשוי לסייע להפחית את מספרם של עקירות חוזרות צורך.

3. טכניקת PLFA (צעדים הם למדגם פרט אלא צרור אחד שלם מלא בכל פעם)

הערה: כל השלבים של טכניקת PLFA כמתואר בשלבים1-3 מתחת צריך להתנהל במנדף באמצעות PPE המתאים ובעקבות הנחיות בטיחות במעבדה.

  1. חילוץ (שלב 1):
    1. כן 5.0 M KOH ידי המסת 14 גרם של KOH ב 50 מ"ל מזוקקים, מים ללא יונים (DH 2 O).
    2. הכן 0.15 M ציטראט חיץ ידי המסת 31.52 גרם מונוהידראט חומצת לימון ב 400 מ"ל של DH 2 O. התאם ל- pH 4.00 ± 0.02 על ידי הוספת 5.0 M KOH; כ 45-50 מ"ל של 5.0 M KOH יידרשו להתאים את ה- pH ל 4.00. כאשר ה- pH מותאם, לדלל חיץ ציטראט 1,000 מ"ל באמצעות בקבוק מדידה. אחסן חיץ ציטראט במקרר כאשר אינו בשימוש (עד חודש).
    3. כן יומי המחשב (19: 0/19: 0) תקן פונדקאי nonadecanoate ידי דילול 250 μl של פתרון המניות (10 מ"ג / מיליליטר) ב 25 מיליליטר כלורופורם (זה מספק תקן פונדקאי מספיק לאפיית 23 דגימות). הוסף 0.5 מיליליטר של מחשב (19: 0/19: 0) פתרון סטנדרטי פונדקאי אל צינור צנטריפוגות מדגם.
    4. אdd extractant בליי דייר אל דגימת קרקע לפי הסדר הבא: א) 2.0 מ"ל חיץ ציטראט, ii) 2.5 מ"ל כלורופורם, ו- III) 5.0 מ"ל מתנול. מדגם קאפ עם כובע PTFE מרופדת ו מערבולת למשך 30 שניות; למקום שייקר קצה מעל לקצה עבור 2 שעות.
    5. צנטריפוגה ב 226 XG במשך 15 דקות עם מכסה על. צייר supernatant את עם פיפטה פסטר ולהעביר בקבוקון זכוכית שכותרתו 45 מ"ל.
    6. הוספת בסיבוב השני של בליי דייר extractant מדגם זה, וחזרו על צעדים 4 ו -5 דלעיל. צייר supernatant את עם פיפטה פסטר ולהעביר את הבקבוקון באותו שכותרתו 45 מ"ל זכוכית.
    7. הוסף שכותרתו 45 מ"ל supernatant המכיל זכוכית בקבוקון: i) 5.0 מ"ל כלורופורם, ו- II) 5.0 מ"ל ציטראט חיץ. שווי עם זכוכית כובע מערבולת לבנה מצופה PTFE בקבוקון למשך 30 שניות. תן לזה לשבת לילה בטמפרטורת החדר בחושך (כדי למנוע חמצון).
    8. בזהירות לשאוב את השלב מהימי העליון של 45 מיליליטר הבקבוקון (אם אין ואקום זמין, צריכה להיות הורידה את פיפטה דרך aqueשלב מפוקפק מאוד בזהירות שלא לגבות כל פיפטה כאשר pipetting בשלב האורגני). בשלב אורגני נמוך פיפטה לתוך בקבוקון שכותרתו 15 מ"ל.
    9. מקום אצווה של 15 מ"ל בקבוקונים תחת N דחוס 2 (כדי למנוע חמצון) בטמפרטורת החדר. להתאדות כלורופורם נוסע לאט, קביעת זרימת N 2 לזעזע את פני הנוזל בבקבוקון אבל לא לטפס על הצדדים של הבקבוקון.
    10. בורג על דגימות PTFE מרופדת כובע ולאחסן במקפיא ב -20 ºC כשהם עטופים ברדיד אלומיניום (לעטוף בקבוצות ולא בנפרד) עד מוכן להמשיך עם שלב 2.
  2. חלוקה ליפידים (שלב 2)
    1. מניח בעל טור SPE עם ברזים על מכל הזכוכית. הוסף עמודות SPE חדשות (סיליקה, 500 מ"ג, 6 מיליליטר) לתוך ברזים. עמודות תווית לפי הצורך (מומלץ להימנע ערבוב עד דגימות).
    2. להתנות כל עמודה על ידי הוספת 5 מ"ל של אצטון לתת לה לנקז דרך, ולאחר מכן להוסיף שתי תוספות של 5 מ"ל כלורופורם (הנפח הכולל = 10 מ"ל). אפשר לשטוף כלורופורם השני לזרום החוצה עד ~ 1 מ"מ מעל frit ולאחר מכן לסגור את הברז.
    3. Re-לפזר מדגם (מאוחסן 15 מ"ל בקבוקון בסוף שלב 1) על ידי הוספת 0.5 מ"ל כלורופורם הבקבוקון מערבולת בעדינות. העברה מחדש מומס מדגם לעמודה SPE בעזרת פיפטה פסטר; וחזור על סך של 2 העברות (נפח העברת סך של 1 מ"ל כלורופורם לדגימה).
    4. נח מדגם שומנים ישירות למרכז הטור ולאפשר ממס לנקז לחלוטין לתוך טנק.
    5. Elute שומנים נייטרלי על ידי הוספת 5 מ"ל של כלורופורם כל עמודה. אפשר ממס לנקז לחלוטין לתוך הטנק.
    6. Elute glycolipids ידי הוספת 5 מ"ל של אצטון כל עמודה. אפשר ממס לנקז לחלוטין לתוך הטנק האוסף.
    7. הסר עמודה לעמוד מטנק ומסננים טנק עם מנגנון ואקום. כנס מתל עם צינורות צנטריפוגות נקיים שכותרתו לתוך הטנק. חלף עמודה לעמוד על טנק; טור שכותרתו הנ"ל צריך ליישר קו עם centr שכותרתוצינור ifuge להלן.
    8. Elute פוספוליפידים לתוך צינורות צנטריפוגות ידי הוספת 5 מ"ל של מתנול כל עמודה. חכו עמודות SPE להתייבש במנדף לפני להיפטר מהם. שברים פוספוליפידים למטה יבש בטמפרטורת החדר תחת N 2 דחוס.
