Summary
Fosfolipid fettsyror ger information om strukturen av markmikrobiella samhällen. Vi presenterar metoder för extraktion från jordprover med en enfasig kloroformblandning, fraktionering av extraherade lipider med användning av fast fas extraktionskolonner och metanolys för att producera fettsyrametylestrar, som analyseras genom kapillär gaskromatografi.
Abstract
Fosfolipid fettsyror (PLFAs) är viktiga komponenter i mikrobiella cellmembran. Analysen av PLFAs utvinns ur marken kan ge information om den övergripande strukturen av markmikrobiella samhällen. PLFA profilering har i stor utsträckning använts i en rad olika ekosystem som en biologisk index av den totala markkvalitet, och som en kvantitativ indikator på mark svar på markförvaltning och andra miljöfaktorer.
Standardmetoden som presenteras här beskriver fyra viktiga steg: 1. lipidextraktion från jordprover med en enfas kloroform blandning, 2. fraktionering med användning fastfasextraktion kolumner för att isolera fosfolipider från andra extraherade lipider, 3. metanolys av fosfolipider för att producera fettsyra metylestrar (FAME), och 4. FAME-analys genom kapillär gaskromatografi med användning av en flamjonisationsdetektor (GC-FID). Två standarder används, inklusive 1,2-dinonadecanoyl--sn-glycero-3-fosfokolin (PC (19:0/19: 0)) för att bedöma den totala återvinningen av extraktionsmetod och metyl dekanoat (MeC10: 0) som en intern standard (ISTD) för GC-analys.
Introduction
Fosfolipid fettsyror (PLFAs) är en del av mikrobiella cellmembran från domänerna Bakterier och Eukarya. Mikroorganismer producerar PLFAs av olika kedjelängder och sammansättning som ett sätt att upprätthålla cellmembranintegritet och cellfunktion som svar på deras omedelbara miljöförhållanden; varför det kan hävdas att mikrobiella samhällen som är separerade geografiskt, men utsätts för liknande markförhållanden kommer att uttrycka liknande PLFAs. Jord PLFAs med en kedjelängd mellan 14 och 20 C-atomer är typiskt anses vara av övervägande bakterie- och svampursprung 1. I blandade kulturer, kan PLFA analys inte användas för att identifiera enskilda mikrobiella arter, men det kan ge en övergripande fingeravtryck av de mikrobiella samhällen som finns i jord. Eftersom PLFAs bryts snabbt ned på celldöd, de kan anses vara representativ för den livskraftiga jord mikrobiella samhället 2. denna technique har i stor utsträckning använts för att karakterisera den strukturella sammansättningen av mikrobiella samhällen som finns i ett brett spektrum av miljöer, som sträcker sig från skogar 3-4 till Prairies 5-6 och jordbruksfält 7. Det har framgångsrikt tillämpats i karakterisera jord svar att landa ledningsförändringar, inklusive skog kalavverkning 8, kalkning 9, återvinning 10-12, liksom störningar såsom brand 13, förorening av metaller 14 och kolväten 15, och insektsutbrott 16 .
Den moderna PLFA analysmetod utvecklats under de senaste sex åren genom flera viktiga framsteg genom ett antal forskargrupper. 1958, en betydande förbättring uppstod från justering av kloroform: metanol: vatten-förhållandet i extraktionslösningen att skifta blandningen från en monofasisk till en tvåfasig systemet 17. Detta optimerade lipidextraktion och den reviderade isolering proprotokoll blev känd som Bligh och Dyer metod. Protokollet antogs av många laboratorier under de kommande årtiondena och under denna tid, vit och kollegor bidrog betydande framsteg av metoden; till exempel, förbättrades de extraktionssteget genom utbyte av en fosfatbuffert för vatten, och de optimerade analysen med gaskromatografi (GC) genom ökad identifiering och kvantifiering topp. Kanske mer relevant för markvetenskap, bestäms de 1979 att de extraherade lipider skulle kunna användas som ett index på mikrobiell struktur när de undersökte den mikrobiella biomassan av marina sediment 18.
Ytterligare utvecklingar inträffade på 1980-talet som den metod som blev mer allmänt används i markvetenskap, särskilt i förhållande till rotområdet 19. Vid den tiden inkluderade metoden metyl nonadecanoate (MeC19: 0) som en intern standard 19 och användningen av en kiselsyrakolonn för lipid fraktione 21 </ Sup>. Efter hans arbete med vit 19,21, Tunlid återvände till Sverige och började forskningssamarbete med Bååth och Frostegård. Genom att undersöka effektiviteten hos olika utvinnings buffertar för en svit av jordar med varierande halt av organiskt material, gruppen visade att citratbuffert ökade mängden lipid extraherade fosfatet jämfört med fosfatbufferten 22. Vidare, deras 1993 publikation 23 på påverkan av kalkning på markmikrobiella samhällen kom att bli ett citat klassiker i Soil Biology & Biochemistry 24. Forskarna utnyttjade principalkomponentanalys i sin databehandling. PLFA analys, som metoden kallas nu genererar stora datamängder och användning av multivariata statistiska metoder för att behandla dessa uppgifter var mycket innovativt för tid och inspirerande för många. Samtidigt till det arbete som görs i Sverige, ändringar av PLFA förfarandet har undersöks iTyskland av Zelles och kollegor 25-26. Deras version av förfarandet var känd för sin användning av en fast-fas extraktion (SPE) kolumn i stället för kiselsyrakolonn, men totalt sett var mer laboratorium intensiv.