    9. צינורות טהר עם N 2. בורג על דגימות PTFE מרופדת כובע ולאחסן במקפיא ב -20 ºC כשהם עטופים ברדיד אלומיניום (לעטוף בקבוצות ולא בנפרד) עד מוכן להמשיך לשלב 3.
  3. מתילציה ליפידים (שלב 3).
    1. הפעל באמבט מים חמים מוגדר 37 ºC. הכן חומצה אצטית 1M (אם לא כבר עשה) על ידי המסת 57.1 חומצה אצטית קרחונית מ"ל ב -1,000 מ"ל DH 2 O באמצעות בקבוק מדידה 1,000 מ"ל. פתרון זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר למשך עד שלושה חודשים. .
    2. כן תצווה של KOH methanolic. הכן 0.2 פתרון M KOH ידי המסת KOH 0.45 גרם ב 40 מ"ל מתנול. כיוון עוצמת של KOH מתנול פיגודל יצווה nticipated בשלב 3. הכינו את הפתרון הזה מדי יום; לא שומר לפרקי זמן ארוכים יותר.
    3. הסר דגימות (צינורות צנטריפוגות מאוחסן לאחר שלב 2) מהמקפיא ולאפשר דגימות להגיע לטמפרטורת החדר. הוסף 0.5 מ"ל כלורופורם 0.5 מ"ל מתנול מדגם זה, ואחריו 1.0 מ"ל methanolic KOH. צינורות שווים בחוזקה עם מכסה מצופה PTFE. מערבולת לערבב.
    4. מניח דגימות אטומות באמבט 37 ºC למשך 30 דקות. ודא כי מפלס המים הוא מינימום של 1-2 מ"מ מעל מפלס הנוזל המדגם. הסר ולאפשר דגימות להתקרר. בעוד דגימות הם באמבט מים, תווית צלוחיות זכוכית קטנות עם מזהים לדוגמה (בקבוקון זכוכית 10 מ"ל עם מכסה PTFE מרופדת).
    5. להוסיף 2.0 מ"ל הקסאן לטעום כל מערבולת. לאחר מכן מוסיפים 0.2 מ"ל של 1.0 M חומצה אצטית לטעום כל מערבולת לערבב שוב; הפרדת פאזות צריכה להיות גלויה.
    6. להוסיף 2.0 מ"ל של DH 2 O מדגם לשבור שלב. דגימות וורטקס למשך 30 שניות. ואז דגימות צנטריפוגות ב 226 XG למשך 2 דקות.
    7. שימושפיפטה קצר פסטר, ולהעביר את השלב העליון לנקות שכותרתו 10 מ"ל בקבוקונים. היזהר שלא להעביר כל השלב התחתון (המימי).
    8. להוסיף 2.0 מ"ל הקסאן על צינור אחד מדגם צנטריפוגות מערבולת. דגימות וורטקס למשך 30 שניות. ואז דגימות צנטריפוגות ב 226 XG למשך 2 דקות.
    9. באמצעות פיפטה פסטר קצר, שוב להוסיף בשלב העליון כדי בקבוקון 10 מ"ל זכוכית שכותרתו.
    10. להתאדות ממס שכותרתו 10 מ"ל זכוכית בקבוקון בטמפרטורת החדר תחת N 2. בורג על דגימות PTFE מרופדת כובע ולאחסן במקפיא ב -20 ºC כשהם עטופים ברדיד אלומיניום (לעטוף בקבוצות ולא בנפרד) עד מוכן להמשיך עם ניתוח GC. הקפד לתייג את כל הדגימות.
  4. כרומטוגרפיה גזית (GC) ניתוח
    הערה: זיהוי וכימות של PLFAs הפרט מושגת באמצעות GC מחובר או א FID או גלאי MS. בעוד ההוראות הבאות הן עבור GC-FID, הכנת המדגם יהיה תקף GC-MS כמו Well. דוגמא הגדרה עבור מערכת GC-FID תכלול 25 מ '× 0.2 מ"מ × 0.33 מיקרומטר (5% -phenyl) טור -methylpolysiloxane עם פרוטוקול הטמפרטורה הבאה: טמפרטורה ראשונית 190 ºC, כבש 10 ºC / min 285 ºC , להחזיק 9.5 דקות, כבש 60 ºC / min 310 ºC, להחזיק 0.42 דק '31.
    1. הכן את התקן הפנימי GC (ISTD) על ידי הוספת טיפה אחת של MeC10: 0 (decanoate מתיל) ל -100 מיליליטר הקסאן (שיא הוסיף משקל 0.1 מ"ג). הפעל גזי GC ולאחר מכן להפעיל את GC. ודא כי H 2, N 2 וגלילי אוויר פתוחים וכי יש גז מספיק כדי להפעיל את הניתוח (H 2 לא צריך לקבל מתחת ל -500 psi).
    2. בדוק כי תנאים של כיול טוב מתקיימים על ידי הפעלת סטנדרטי כיול המכילים שילוב של חומצות שומן, ואחריו ריק הקסאן. ניתן זהות של חומצות שומן בודדות באופן ידני הקצאה מבוססת על השוואות עם פעמי שמירה המתקבל עבור תקנים, או זה יכול להיות automatically שהוקצה באמצעות תוכנות זמינות מסחרי 31. בכל המקרים, זיהוי חד-משמעי יכול להיות מושג באמצעות גלאי MS 2.
      הערה: שלטים נוספים של כיול טוב כוללות בסיס דירה ובלי זיהום השטיפה הקסאן.
    3. ממיסים כל שאריות מדגם PLFA (הכלול בקבוקון זכוכית 10 מ"ל משלב מתילציה השומנים 3) ב 150 μl של פתרון ISTD ולהעביר לתוך בקבוקון GC (לחילופין להשתמש 50 עד 75 μl אם התגובה מדגם צפוי להיות חלש, כגון מאוד קרקע חולית).
    4. הגדר את עוצמת זריקת מדגם 2 μl. הגדר את הטמפרטורה FID 300 ºC. הפעל את הדגימות באמצעות טמפרטורת כניסה של 250 ºC, עם H 2 כמו (קצב זרימת 1.3 mL / min) גז המוביל ביחס פיצול של 30: 1.

Representative Results

חומצות שומן מיועדות X: YωZ, כאשר X מייצג את המספר אטום פחמן, Y מייצג את מספר קשרים כפולים, ו- Z מציין את המיקום של הקשר הכפול הראשון מקצה אליפטיות (ω) של המולקולה. מהסיומות 'ג' ו 't' מצביעים CIS ו איזומרים גיאומטריים טרנס. תחיליות וסופיות 'a' ו- 'i' מתייחסים anteiso ו- ISO הסתעפות ו- Me ו- OH לציין קבוצות מתיל קבוצות הידרוקסיל, בהתאמה.

פוסט GC לרוץ, לבדוק כי דגימות קבלו נאותה ISTD מלהסתכל 10: שיא 0. כמו כן בודקים את התגובה של סטנדרטים GC, כלומר, בקבוקונים המכילים הקסאן עם הוסיף פתרון ISTD; אלה צריכות להיות לך שום פסגות אחרות. התגובה רגילה פנימית צריכה להיות דומה בכל הריצות.

איור 1 מציג representaבטווח מדגם מופרז. שיא ממס הקסאן הגדול מופיע אופייני בכל זמן שמירה (RT) כ -1.8 דקות. שיא תקן ISTD (C10: 0) מופיע בכל RT של 3.4 דקות, בעוד C19: 0 יש RT של 16.2 דקות. ניתוח GC מפריד בין PLFAs מבוסס על אורך השרשרת שלהם, עם שרשרות עוד משחררים לאט יותר; למשל, C18: 0 elutes ב 14.4 דקות תוך C16: 0 elutes ב -10.8 דק '. בנוסף, פרוטוקול אנליטי זה יכול להפריד PLFAs מבוסס על התואר שלהם של unsaturation ואת המיקום של הקשר הכפול שלהם; למשל, C18: 0 elutes ב 14.4 דקות, בעוד C18: 1 ג 9, ו C18: 1 7c elute ב 14.0 ו -14.1 דקות, בהתאמה (איור 1). לבסוף, PLFAs של אורך שרשרת דומה ורוויה אבל תצורת הסתעפות שונה (anteiso לעומת ISO) ניתן להפריד; למשל, C15: 0i ו C15: elute 0a ב 8.6 ו -8.7 דקות, בהתאמה (איור 1).