Frostegård papper 23, tillsammans med den detaljerade metod av White & Ringelberg 27, under förutsättning att grunden för en explosion i användningen av PLFA teknik för att undersöka grundläggande frågor i markvetenskap. Sedan dess har ytterligare förbättringar av den metod Firestone och kollegor ingår sätta en intern GC standard (C10: 0) och C19: 0 som ett surrogat standard för att förbättra kvantifiering 28, och ersätta användningen av separations kanaler för rundflaskor för att förenkla extraktion 29. På senare tid, Chowdhury och Dick 30 undersökte metylering steg och rapporterade att de två metyleringsförfaranden används i marken vetenskaplig litteratur KOH / MeOH metod identified ett större utbud av fettsyror.
Denna metod bygger till stor del på den ursprungliga metod som utvecklats av Bligh och Dyer, och innehåller de ändringar som nämns ovan, såsom användning av metanol KOH för metylering steget. Två standarder används för varje prov: en surrogat standard 1,2-dinonadecanoyl--sn-glycero-3-fosfokolin (PC (19: 0/19: 0)), som läggs till jordprovet före den första extraktionen att bedöma effektiviteten och återvinning av hela protokollet, och en instrumentstandard metyl dekanoat (MeC10: 0), som tillsätts före identifiering och kvantifiering av GC.
Vi erkänner att PLFA metod används ofta av många mikrobiell ekologi laboratorier över hela världen, och har dokumenterats flera gånger, bland annat genom den internationella standardiseringsorganisationen 2. Syftet med detta dokument är att presentera en enkel att följa och robust protokoll som kan vara till nytta för jordforskare som försöker att lära sig PLFA teknik.
Protocol
OBS: Se alltid till att korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) bärs hela protokollet. Glas bör inte vidröras med bara händer. Lipider från fingrar, hår, fett, oljor och kolväten är alla potentiella föroreningar. Alltid bära nitril och skölj handskar med 70% alkohol vid hantering av rent glas.
1. Beredning av glas för analys
- Disponibel glas (t.ex. centrifugrör)
- Linda in i aluminiumfolie och värme i muffelugnen för fyra och en halv timme vid 450 ° C.
- Polytetrafluoreten (PTFE) -lined caps
- Blöt lock under en timme i fosfat detergent, och sedan tvätta med skurborste i varmt vatten och fosfat tvättmedel. Skölj av tvål med kranvatten.
- Plats i syrabad (5% HCl) under en timme bara (inte lämna längre eftersom liners kan falla ut ur locken om de indränkta för länge. Skölj tre gångeri kranvatten. Skölj tre gånger i destillerat vatten. Torka i ugn vid 40 ° C.
- Återanvändbara glas (t.ex. 10 ml, 15 ml, 45 ml flaskor / burkar)
- Tvätta med skurborste i varmt vatten och fosfat tvättmedel. Skölj av tvål med kranvatten och placera i syrabad (5% HCl) över natt. Skölj tre gånger i kranvatten, skölj sedan tre gånger i destillerat vatten och torka sedan i ugn vid 40 ° C.
- Linda in i ren aluminiumfolie (50 ml burkar är förpackade individuellt och andra glasvaror är insvept i provsatser, till exempel, 20) och värm i muffelugnen för fyra och en halv timme vid 450 ° C.
- Mätkolvar (t.ex. mätkolv)
- Tvätta med skurborste i varmt vatten och fosfat tvättmedel. Skölj av tvål med kranvatten och placera i syrabad (5% HCl) över natt. Skölj tre gånger i kranvatten, skölj tre gånger i destillerat vatten, och sedan torka i ugn vid 40 &# 186; C.
- Före användning skölj 3 gånger med en liten mängd lösningsmedel (t.ex. metanol) - inte sätta mätkolvar i muffelugnen.
2. Insamling och behandling av jordprover före PLFA Analys
- Samla jordprover i sterila påsar, och om dessa kan analyseras omedelbart, frysa dem så snart som möjligt. Förvara proverna i frys (-80 ° C) tills de ska gå vidare med frystorkning av prover. Frystorka partier av prover efter instruktioner från frystorken.
- Överför varje frystorkade prov till ny-märkt steril påse. Väg upp prov från frystorkat material i påsen i pre-märkt dova centrifugrör för PLFA extraktion.
OBS: En generell riktlinje är att använda 0,5 g för organiska material (kolhalt> 17 vikt-%) och upp till 3,0 g för mineraljordprover. Rekord provvikt för varje prov. - För varje 10 prover, även väga ut enytterligare två exemplar för analys, och för varje 20 prov inkluderar en tom (dvs. ett centrifugrör som inte har något prov i det - användes som en kontroll för att identifiera eventuella kontaminering under utvinningsprocessen PLFA). Process satser av provrör på samma gång.
OBS: En uppsättning av 20 prover motsvarar ett parti av 23 provrör (prov 1 till 10, en kopia av provet 10, prov 12-22, en kopia av provet 22, och en tom = sats av 23 provrör).
OBS: Genomför extraktion, sedan separation, sedan metylering i partier av prover innan du förbereder dem för GC-analys och köra dem alla tillsammans. Detta bidrar till att identifiera var misstag har hänt om något går fel, och kan bidra till att minska antalet nödvändiga upprepade extraktioner.
3. PLFA Technique (steg är för enskilt prov men fullständig en hel sats i taget)
OBS: Alla steg i PLFA teknik som beskrivs i steg1-3 nedan bör ske i ett dragskåp med lämplig skyddsutrustning och efter lab säkerhetsriktlinjer.
- Extraktion (Steg 1):
- Förbered 5,0 M KOH genom att lösa 14 g KOH i 50 ml destillerat, avjoniserat vatten (dH 2 O).
- Förbereda 0,15 M citratbuffert genom upplösning av 31,52 g citronsyramonohydrat i 400 ml dH 2 O. Justera till pH 4,00 ± 0,02 genom tillsats av 5,0 M KOH; cirka 45-50 ml 5,0 M KOH kommer att krävas för att justera pH till 4,00. När pH-värdet justeras, späd citratbuffert till 1000 ml med användning av en volumetrisk kolv. Förvara citratbuffert i kylskåpet när den inte används (för upp till en månad).
- Förbereda dagligen PC (19: 0/19: 0) nonadecanoate surrogat standard genom att späda 250 | il av stamlösningen (10 mg / ml) i 25 ml kloroform (detta ger tillräckligt surrogat standard för en sats av 23 prover). Tillsätt 0,5 ml PC (19: 0/19: 0) surrogat standardlösning till prov centrifugrör.
- endd kommer Bligh och Dyer extraktionsmedel till jordprovet i följande ordning: i) 2,0 ml citratbuffert, ii) 2,5 ml kloroform, och iii) 5,0 ml metanol. Cap provet med en PTFE-fodrade lock och skaka i 30 sekunder; plats i end-over-end shaker under 2 timmar.
- Centrifugera vid 226 xg under 15 min med locket på. Rita supernatanten med en pasteurpipett och överföring till en märkt 45 ml glasflaska.
- Lägg till en andra omgång av Bligh och Dyer extraktionsmedel till varje prov, och upprepa steg 4 och 5 ovan. Rita supernatanten med en pasteurpipett och överföring till samma märkta 45 ml glasflaska.
- Lägg till märkt 45 ml glasampull innehållande supernatanten: i) 5,0 ml kloroform, och ii) 5,0 ml citratbuffert. Cap med vit PTFE-fodrade lock och virvelglasflaska i 30 sek. Låt det stå över natten vid rumstemperatur i mörker (för att undvika oxidation).
- Försiktigt suga bort den övre vattenfasen av 45 ml injektionsflaska (om inget vakuum finns, bör pipetten sänkas genom aquegående fas mycket noggrant för att inte samla någon i pipetten vid pipettering den organiska fasen). Pipett lägre organiska fasen i märkt 15 ml flaska.
- Plats sats av 15 ml flaskor under komprimerad N 2 (för att undvika oxidering) vid rumstemperatur. Indunsta kloroform långsamt, inställning av N2-flöde till rufsa ytan av vätskan i flaskan men inte klättra sidorna av flaskan.
- Skruva fast PTFE-fodrade lock och förvara prover i frysen vid -20 ° C inslagna i aluminiumfolie (wrap i omgångar snarare än individuellt) tills redo att gå vidare med steg 2.
- Lipid fraktionering (Steg 2)
- Placera SPE kolonn hållare med tappar på glasbehållaren. Infoga nya SPE kolonner (kiseldioxid, 500 mg, 6 ml) i tapparna. Etikett år som behövs (rekommenderas att undvika att blanda ihop prover).
- Skick varje kolumn genom att tillsätta 5 ml aceton och låta det rinna igenom, och sedan lägga till två tillsatser av 5 ml kloroform (total volym = 10 ml). Tillåt andra kloroformtvättning att strömma ut tills ~ 1 mm ovanför frittan och stäng sedan tappen.