תחומי פסגות GC השונות יכולים להיות imמועבר לתוך גיליון אלקטרוני כדי לעבד את המידע הכרומתוגרמה גז נוסף. כל זיהתה PLFA היא לכמת (nmol g -1 של אדמה יבשה) באמצעות המשוואה הבאה:

משוואה 1

כאשר F הוא גרם התאמה שלוקח סלקטיביות חשבון FID והבדלי molarity בין חומצות שומן 32, areaPLFA הוא אזור השיא עבור כל זיהיתי PLFA, areaC10: 0 הוא אזור השיא עבור ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std נוסף הוא כמות ISTD (nmol) הוסיף מדגם לפני בטווח GC, היחס (C19: 0 סטיית הוסיף / C19: 0 מדגם) תואמת את ההתאוששות של המחשב (C19: 0 / C19: O) תקן פונדקאי, והמשקל המדגם הוא הכמות (ז) אדמה מיובשת בתנור מתווסף צינור צנטריפוגות מדגם המקורי ומשמש לחלץ PLFAs.

הערה: אזורים תחת differe NT פסגות מבוטאות באזורי שיא, תגובה או תגובה% בהתאם למערכת GC. בטווח הרלוונטי לאפיון קרקע PLFA, אזורים ניתן להניח להיות מידתי באופן ליניארי המשקלים של חומצות שומן; לחלופין, גורמי תיקון קטנים יכולים להיות מיושמים לתת דין וחשבון על סלקטיביות FID 32. בנוסף, בגלל תוצאות בתחילה באות לידי ביטוי על בסיס אחוזים במשקל, הם צריכים להיות מנורמלים להניב כמויות טוחנות. התאמה להבדלי molarity מושג על ידי לקיחה בחשבון משקל מולקולרי של חומצות שומן הבודדות; שולחנות פרסם 32 ו תוכנה מסחרית 31 זמינים גם כדי לעזור כאשר נרמול עבור molarity.

כמות ISTD (nmol) הוסיפה מדגם זה ניתן לחשב נוסף כמו:

C10: 0std הוסיף = [ISTD] × V (STD אינן במקור)

ithin-page = "1"> כאשר [ISTD] הוא ריכוז (nmol L -1) של MeC10: 0 (decanoate מתיל) מומס הקסאן (ראה שלב 3.4.1), ו- V (STD אינן במקור) הוא נפח (L) של פתרון מוכן ISTD הוסיף מדגם לפני בטווח GC (כלומר, 150 μl לפי שלב 3.4.4).

כמות C19: 0 (nmol) נוכח כל דגימה במהלך ניתוח GC מתאים ל:

משוואה 2

שם areaC19: 0 הוא אזור השיא עבור C19: O, בעוד הסכום המקביל של C19: 0 (nmol) הוסיף מדגם בתחילת שיטת החילוץ PLFA (השוו שלב 3.1.3) הוא:

משוואה 3

שם [19: 0] Std (מ"ג ל -1 (19: 0 סטייה אינה במקור) הוא הנפח לסטנדרטים פונדקאיים מוכנים להוסיף כל דגימה בתחילת חילוץ PLFA השיטה (ראה שלב 3.1.3), M 19: 0 הוא המשקל המולקולרי של 1,2-dinonadecanoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (PC (19: 0/19: 0)).

הערה: קישור אחד שומה של C19: 0 תשואות תקן פונדקאיות nonadecanoate שתי שומות של C19: 0 בעקבות צעד מתילציה, בעוד C10: תקן 0 מתווסף לאחר מתילציה.

PLFAs הבאים בדרך כלל אינם נכללים ניתוח של קהילות חיידקים אדמה: i) PLFAs כי הם <14 C ו> 20 C אורך, ו- II) PLFAs עם פחות מ -0.5% בסך הכל באזור השיא. לאחר PLFAs אלה הורחקו, התגובות מכל של PLFAs הנותרים אפשר לסכם להשיג הדו PLFA הכוללomass (ז nmol -1 של אדמה יבשה). וניתוח שונה של נתוני PLFA (למשל, ANOVA, בעקבות שינוי נתונים פי צורך לפגוש את ההנחות של הבדיקה מבוצעת) שניתן להשתמש בם כדי להשוות ביומסה PLFA הכוללת ו / או PLFA ביומסה של קבוצות נבחרות בין קבוצות / טיפולים מדגמים. לדוגמה, איור 2 מציג תוצאות עבור ההפצה היחסית של קבוצות PLFA שונים, כגון PLFAs רווי ישר ב"שרשרת, PLFAs רווי או שרשרת באמצע (10-מתיל) או הסתעפות קצה והענקת מונו או PLFAs רב בלתי רווי, כמו גם הסכום של PLFAs הכולל (ז nmol -1 של אדמה יבשה). בדוגמא זו בפרט, גיל העצים (אשר מקטין מאתר 1 עד אתר 3) נתפס להשפיע הן PLFAs הכוללת וחלוקה היחסית של קבוצות PLFA השונות.