- Åter upplösa provet (lagrad i 15 ml flaska vid slutet av steg 1) genom att tillsätta 0,5 ml kloroform till flaska och skaka försiktigt. Transfer återupplöstes provet till SPE kolonn med användning av en pasteurpipett, upprepa för totalt 2 transfereringar (totala överföringsvolym 1 ml kloroform per prov).
- Lägg lipid prov direkt i mitten av kolonnen och låt lösningsmedel rinna helt i tanken.
- Eluera neutrala lipider genom att tillsätta 5 ml kloroform till varje kolumn. Låt lösningsmedel rinna helt i tanken.
- Eluera glykolipider genom tillsats av 5 ml aceton till varje kolumn. Låt lösningsmedel rinna helt i samlingstanken.
- Ta bort kolumn stå från tanken och tömma tanken med vakuumapparat. Sätt rack med rena och märkta centrifugrör i tanken. Byt kolumnen stå på tanken; märkt kolumn ovan bör linje med märkt centrifuge röret nedan.
- Eluera fosfolipider i centrifugrör genom att tillsätta 5 ml metanol till varje kolumn. Vänta SPE kolonner att torka ut i dragskåp före bortskaffande av dem. Torra ner fosfolipid fraktioner vid rumstemperatur under komprimerad N 2.
- Rensa rör med N 2. Skruva på PTFE-fodrade lock och förvara prover i frysen vid -20 ° C inslagna i aluminiumfolie (wrap i omgångar snarare än individuellt) tills redo att gå vidare till steg 3.
- Lipid metylering (steg 3).
- Aktiverar varmt vattenbad inställt på 37 ° C. Förbered 1M ättiksyra (om det inte redan gjorts) genom att lösa 57,1 ml isättika i 1000 ml dH 2 O med en 1000 ml mätkolv. Denna lösning kan förvaras vid rumstemperatur i upp till tre månader. .
- Förbereda sats av metanolisk KOH. Förbereda 0,2 M KOH-lösning genom upplösning av 0,45 g KOH i 40 ml metanol. Justera volymen av KOH och metanol enligt ennticipated satsstorlek i steg 3. Bered denna lösning dagligen; lagrar inte under längre perioder.
- Ta prover (i centrifugrör lagras efter steg 2) från frysen och låt prover för att komma till rumstemperatur. Tillsätt 0,5 ml kloroform och 0,5 ml metanol till varje prov, följt av 1,0 ml metanolisk KOH. Förslut rören väl med PTFE-fodrade lock. Snurra för att blanda.
- Placera förseglade prover i 37 ° C bad under 30 min. Säkerställa att vattennivån är minst 1-2 mm ovanför nivån för provvätskan. Ta bort och låta prover svalna. Medan proven i vattenbad, märka små glasflaskor med prov ID (10 ml glasflaska med PTFE-fodrade lock).
- Lägga 2,0 ml hexan till varje prov och virvel. Tillsätt sedan 0,2 ml av 1,0 M ättiksyra till varje prov och virvla runt för att blanda igen; fasseparation ska bli synliga.
- Lägga 2,0 ml dH 2 O till varje prov för att bryta fas. Vortex prover för 30 sek. Centrifugera proverna vid 226 xg under 2 min.
- Använder sig avkort Pasteur pipett toppfasen att rengöra märkt 10 ml flaskor. Var noga med att inte överföra något av lägre (vatten) fasen.
- Lägga 2,0 ml hexan till varje prov centrifugrör och virvel. Vortex prover för 30 sek. Centrifugera proverna vid 226 xg under 2 min.
- Med användning av korta pasteurpipett, återigen lägga toppfasen till den märkta 10 ml glasampull.
- Indunsta lösningsmedlet under märkt-10 ml glasflaska vid rumstemperatur under N2. Skruva fast PTFE-fodrade lock och förvara prover i frysen vid -20 ° C inslagna i aluminiumfolie (wrap i omgångar snarare än individuellt) tills redo att gå vidare med GC-analys. Var noga med att märka alla prover.
- Gaskromatograf (GC) -analys
OBS: Identifiering och kvantifiering av de individuella PLFAs åstadkommes med användning av en GC ansluten till antingen en FID eller en MS-detektor. Medan instruktionerna nedan för GC-FID, skulle provberedning gälla för GC-MS som waln. Ett exempel set-up för en GC-FID-systemet skulle innefatta en 25 m x 0,2 mm x 0,33 m (5% fenyl) -methylpolysiloxane kolonn med följande temperaturprotokoll: initial temperatur 190 ° C, ramp 10 ºC / min till 285 ° C håll 9,5 min, ramp 60 ºC / min till 310 ° C, håll 0,42 min 31.- Förbered GC intern standard (ISTD) genom att tillsätta en droppe MeC10: 0 (metyl decanoate) till 100 ml hexan (rekord tyngd till 0,1 mg). Slå på gaser till GC och slå sedan på GC. Se till att H 2, N 2 och luftcylindrar är öppna och att det finns tillräckligt med gas för att köra analysen (H 2 får aldrig komma under 500 psi).
- Kontrollera att villkoren för en god kalibrering uppfylls genom att köra kalibreringsstandarder som innehåller en blandning av fettsyror, följt av en hexan tomt. Identitet enskilda fettsyror kan tilldelas manuellt baserat på jämförelser med retentionstider som erhålls för standarderna, eller det kan vara AUTOMATICAlly tilldelas med hjälp av kommersiellt tillgängliga programvaror 31. I samtliga fall kan åstadkommas entydig identifiering med hjälp av en MS-detektor 2.
OBS: Ytterligare tecken på en god kalibrering inkluderar en platt baslinje och ingen kontaminering i hexan sköljningen. - Lös varje PLFA provrester (som finns i 10 ml glasflaska från lipid metylering Steg 3) i 150 pl av ISTD lösning och överför till GC flaskan (alternativt använda 50 till 75 l om provsvaret förväntas vara svag, till exempel i mycket sandjordar).
- Ställ in provinjektionsvolym till 2 | j, l. Ställa in FID temperaturen till 300 ° C. Köra proverna med användning av en inloppstemperatur av 250 ° C, med H 2 som bärargas (flödeshastighet 1,3 ml / min) och en split-förhållande av 30: 1.
Representative Results
Fettsyror är identifierade som X: YωZ, där X representerar antalet kolatomer, representerar Y antalet dubbelbindningar, och Z anger läget för den första dubbelbindningen från alifatiska (ω) änden av molekylen. Suffixen "c" och "t" anger cis- och geometriska isomerer. Den prefix och suffix "a" och "i" avser Anteiso och iso förgrening och Me och OH ange metylgrupper och hydroxylgrupper, respektive.
Post-GC körning kontrollera att proverna fått tillräcklig ISTD genom att titta på 10: 0 topp. Kontrollera även svaret hos GC standarder, det vill säga, de flaskor som innehåller hexan med tillsats ISTD lösning; Dessa bör inte ha några andra toppar. Intern standard svar bör vara densamma i alla körningar.
Figur 1 presenterar en representiv provkörning. Den stora hexan lösningsmedelstoppen visas karakteristiskt vid en retentionstid (RT) runt 1,8 minuter. Standard topp ISTD (C10: 0) visas på en RT av 3,4 minuter, medan C19: 0 har en RT av 16,2 min. GC-analysen separerar PLFAs baserat på deras kedjelängd, med längre kedjor eluering långsammare; till exempel, C18: 0 eluerar vid 14,4 min medan C16: 0 eluerar vid 10,8 min. Dessutom kan denna analytiska protokoll separera PLFAs baserat på deras grad av omättnad och positionen av deras dubbelbindning; till exempel, C18: 0 eluerar vid 14,4 min, medan C18: 1 9c, och C18: 1 7c eluerar vid 14,0 och 14,1 min, respektive (Figur 1). Slutligen kan PLFAs av liknande kedjelängd och mättnads men olika gren konfiguration (Anteiso mot iso) separeras; till exempel, C15: 0i och C15: 0a eluerar vid 8,6 och 8,7 minuter, respektive (Figur 1).
De områden av de olika GC topparna kan vara importas till ett kalkylprogram för att ytterligare bearbeta gaskromatogram informationen. Varje identifierad PLFA kvantifieras (nmol g -1 torr jord) enligt följande formel:
där F är en justeringsfaktor som tar hänsyn till FID selektivitet och molariteten skillnaderna mellan fettsyror 32, är areaPLFA toppytan för varje identifierad PLFA, areaC10: 0 är topparean för ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std sätts är mängden ISTD (nmol) tillsattes till varje prov före GC sikt förhållandet (C19: 0 std läggas / C19: 0 prov) motsvarar återvinning av datorn (C19: 0 / C19: O) surrogat standard, och provets vikt är mängden av ugnstorkad jord (g) till det ursprungliga provet centrifugröret och används för att extrahera PLFAs.
OBS: De områden under different toppar uttrycks som toppområden, svar eller% svar beroende på GC-systemet. Inom intervallet av betydelse för jord PLFA karakterisering, kan områden antas vara linjärt proportionell mot vikterna av fettsyror; Alternativt kan små korrektionsfaktorer användas för att redogöra för FID selektivitet 32. Dessutom, eftersom resultaten initialt uttrycks på en viktprocentbasis, måste de normaliseras för att ge molära mängder. Justering för molaritet skillnader uppnås genom att ta hänsyn molekylvikterna för de enskilda fettsyror; publicerade tabellerna 32 och kommersiell programvara 31 finns också att hjälpa till när normalisera för molaritet.
Mängden ISTD (nmol) sattes till varje prov kan beräknas med följande formel:
C10: 0std added = [ISTD] × V (STD tillsatt)
[ISTD] är koncentrationen (nmol l -1) i MeC10: 0 (metyl decanoate) löst i hexan (se steg 3.4.1), och V (STD tillsatt) är volymen (L) av beredd ISTD-lösning sattes till varje prov före GC körningen (dvs., 150 pl enligt steg 3.4.4).