כדי להעריך דפוסים הכוללים בהרכב PLFA בקרב מדגמים, בניתוח רב משתנה של כל PLFAs יכול להיות conducted 33. נתוני PLFA צריכים להפוך לפי צורך לפני הניתוח רב-משתנים שנבחר לפגוש את ההנחות של המבחן הסטטיסטי ואת שאלת המחקר שפונים, למשל, טרנספורמציה הלינגר משמשת לעתים קרובות כדי יחסית אליה את הנתונים. איור 3 מראה תוצאות מתוך הלא קנה המידה רב ממדית -metric (NMDS) הסמכתו של אותם נתונים ששימשו איור 2; NMDS היא טכניקה הלא פרמטרית, רבה-משתנה שמייצרת 2- או 3 ממדי מיקום של נקודות נתונים המבוססים על הדמיון של דירוג ציוני בין דגימות.

איור 1
באיור 1. נציג הכרומתוגרמה GC-FID. מדגם המתקבל אדמה מעובדת בראון Chernozemic שימש ניתוח זה. פעמים שימור PLFAs המקביל (בסוגריים) ואזור לשיאם (PA) אמחדש הצביע על הדמות עבור פסגות נציג. למען הסר ספק, לא כל הפסגות מסומנים על הדמות, אם כי מדגם מסוים זה הניב 33 PLFAs מזוהה. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
שפע יחסי איור 2. של שישה סוגים שונים של PLFAs (% מכלל PLFAs בסך הכל), ביומסה PLFA הכולל (nmol g -1 של אדמה יבשה). דוגמאות מקרקעות Luvisolic מיוערות שמשו לניתוח זה. התוצאות מצביעות PLFAs כוללים גדולים עבור הקרקע באתר 1, הנמצא תחת עצים מבוגרים (> 50 שנים), ואחריו ביניים בגיל (25 שנים) עצים (אתר 2), ולבסוף הצעיר (10 שנים) עצים ( אתר 3). יחסית יותר PLFAs רווי נוכחים הצעיריםאתר, בעוד יותר PLFAs הרווי נמצא באתר הבכור. ברי שגיאה מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ללא מטרי דרוג רב ממדית (NMDS) הסמכתו של PLFAs (באמצעות% של PLFAs הכולל נתונים) עבור צירים 2 ו -3 של פתרון 3-ממדי. סמיכה זו חושבה תוך שימוש באותם נתונים כמו אלה המשמשים איור 2. אתר צעיר (אתר 3) מפריד מאוד ברור בין שני האתרים המבוגרים (אתרים 2 ו -3), אשר מראות חפיפה בהרכב קהילת PLFA החיידקים שלהם. כמות התנודתיות במשתנים כלכלי קהילת PLFA המוסברת על ידי כל ציר כלול בסוגריים; 72.5% מהשונות מוסברים על ידי שני הצירים הללו למשך 3-דימןפתרון NMDS sional. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כדי למזער ולמנוע פרשנות שגויה של נתוני PLFA, הקרנת נתונים זהירה חייבת להיעשות, כי כמה PLFAs הנמצאים בקהילה אדמה החיידקים נמצא גם באורגניזמים איקריוטיים יחידים רבים-תאיים, כגון שורשי צמח, אצות, ובעלי חיים באדמה. בנוסף, קדומים אינם מכילים PLFAs; במקום, מורכבות ממברנות archaeal של שומנים אתר פוספוליפידים (PLELs). כתוצאה מכך, פרוטוקול PLFA לא יכול לשמש כדי לאפיין קהילות archaeal באדמה.

שיוך PLFAs פרט לקבוצות חיידקים ספציפיים יש להימנע ממתן בזהירות (ראה פרסום 2011 על ידי Frostegård ועמיתיו 34 עבור דיון מעולה של כמה מן המגבלות של שיטת PLFA). במקום זאת, הוא עשוי להיות מתאים יותר, כפי שנעשה באיור 2, לקבוצה PLFAs מבוסס על המבנה הכימי שלהם, למשל, אני) ישר ב"שרשרת PLFAs רווי, ii) PLFAs רווי אמצע צ'איn (10-מתיל) הסתעפות, iii) חומצות שומן רוויות קנים סופני, iv) בלתי רווי PLFAs, v) PLFAs רב בלתי רווי, ו- VI) חומצות שומן הידרוקסי.