Mängden C19: 0 (nmol) närvarande i varje prov under GC-analys motsvarar:
där areaC19: 0 är topparean för C19: O, medan motsvarande mängd C19: 0 (nmol) tillsattes till varje prov i början av PLFA extraktionsmetoden (jfr steg 3.1.3) är:
där [19: 0] Std (mg L -1 (19: 0 std tillsatt) volymen av beredd surrogat standard sattes till varje prov vid början av den PLFA extraktion metoden (jfr steg 3.1.3), M 19: 0 är molekylvikten av 1,2-dinonadecanoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (PC (19: 0/19: 0)).
OBS: En mol C19: 0 nonadecanoate surrogat standard ger två mol C19: 0 efter metylering steg, medan C10: 0 standard tillsätts efter metylering.
Följande PLFAs typiskt undantas från analys av jord mikrobiella samhällen: i) PLFAs som är <14 C och> 20 C i längd, och ii) PLFAs med mindre än 0,5% av den totala i topparea. När dessa PLFAs har uteslutits, kan svaren från alla återstående PLFAs summeras för att erhålla den totala PLFA biomass (nmol g -1 torr jord). Univariat analys av PLFA uppgifter (t.ex. ANOVA, följande data transformation som är lämpligt för att uppfylla de antaganden av testet utförs) kan användas för att jämföra total PLFA biomassa och / eller PLFA biomassa av utvalda grupper bland prov grupper / behandlingar. Till exempel, Figur 2 presenterar resultat för den relativa fördelningen av olika PLFA grupper, såsom rakkedjiga mättade PLFAs, mättade PLFAs med antingen halva kedja (10-metyl) eller terminal förgrening, och mono- eller fleromättade PLFAs, samt summan av den totala PLFAs (nmol g -1 torr jord). I detta speciella exempel ålder träd (som minskar från Site 1 till Site 3) ses för att påverka både den totala PLFAs och den relativa fördelningen av de olika PLFA grupperna.
För att utvärdera övergripande mönster i PLFA sammansättning bland prover kan multivariat analys av alla PLFAs vara conducted 33. De PLFA uppgifter måste omvandlas efter behov före den valda multivariat analys för att möta antaganden om statistiskt test och forskningsfrågan behandlas, till exempel, är en Hellinger transformation ofta används för att relativisera uppgifterna. Figur 3 visar resultaten från en icke -metric multidimensionell skalning (NMDS) samordning av samma data som användes i figur 2; NMDS är en icke-parametrisk, multivariat teknik som ger 2- eller 3-dimensionella placeringen av datapunkter baserat på likheten mellan ranking poäng mellan prover.
Figur 1. Representant GC-FID kromatogrammet. Ett prov som erhållits från en odlad Brown Chernozemic jord användes för denna analys. Retentionstider och motsvarande PLFAs (inom parentes) och deras topparea (pA) are anges i figuren för representativa toppar. För tydlighetens skull inte alla toppar som anges på figuren, även om denna särskilda prov gav 33 identifierade PLFAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Relativ överflöd av sex olika klasser av PLFAs (% av den totala PLFAs), och total PLFA biomassa (nmol g -1 torr jord). Prover från skogs Luvisolic jordar användes för denna analys. Resultaten tyder på större totala PLFAs för jorden vid Site 1, som ligger i äldre träd (> 50 år), följt av mellanåldern (25 år) träd (Site 2), och slutligen de yngsta (10 år) träd ( site 3). Relativt mer mättade PLFAs är närvarande vid de yngstaplats, medan flera omättade PLFAs är närvarande vid den äldsta platsen. Felstaplar representerar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Icke-metrisk multidimensionell skalning (NMDS) samordning av PLFAs (med% av den totala PLFAs data) axlarna 2 och 3 av en 3-dimensionell lösning. Denna samordning beräknades genom att använda samma uppgifter som de som används för figur 2. Den yngsta plats (site 3) skiljer mycket tydligt från de äldre två platser (platser 2 och 3), som visar överlappningen i deras PLFA mikrobiella kompositionen. Mängden variationen i PLFA samhället uppgifter förklaras av varje axel ingår inom parentes; 72,5% av variationen förklaras av dessa två axlar för ett 3-dimennella NMDS lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
För att minimera och undvika feltolkning av PLFA data måste noggrann uppgifter screening göras eftersom vissa PLFAs som finns i jorden mikrobiella samhället är också närvarande i enkla och flercelliga eukaryota organismer, såsom växtrötter, alger och markdjur. Dessutom behöver Archaea innehåller inte PLFAs; istället sänds archaeal membran bestående av fosfolipid eterlipider (PLELs). Följaktligen kan PLFA protokollet inte användas för att karakterisera archaeal samhällen i jord.