משקל לדוגמא ייתכן שיהיה צורך מותאם על בסיס כמות PLFAs שניתן להפיק כלול דגימת אדמה נתונה. בכך שלא התאמת כמות קרקע חילוץ בקרקעות פעילות פחות microbially, משתמשים נמצאים בסיכון לא קבל מספר מספיק של תגובות PLFA (פסגות) לייצג את קהילת חיידקים באופן מדויק. בקרקעות מאוד microbially פעילים עם ריכוזים גבוהים של PLFAs, משתמשים נמצאים בסיכון של עומס יתר על עמודת GC, ובכך למנוע כימות מדויק של PLFAs. בשני המקרים, דגימות קרקע חייבות להיות מחדש נתחו עבור PLFAs. נקודת התחלה טובה היא להוסיף 0.5 גרם במשך דגימות קרקע אורגניות (כגון קומות יער), וכ -3 G עבור דגימות קרקע מינרליים. כיוון שכמות ה PLFAs שניתן להפיק בדרך כלל מתואמים עם כמות הפחמן האורגני הכלול אנו אדמה, מדגםight יכול להיות מותאם על בסיס תוכן הפחמן בקרקע; למשל, 1 גרם של דגימת קרקע מינרליים עשוי להיות מספיק כדי לקבל כימות טוב PLFA כאשר תוכן פחמן הוא 10-15%, בעוד> 5 גרם עשוי להיות נחוץ אם תוכן פחמן הוא ≤ 0.5 %. זה תמיד רעיון טוב לעשות משפט לרוץ עם כמה דוגמאות כדי לייעל משקל מדגם לפני הסט כולו מנוהל.

אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות עבור פרוטוקול PLFA וניתוח GC הן כדלקמן. אם בסיס הכרומתוגרמה GC הוא גבוה מדי, בלון גז H 2 צריך להיות שונה. אם הפסגות הממסות או ISTD נעדרות מן הכרומתוגרמה, ייתכן שיש בעיה עם הזרקה מדגמת (למשל, מחובר מזרק, בעיה עם autosampler, בקבוקון ריק או חסר, שגיאה עם מיצוב בקבוקון). אם יותר משלוש פסגות מזוהות את חסר שיטה / מדגם, יש זיהום של ריק, ויש סבירות גבוהה כי באותו חומר מזהם (ים) יהיה נוכח ג GC מדגםhromatograms. מצא מקור הזיהום (בדרך כלל תקשורת מימית), או לכל הפחות, להבטיח כי הפסגות המתאימות המזהם יוסרו מן chromatograms מדגם וכי הפסגות האלה אינן כלולים בכל ניתוח סטטיסטי של נתוני PLFA. כמו כן, זה רעיון טוב כדי להפעיל הקסאן בשטיפות בין דגימות כאשר לשאת על פי החשד. פסגות נוספות שטיפת הקסאן תציינה carry-over (כלומר, רכיבים כבדים משחררים מהפעלה קודמת).

ליפידים הם רגישים במיוחד לחמצון, וטיפול בפרט צריך להיות מופעל ברחבי הפרוטוקול כדי להגן דגימות מחשיפת האוויר ואור, כגון אחסונם בחושך ולשמור אותם תחת חנקן. כל הדגימות ואת החסר חייבות להיות C19 מספיק: 0 סטנדרטי פונדקאי. C19 חסר: 0 שיא, בין אם דגימות או חסר, מצביע על התאוששות עניה או אובדן מוחלט של analytes. תגובה של C19: 0 בדגימות כי הוא נמוך משמעותית מחסר ethod / מדגם מצביע על פסד של analytes בשלב כלשהו המתודולוגיה PLFA. כאשר הוא מתמודד עם C19 עניים: 0 התאוששות, כל ההיבטים של התהליך צריך להישקל בזהירות ובחן כולל החילוץ הראשוני, בכל שלבי העברת מדגם, מיצוי SPE, מתילציה חומצת שומן, ייבוש, אחסון ומניפולציה מדגם על מנת לבודד את שלב או שלבים שבהם analytes אובדים. מצד השני, ייתכן כי החילוץ של כמה דגימות קרקע עשוי להניב C19: 0, שבו התאוששות במקרה של ההתקן הפונדקאי ניתן להפריז. בעת השימוש שני התקנים ((PC (19: 0/19: 0) ו MeC10: 0) אינה דרישה מוחלטת, שמצאנו זה להיות מאוד שימושי כאשר הזקוקים לפתרון כל עוד MeC10:. 0 בתגובה היא נאותה פתרון בעיות, יכול להתמקד על המדרגות לפני ניתוח GC.