Associera enskilda PLFAs till specifika mikrobiella grupper bör göras med försiktighet (se 2011 års publicering av Frostegård och kollegor 34 för en utmärkt diskussion av några av begränsningarna i PLFA metoden). I stället kan det vara mer lämpligt, som gjordes i figur 2, att gruppera PLFAs baserat på sin kemiska struktur, till exempel, i) rakkedjiga mättade PLFAs, ii) mättade PLFAs med mitten av chain (10-metyl) förgrenade, iii) terminalt-grenade mättade fettsyror, iv) enkelomättade PLFAs, v) fleromättade PLFAs samt vi) hydroxifettsyror.
Prowikt kan behöva justeras baserat på mängden extraherbara PLFAs ingår i ett givet jordprov. Genom att inte justera mängden jord utvinns i mindre mikrobiellt aktiva jordar användare riskerar att inte få tillräckligt många PLFA svar (toppar) att korrekt representera den totala mikrobiella. I starkt mikrobiellt aktiva jordar med höga koncentrationer av PLFAs användare löper risk för överbelastning av GC-kolonnen och därigenom förhindra korrekt kvantifiering av PLFAs. I båda fallen jordprover måste analyseras på nytt för PLFAs. En bra utgångspunkt är att lägga till 0,5 g för organiska jordprover (såsom skogs våningar), och ca 3 g under mineraljordprover. Eftersom mängden extraherbara PLFAs typiskt korrelerad till mängden organiskt kol som ingår i en jord, prov viight kan justeras baserat på innehåll av kol i marken, till exempel, kan en g mineraljordprov vara tillräcklig för att få en bra PLFA kvantifiering när kolhalten är 10-15%, medan> 5 g kan vara nödvändigt om kolhalten är ≤ 0,5 %. Det är alltid en bra idé att göra en provkörning med några prover för att optimera prowikt innan hela uppsättningen körs.
Vanliga felsöknings strategier för PLFA protokoll och GC-analys är som följer. Om GC kromatogram baslinjen är för hög, bör H2 gascylinder ändras. Om lösningsmedlet eller ISTD toppar saknas i kromatogrammet, kan det finnas ett problem med provinjektion (t.ex. ansluten spruta, problem med autosampler, tom eller saknas flaska, fel med flaskan positionering). Om fler än tre toppar detekteras i metoden / prov tomt, det finns kontamination av blankprovet, och det finns en hög sannolikhet för att ett visst främmande ämne (er) kommer att vara närvarande i provet GC chromatograms. Hitta smittkällan (vanligtvis vattenbaserat medium), eller åtminstone se till att de toppar som motsvarar föroreningen avlägsnas från prov kromatogram och att dessa toppar inte ingår i någon statistisk analys av de PLFA data. Dessutom är det en bra idé att köra hexan sköljer mellan prov vid misstanke överföring är. Ytterligare toppar i hexan sköljningen kommer att indikera överföring (dvs tyngre komponenter eluerades från föregående körning).
Lipider är särskilt känsliga för oxidation, och särskild försiktighet måste iakttas under protokollet för att skydda proverna från luft och ljusexponering, såsom att lagra dem i mörkret och hålla dem under kväve. Alla prover och ämnen måste ha tillräcklig C19: 0 surrogat standard. En saknad C19: 0 topp, antingen prov eller ämnen, indikerar en dålig återhämtning eller en total förlust av analyter. Ett svar av C19: 0 i proverna som är betydligt lägre än den metod / provämnen indikerar en förlust av analyter vid något tillfälle i PLFA metoden. När man står inför dålig C19: 0 återhämtning, alla aspekter av förfarandet måste övervägas noga och undersökte bland annat inledande extraktion, alla stadier av provöverförings, SPE, fettsyra metylering, torkning, förvaring och prov manipulation för att isolera stadium eller stadier där analyter förlorade. Å andra sidan kan det vara så att utvinningen av vissa jordprover kan ge C19: 0, i vilket fall återvinning av surrogat standarden kan överskattas. När du använder två standarder ((PC (19: 0/19: 0) och MeC10: 0) är inte ett absolut krav, vi har funnit att det är mycket användbart när man behöver felsöka Så länge MeC10. 0 svar är tillräckligt kan felsökning fokusera på trappan före GC-analys.
Som tidigare nämnts, måste försiktighet iakttas vid tolkningen ekologisk betydelse och ekosystem relationer baserade enbart på biomarkörer härledad från PLFA data eftersom rena kulturstudier visar att isolerade bakteriestammar kommer att innehålla olika typer av PLFAs. I stället bör biomarkörer PLFAs ses som ett värdefullt tillägg i en svit av bevis när man gör bredare ekologiska slutsatser. I litteraturen har enskilda PLFAs föreslagits och används som biomarkörer för olika mikrobiella grupper. Mättade PLFAs används typiskt för att representera grampositiva bakterier och monoomättade PLFA används för gramnegativa bakterier. Erkända biomarkörer för gramnegativa bakterier innefattar mono-omättade fettsyror med omättnaden vid ω5 eller ω7 läge t.ex. C16: 1ω7, C18: 1ω7, och C18: 1ω5. Dessutom kan cyklopropyl fettsyror också vara representativa för gramnegativa bakterier 35. Därför kan PLFAs från gramnegativa bakterier beräknas vara lika med summan av A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Erkända biomarkörer för grampositiva bakterier är terminalt förgrenade saturated fettsyror, iso-grenade såsom C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; eller Anteiso förgrenat, såsom C15: 0a och C17: 0a. Mättad PLFAs med mitten av kedjan (10-metyl) förgrening, såsom 10Me16: 0 och 10Me18: 0 är karakteristiskt närvarande i aktinomyceter 36. Således kan PLFAs från grampositiva bakterier att beräknas som lika med summan av A: 0 (ISO, Anteiso, 10-metyl).
Många biomarkörer i samband med svamp PLFA ofta fleromättade, men vissa svamp biomarkörer är enkelomättade. Till exempel, i termer av svamp enkelomättade biomarkörer, C16: 1ω5 har identifierats som en indikator på arbuskulära mykorrhizasvampar (AMF) 37, C18: 1ω9 är vanligt i saprofytiska svampar och ektomykorrhiza innehåller typiskt C16: 1ω9. Närvaron av di-omättade C18: 2ω6,9 inträffar ofta i samband med C18: 1ω9 och även korrelerar väl med det fungala sterol ergosterol, vilket tyder på att C18: 2ω6,9 kan adekvat sätt representera ectomycorrhizae och saprofytiska svampar 38. Tri-omättade C18: 3ω 6,9,12 har också använts som en biomarkör för svampar 10; dock C18: kan 3ω6c hittas i andra eukaryota organismer, inklusive växter och alger, även om det är normalt inte hittas i bakterier. På sikt av jord protists, C20: har 4ω6c erkänts som en protist biomarkör 39, även om annat arbete misslyckats med att upptäcka C20: 4ω6c även när livskraftiga protist populationer bekräftades visuellt med ljusmikroskop 40.
Många studier adress ekologiska frågor som rör den totala markmikrobiella genom att använda multivariata samordningsmetoder som PLFA dataanalys verktyg. Vid användning av denna metod har vissa författare valt att utesluta sällsynta PLFAs från datamängden genom att ta bort PLFAs som förekommer i mindre än 5% av proverna 4. De normala mättade C16: 0 och C18: 0 finns rikligt i alla mark mikroorganismer, inklusive prokaryoter och EUKaryotes. Därför vissa forskare väljer att ta bort dessa PLFAs före statistisk analys på grund av att de inte kan vara känsliga indikatorer på sammansättningen av jorden mikrobiella - även C16: 0 och C18: 0 återstår att inkluderas när summera alla PLFAs för ett index på mikrobiell biomassa. På sikt av statistiska analyser, många forskare väljer att genomföra en icke-metrisk multidimensionell skalning (NMDS) samordning som denna teknik är väl lämpad för uppgifter som inte får vara normalfördelad 33. Ytterligare analyser i samband med kategoriska variabler kan inkludera indikatorarter analys, som kan relatera förekomsten av specifika PLFAs till kategoriska grupperingar och multi svar permutation förfaranden (MRPP), vilket kan bidra till att avgöra likheter eller skillnader mellan mikrobiella samhällen tilldelats kategoriska grupper. Dessutom kan multivariata regressionsträd (MRT) vara särskilt användbart när påverkan av flera experimentella variabler ellerbehandlingar måste bedömas som potentiella förklaringsvariabler 5 (t.ex. markens struktur, fukt, återvinning ålder).
När etablerade, är PLFA protokoll en relativt enkel analysmetod som kan vara mycket användbart när kvantifiering av markmikrobiella svar på miljöförändringar och antropogena störningar. Även molekylära tekniker såsom genetiska fingeravtryck är bättre lämpade för detaljerad beskrivning av mikrobiella samhällen, presenterar PLFA metoden fördelen att den ger kvantitativ information om total mikrobiell biomassa 34. I vår forskningslaboratorium, kan en person bekvämt bearbeta en uppsättning av 20 prover under 4 dagar, och vi har funnit det protokoll som presenteras här att vara ett robust och reproducerbar teknik för att bedöma markens biologiska kvalitet.
Kraften i PLFA metoden kan betydligt längre genom att koppla den till en stabil isotopanalys 41, 42. Specifikt tillägg of 13 C-märkta substrat mot marken möjliggör kvantifiering av substrat införlivande i jord mikroorganismer men isotopanalys av enskilda PLFAs 41. Dessutom verkar den här metoden för att vara en mycket lovande verktyg för att belysa trofiska länkar i marken näringsvävar 42.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