כפי שצוין קודם לכן, יש להיזהר בשימוש כאשר לפרש יחסי משמעות אקולוגיים אקולוגיים המבוסס אך ורק על ביומרקרים לגזורד מנתונים PLFA, מכיוון שמחקרי תרבות טהורים עולים כי זני חיידקים בודדים יכילו קטגוריות שונות של PLFAs. במקום זאת, PLFAs סמן הביולוגי יש להשקיף כעל תוספת שימושית בסוויטה של ​​ראיות כאשר הסקת מסקנות אקולוגיות רחבות. בספרות, PLFAs פרט הוצע מנוצל כסמנים ביולוגיים לקבוצות חיידקים שונות. PLFAs רווי בדרך כלל משמשים לייצוג חיידקים גראם-חיוביים בלתי רווי PLFA משמשים חיידקים גראם שליליים. ביומרקרים מוכר חיידקים גרם שליליים כוללות בלתי רווי חומצות שומן עם unsaturation בבית ω5 או העמדה ω7, כגון C16: 1ω7, C18: 1ω7, ו C18: 1ω5. בנוסף, חומצות שומן cyclopropyl יכולות להיות גם נציג של חיידקים גראם שלילי 35. לפיכך, PLFAs מחיידקים גראם שליליים ניתן לחשב את שווה לסכום של A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. ביומרקרים מוכר חיידקים חיוביים גרם הם מסועף סופני saחומצות שומן turated, קנים iso כגון C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; או anteiso קנים, כגון C15: 0a ו C17: 0a. רוויי PLFAs עם שרשרת באמצע (10-מתיל) הסתעפות, כגון 10Me16: 0 ו 10Me18: 0 נוכחים אופייניים ב actinomycetes 36. לפיכך, PLFAs מ חיידקים גראם חיוביים ניתן לחשב את שווה לסכום של A: 0 (ISO, ANTEISO, 10-מתיל).

סמנים ביולוגיים רבים הקשורים פטרייתי PLFA הם רבים בלתי רוויים לעתים קרובות, אבל כמה סמנים ביולוגי פטרייתיים בלתי רוויים. למשל, במונחים של סמנים ביולוגיים בלתי רווי פטרייתי, C16: 1ω5 זוהה כאינדיקטור של פטריות מיקוריזה arbuscular (AMF) 37, C18: 1ω9 נפוץ פטריות saprophytic, ו ectomycorrhizae בדרך כלל מכילים C16: 1ω9. הנוכחות של C18 בלתי רווי-די: 2ω6,9 מתרחשת לעתים קרובות בשילוב עם C18: 1ω9 וגם וקושר היטב עם ergosterol sterol פטרייתי, דבר שמצביע על כך C18: 2ω6,9 מספק יכול לייצג ectomycorrhizae ופטריות saprophytic 38. C18 תלת-בלתי רוויות: 3ω 6,9,12 שימש גם בתור סמן ביולוגי פטריות 10; עם זאת, C18: 3ω6c ניתן למצוא אורגניזמים איקריוטיים אחרים כולל צמחים ואצות, אם כי בדרך כלל לא נמצא חיידקים. בקדנציה של הפרוטיסטים אדמה, C20: 4ω6c הוכר ביומרקר לפרוטיסטים 39, אם כי, עבודה אחרת לא הצליחו לאתר C20: 4ω6c גם כאשר אוכלוסיות לפרוטיסטים קיימא אוששו באמצעות מיקרוסקופ אור ויזואלית 40.

מחקרים רבים להתייחס לשאלות אקולוגיות הקשורות קהילת חיידקי אדמה הכוללת ידי ניצול טכניקות סמיכות רב משתנה ככלי ניתוח נתוני PLFA. בעת השימוש בגישה זו, חלק מהחברים בחרו שלא לכלול PLFAs נדירה מן הנתונים על ידי הסרת PLFAs שנמצא בתוך פחות מ -5% מהדגימות 4. המרווה הרגילה C16: 0 ו C18: 0 נמצאת בשפע בכל מיקרואורגניזמים באדמה, כולל פרוקריוטים ו eukaryotes. לפיכך, כמה חוקרים לבחור להסיר PLFAs אלה לפני ניתוח סטטיסטי על הבסיס זה יכולים להיות שהם לא אינדיקטורים רגישים של רכב קהילת חיידקי אדמה - אם כי C16: 0 ו C18: 0 עדיין להיכלל כאשר סיכום כל PLFAs עבור אינדקס של ביומסה מיקרוביאלי. בקדנציה של ניתוחים סטטיסטיים, חוקרים רבים בוחרים לערוך שינוי גודל רב ממדי הלא מטרי (NMDS) סמיך כמו טכניקה זו היא גם מתאימה לנתונים אין להפיץ בדרך כלל 33. ניתוחים נוספים הקשורים משתנה קטגורים יכולים לכלול ניתוח מיני מחוון, אשר יכול להתייחס קרות PLFAs הספציפי קבוצות קטגורים ונהלי תמורת תגובה רבות (MRPP), אשר יכול לעזור לקבוע דמיון או שוני בין קהילות חיידקים שהוקצו לקבוצות קטגורים. בנוסף, עצי רגרסיה מרובים משתנים (MRT) יכולים להיות שימושיים במיוחד כאשר ההשפעה של משתנים ניסיוניים מרובים אוטיפולים צריכים להיבחן כמשתני פוטנציאל הסבר 5 (למשל, קרקע מרקם, לחות, גיל טיוב).

לאחר שהוקם, פרוטוקול PLFA הוא שיטה אנליטית יחסית פשוטה שיכול להיות מאוד שימושי כאשר לכימות בתגובת חיידקי אדמה לשינויים סביבתיים והפרעות אנתרופוגניים. בעוד בטכניקות מולקולריות כגון טביעת אצבע גנטית מתאימות יותר האפיון המפורט של קהילות מיקרוביאלי, שיטת PLFA מציגה את היתרון של מתן מידע כמוני על ביומסה חיידקים הכוללת 34. במעבדת המחקר שלנו, אדם אחד יכול לעבד סט בנוחות של 20 דגימות מ -4 ימים, מצאנו את הפרוטוקול המובא כאן כדי להיות טכניקה חזקה לשחזור להעריך את איכות קרקע ביולוגית.

כוחה של השיטה PLFA ניתן להרחיב באופן משמעותי על ידי צימוד זה ניתוח איזוטופ יציב 41, 42. באופן ספציפי, בנוסף of 13 מצעים שכותרתו C קרקעות מאפשרים כימות התאגדות מצע לתוך מיקרואורגניזמים באדמה אף ניתוח איזוטופי של PLFAs פרט 41. בנוסף, שיטה זו נראה כי כלי מבטיח מאוד להבהיר קישורים trophic ברשתות מזון אדמה 42.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports Used in Steps 1-3
Compressed Nitrogen Praxair Ni-T Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap Fisher Scientific 05-569-3 Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample)
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20D Used for Step 1 (2 per sample)
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-4 Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples)
Elastic band Grand & Toy 42199 1 per sample for freeze drying
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has
Freezer (-20 °C, -80 °C) Revco ULT2586-5-A36 Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis
Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column Agilent Technologies Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed)
Analytical column Agilent Technologies 19091B-105
Gas chromatograph insert Agilent Technologies 5183-4692 Used for GC analysis (1 per sample)
Gas chromatograph vial and lid Agilent Technologies 5188-6592 Used for GC analysis (1 per sample)
Hexanes Fisher Scientific H292-4 Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3))
Hot water bath -Isotemp 220 Fisher Scientific Used for Step 3 (1 per batch of samples)
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-2 Used for freeze drying samples
KOH, ACS grade Fisher Scientific P250-500 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3)
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes Barnstead/Thermolyne 3,625,485 Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity)
MeC10:0 methyl decanoate internal standard Sigma-Aldrich 299030-2.5G Used for GC analysis
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3))
MIDI Peak Identification Software MIDI, Inc., Newark, DE Used for interpreting GC analysis output
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System Lab Sphere Inc 1200-A Used as a Calibration mix for TSBA 40
Nitrile gloves Fisher Scientific 27-058-52 Used always when conducting PLFA lab work
pH Meter - Accumet XL200 Fisher Scientific Used for making citrate buffer
Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette Socorex 832.02 Used throughout Steps (1 per sample)
250 µl gastight syringe Hamilton  1725 Used for GC analysis (1 per sample)
silver shield gloves Sigma-Aldrich Z529575 For use when handling chloroform
solid phase extraction (SPE) column Agilent Technologies 5982-2265 Used for Step 2 (1 per sample)
SPE glass column holder with spigots  and vacuum apparatus attached Sigma-Aldrich Used for Step 2 (1 per batch of samples)
Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 Barnstead International  M37615 Used in Steps 1-3
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade Sigma-Aldrich 270733-4L Used throughout analysis
Whirl-Pak® bags Fisher Scientific 01-812-120 Used in sample collection - 2 bags required per sample collected

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
  2. ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
  3. Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
  4. McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
  5. Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
  6. McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
  7. Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
  8. Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
  9. Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
  10. Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
  11. Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
  12. Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
  13. Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
  14. Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
  15. Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
  16. Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
  17. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
  18. White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
  19. Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
  20. Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
  21. Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
  22. Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
  23. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
  24. Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
  25. Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
  26. Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
  27. White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
  28. Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
  29. Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
  30. Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
  31. Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
  32. Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
  33. McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
  34. Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
  35. Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
  36. Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
  37. Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
  38. Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
  39. Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
  40. Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
  41. Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
  42. Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).

Tags

במדעי הסביבה גיליון 114 מבנה קהילה מיקרוביאלית חומצות שומן פוספוליפידים PLFA חיידקים בקרקע ביולוגית אדמה אקולוגיה מיקרוביאלית שינוי שימוש בקרקע ניהול קרקעות
הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quideau, S. A., McIntosh, A. C. S.,… More

Quideau, S. A., McIntosh, A. C. S., Norris, C. E., Lloret, E., Swallow, M. J. B., Hannam, K. Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils. J. Vis. Exp. (114), e54360, doi:10.3791/54360 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter