Summary
Fosfolipid fettsyrer gir informasjon om strukturen av jord mikrobielle samfunn. Vi presenterer fremgangsmåter for utvinning av jordprøver med en enfaset kloroform blanding, fraksjonering av ekstraherte lipider ved hjelp av fastfase-ekstraksjon kolonner, og metanolyse for å fremstille fettsyremetylestere, som analyseres ved kapillar gasskromatografi.
Abstract
Fosfolipid fettsyrer (PLFAs) er sentrale komponenter i mikrobielle cellemembraner. Analysen av PLFAs hentet fra jord kan gi informasjon om den overordnede strukturen av terrestriske mikrobielle samfunn. PLFA profilering har vært mye brukt i en rekke økosystemer som en biologisk indeks over generelle jordkvalitet, og som en kvantitativ indikator på jord respons på arealforvaltningen og andre miljømessige stressfaktorer.
Standardmetoden som presenteres her skisserer fire hovedtrinn: 1. lipid ekstraksjon fra jordprøver med en enfaset kloroformblanding, 2. fraksjonering ved hjelp av fastfase-ekstraksjon kolonner for å isolere fosfolipider fra andre ekstraherte lipider, 3. metanolyse av fosfolipider for å produsere fettsyre metylestere (fames), og 4. FAME analyse ved kapillær gasskromatografi ved anvendelse av en flammeioniseringsdetektor (GC-FID). To standarder er brukt, inkludert 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) til å vurdere den samlede utvinning av utvinningsfremgangsmåten, og metyl-dekanoat (MeC10: 0) som indre standard (ISTD) for GC-analyse.
Introduction
Fosfolipid fettsyrer (PLFAs) er en del av mikrobielle cellemembraner fra domenene bakterier og Eukarya. Mikroorganismer produserer PLFAs med forskjellig kjedelengde og sammensetning som et middel for å opprettholde cellemembranintegritet og cellulær funksjon som reaksjon på deres umiddelbare miljøbetingelser; dermed kan det hevdes at bakteriesamfunn som er atskilt geografisk, men er utsatt for tilsvarende grunnforhold vil uttrykke lignende PLFAs. Jord PLFAs med en kjedelengde mellom 14 og 20 C-atomer er vanligvis ansett for å være hovedsakelig av bakterie- og sopp opprinnelse 1. I blandingskulturer kan PLFA analyse ikke anvendes for å identifisere individuelle mikrobielle arter, men det kan gi en samlet fingeravtrykk av de mikrobielle samfunn som finnes i jordsmonn. I tillegg, siden PLFAs hurtig nedbrytes ved celledød, de kan anses å være representative for de levedyktige mikrobielle jord fellesskap 2. dette technique har vært mye brukt for å karakterisere strukturelle sammensetningen av bakteriesamfunn som finnes i en rekke miljøer, alt fra skoger 3-4 til prærier 5-6 og landbruks felt 7. Det har blitt brukt for å karakterisere jord respons til land leder endringer, inkludert skog klar-kutte 8, 9 liming, gjenvinningen 10-12, så vel som forstyrrelser som brann 13, forurensning av metaller 14 og 15 hydrokarboner, og insekt utbrudd 16 .
Den moderne PLFA analysemetode utviklet seg i løpet av de siste seks tiårene gjennom flere viktige fremskritt av en rekke forskningsgrupper. I 1958, en betydelig forbedring oppsto fra justering av kloroform: metanol: vann-forholdet i ekstraksjonsløsningen å skifte blandingen fra en monofasisk til et tofaset system 17. Denne optimaliserte lipid ekstraksjon og den reviderte isolasjon proprotokollen ble kjent som Bligh og Dyer metoden. Protokollen ble vedtatt av mange laboratorier i løpet av de neste tiårene, og i løpet av denne tiden, hvit og kolleger bidro betydelige fremskritt mot metoden; for eksempel, forbedret de ekstraksjonstrinnet ved å utveksle en fosfatbuffer for vann, og de optimalisert analyse ved gasskromatografi (GC) ved hjelp av forbedret topp identifisering og kvantifisering. Kanskje mer relevans til jord vitenskap, bestemte de i 1979 at de utpakkede lipider kan brukes som en indeks av mikrobiell struktur når de undersøkte mikrobiell biomasse av marine sedimenter 18.
Videre utvikling fant sted i 1980 da metoden ble mer utbredt benyttet i jord vitenskap, spesielt i forhold til rhizosphere 19. På den tiden, idet fremgangsmåten er inkludert metyl nonadecanoate (MeC19: 0) som indre standard 19 og bruk av en kiselsyre-kolonne for fraksjonering lipid 21 </ Sup>. Etter hans arbeid med Hvit 19,21, Tunlid tilbake til Sverige og begynte forskningssamarbeid med Bååth og Frostegård. Ved å undersøke effektiviteten av forskjellige utvinningsbuffere for en pakke med jord varierende innhold av organiske bestanddeler, gruppen viste at citratbufferen økte mengden av lipid fosfat ekstrahert sammenlignet med fosfatbufferen 22. Videre deres 1993 publikasjon 23 på påvirkning av kalking på jord mikrobielle samfunn gikk videre til å bli et sitat klassiker i Soil Biology & Biochemistry 24. Forskerne benyttet prinsipal komponent analyse i sin databehandling. PLFA analyse, som metoden kalles nå, genererer store datasettene og bruk av multivariate statistiske fremgangsmåter for å behandle disse data var svært innovative for tiden og inspirasjon for mange. Samtidig med arbeidet som gjøres i Sverige, ble endringer i PLFA prosedyren blir etterforsket iTyskland ved Zelles og kolleger 25-26. Sin versjon av prosedyren var kjent for sin bruk av en fast-fase ekstraksjon (SPE) kolonne i stedet for kiselsyre kolonnen men samlet, var mer laboratoriekrevende.
Frostegård papir 23, sammen med detaljerte metoder ved White & Ringelberg 27, dannet grunnlaget for en eksplosjon i bruken av PLFA teknikk for å undersøke grunnleggende spørsmål i jord vitenskap. Siden den gang har ytterligere forbedringer av metoden Firestone og kolleger inkludert å legge en intern GC standard (C10: 0) og C19: 0 som et surrogat standard for å bedre kvantifisering 28, og erstatte bruk av skille trakter for runde bunn ampuller å forenkle utvinning 29. Mer nylig, Chowdhury og Dick 30 undersøkte metylering trinnet og rapporterte at de to metylering prosedyrer som brukes i jorden vitenskap litteraturen KOH / MeOH metode identsert et større spekter av fettsyrer.
Den presenterte fremgangsmåte er i stor grad basert på den originale metode utviklet av Bligh og Dyer, og inkorporerer modifikasjoner som er nevnt ovenfor, for eksempel ved bruk av metanolisk KOH for metylering trinnet. To standarder benyttes for hver prøve: et surrogat standard av 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (PC (19: 0/19: 0)), som er lagt til jord prøven før den første ekstraksjon for å vurdere effektiviteten og gjenvinning av hele protokollen, og et instrument standard metyl- dekanoat (MeC10: 0), som tilsettes før identifikasjon og kvantifisering av GC.
Vi erkjenner at PLFA metoden er ofte brukt av mange mikrobiell økologi laboratorier over hele verden, og har blitt dokumentert mange ganger, blant annet av International Organization for Standardization to. Formålet med denne artikkelen er å presentere en enkel å følge og robust protokoll som kan være nyttig for jordforskere som prøver å lære PLFA teknikk.
Protocol
MERK: Pass alltid på at riktig personlig verneutstyr (PVU) er slitt hele protokollen. Glass må ikke berøres med bare hender. Lipider fra fingre, hår, fett, oljer og hydrokarboner er alle potensielle forurensninger. Alltid bruke nitrilhansker og skyll hansker med 70% alkohol ved håndtering av rent glass.
1. Utarbeidelse av Glass for analyse
- Engangs glass (f.eks sentrifugerør)
- Pakk inn i aluminiumsfolie og varme i muffelovn for fire og en halv time ved 450 ºC.
- Polytetrafluoretylen (PTFE) -lined caps
- Sug caps for en time i fosfat vaskemiddel, og deretter vaske med skurebørste i varmt vann og fosfat vaskemiddel. Skyll av såpe med vann fra springen.
- Plasser i syrebad (5% HCl) i en time bare (ikke la lenger som liners kan falle ut av caps hvis de er gjennomvåt for lenge. Skyll tre gangeri vann fra springen. Skyll tre ganger i destillert vann. Tørr i ovn ved 40 ºC.
- Gjenbruk glass (f.eks 10 ml, 15 ml, 45 ml hetteglass / krukker)
- Vask med skurebørste i varmt vann og fosfat vaskemiddel. Skyll av såpe med vann fra springen, og plasser i syrebad (5% HCl) over natten. Skyll tre ganger i vann fra springen, og skyll tre ganger i destillert vann og tørk i ovnen ved 40 ºC.
- Pakk i ren aluminiumsfolie (50 ml krukker er pakket enkeltvis og andre glassvarer er pakket inn i prøve grupper, for eksempel 20) og varme i muffelovn for fire og en halv time ved 450 ºC.
- Volumetrisk glass (f.eks målekolbe)
- Vask med skurebørste i varmt vann og fosfat vaskemiddel. Skyll av såpe med vann fra springen, og plasser i syrebad (5% HCl) over natten. Skyll tre ganger i vann fra springen, skyll tre ganger i destillert vann, og tørk i ovn ved 40 &# 186; C.
- Før bruk skylle 3 ganger med en liten mengde løsemiddel (f.eks metanol) - Ikke legg volumet glass i muffelovn.
2. innsamling og prosessering av jordprøver før PLFA analyse
- Samle jordprøver i sterile poser, og med mindre disse kan analyseres umiddelbart fryse dem så raskt som mulig. Oppbevar prøver i fryser (-80 ºC) før du er klar til å gå videre med frysetørking av prøver. Fryse tørre partier av prøvene etter instruksjoner om å fryse tørketrommel.
- Overfør hver frysetørket prøve til ny-merket steril pose. Vei opp prøven fra frysetørket materiale i posen i pre-merket dempet sentrifugerør for PLFA utvinning.
MERK: En generell retningslinje er å bruke 0,5 g for organisk materiale (karboninnhold> 17% wt) og opp til 3,0 g for mineraljordprøver. Record prøvevekt for hver prøve. - For hver 10 prøver, også veie ut enytterligere duplikat for analyse, og for hver 20 sampler omfatter en tom (dvs. et sentrifugerør som ikke har noen prøve i den - anvendt som en kontroll for å identifisere eventuelle potensielle forurensning under PLFA utvinningsprosessen). Prosess satser av prøverørene på samme tid.
NB: Et sett med 20 prøver vil svare til en gruppe med 23 prøverør (prøver 1 til 10, en duplikat av prøven 10, prøver 12 til 22, en duplikat av prøven 22, og en blank = gruppe med 23 prøverør).
MERK: Gjennomføre utvinning, deretter separasjon, da metylering i grupper av prøver før forbereder dem for GC analyse og kjøre dem alle sammen. Dette bidrar til å identifisere hvor feil har skjedd hvis noe går galt, og kan bidra til å redusere antall nødvendige gjentatte ekstraksjoner.
3. PLFA Technique (trinnene er for enkelt prøve, men komplett en hel batch av gangen)
MERK: Alle trinnene i PLFA teknikken beskrevet i trinn1-3 nedenfor bør gjennomføres i et avtrekksskap ved hjelp av egnet verneutstyr og følge lab sikkerhetsretningslinjer.
- Utvinning (trinn 1):
- Fremstille 5,0 M KOH ved å oppløse 14 g KOH i 50 ml destillert, deionisert vann (dH 2 O).
- Forbered 0,15 M citratbuffer ved å oppløse 31,52 g sitronsyre-monohydrat i 400 ml dH 2 O. Juster til pH 4,00 ± 0,02 ved å legge 5,0 M KOH; ca 45-50 ml 5,0 M KOH, vil være nødvendig for å justere pH til 4,00. Når pH-verdien er justert, fortynnet citratbuffer til 1000 ml ved hjelp av en volumetrisk kolbe. Oppbevar citratbuffer i kjøleskapet når den ikke er i bruk (for opp til en måned).
- Forbered daglig PC (19: 0/19: 0) nonadecanoate surrogat standard ved å fortynne 250 ul av stamløsningen (10 mg / ml) i 25 ml kloroform (dette gir nok surrogat standard for baking av 23 prøver). Tilsett 0,5 ml av PC (19: 0/19: 0) surrogat standardløsning til prøven sentrifugerør.
- ENdd det Bligh og Dyer ekstraksjonsmiddel til jordprøven i følgende rekkefølge: i) 2,0 ml sitratbuffer, ii) 2,5 ml kloroform, og iii) 5,0 ml metanol. Cap prøven med en PTFE-lined cap og vortex i 30 sekunder; plassere i ende-over-ende-risteapparat i 2 timer.
- Sentrifuger ved 226 xg i 15 min med lokket på. Tegn supernatanten av med en Pasteur-pipette og overføres til et merket 45 mL hetteglass.
- Legg en ny runde med Bligh og Dyer ekstraksjonsmiddel til hver prøve, og gjenta trinn 4 og 5 over. Tegn supernatanten av med en Pasteur-pipette og overføres til det samme som er merket 45 mL hetteglass.
- Legg merket til 45 mL hetteglass inneholdende supernatant: i) 5,0 ml kloroform, og ii) 5,0 ml citratbuffer. Cap med hvit PTFE-lined cap og vortex glass hetteglass for 30 sek. La den sitte over natten ved romtemperatur i mørket (for å unngå oksidasjon).
- Forsiktig vakuum av den øvre vandige fase av 45 ml hetteglass (hvis ikke noe vakuum er tilgjengelig, bør pipetten senkes gjennom aqueOUS fase veldig nøye for å ikke samle på pipetten når pipettering den organiske fasen). Pipette lavere organisk fase inn merket 15 ml hetteglass.
- Sted gruppe med 15 ml ampuller i henhold til komprimerte N 2 (for å unngå oksydasjon) ved romtemperatur. Fordampe kloroform langsomt, innstilling av N2 strømmen til krusning på overflaten av væsken i ampullen, men ikke klatre på sidene av ampullen.
- Skru på PTFE-lined cap og lagre prøvene i fryseren ved -20 ºC innpakket i aluminiumsfolie (wrap i grupper i stedet for enkeltvis) til den er klar til å gå videre med trinn 2.
- Lipid fraksjonering (trinn 2)
- Plasser SPE kolonne holder med stussene på glasset tank. Sett inn nye SPE kolonner (silika, 500 mg, 6 ml) i stussene. Merk kolonner som nødvendig (anbefales å unngå blanding prøver).
- Tilstand hver kolonne ved å tilsette 5 ml aceton og la det renne gjennom, og deretter legge til to tilsetninger av 5 ml kloroform (totalt volum = 10 ml). Tillat andre kloroform vask å strømme ut inntil ~ 1 mm over fritte og deretter lukke stussen.
- Re-oppløse prøve (lagret i 15 ml hetteglass ved slutten av trinn 1) ved tilsetning av 0,5 ml kloroform forsiktig til hetteglass og virvle. Overføring re-oppløste prøven til SPE kolonne ved bruk av en Pasteur-pipette; gjenta for totalt 2 overføringer (total overføring volum på 1 ml kloroform per prøve).
- Lå lipid prøven direkte inn i sentrum av kolonnen og la oppløsningsmidlet kan tømmes helt inn i tanken.
- Eluere nøytrale lipider ved å tilsette 5 ml kloroform til hver kolonne. Tillat løsemiddel kan tømmes helt inn i tanken.
- Eluere glykolipider ved tilsetning av 5 ml aceton til hver kolonne. Tillat løsemiddel kan tømmes helt inn i oppsamlingstanken.
- Fjern kolonne stå fra tank og avløp tank med vakuum apparat. Sett rack med rene og merket sentrifugerør i tanken. Bytt kolonne stå på tanken; merket kolonne ovenfor bør være på linje med merket centrifuge tube nedenfor.
- Eluere fosfolipider til sentrifugerør ved tilsetning av 5 ml metanol for hver kolonne. Vent til SPE kolonner for å tørke ut i avtrekksskap før du kaster dem. Tørre ned fosfolipid fraksjoner ved romtemperatur under N2 komprimert.
- Rydd rør med N 2. Skru på PTFE-lined cap og lagre prøvene i fryseren ved -20 ºC innpakket i aluminiumsfolie (wrap i grupper i stedet for enkeltvis) til den er klar til å gå videre til trinn tre.
- Lipid metylering (trinn 3).
- Slå på varmt vannbad satt til 37 ºC. Forbered 1M eddiksyre (hvis det ikke allerede gjort) ved oppløsning av 57,1 ml iseddik i 1000 ml dH 2 O ved hjelp av en 1000 ml målekolbe. Denne løsningen kan lagres ved romtemperatur i opp til tre måneder. .
- Forbered batch av metanolisk KOH. Fremstille 0,2 M KOH-løsning ved oppløsning av 0,45 g KOH i 40 ml metanol. Juster volumet av KOH og metanol i henhold til ennticipated batch størrelse i trinn 3. Forbered denne løsningen daglig; må ikke oppbevares for lengre perioder.
- Fjerne prøver (i sentrifugerør som er lagret etter trinn 2) fra fryseren og tillate prøvene å komme til romtemperatur. Tilsett 0,5 ml kloroform og 0,5 ml methanol til hver prøve, etterfulgt av 1,0 ml metanolisk KOH. Cap rør tett med PTFE-lined cap. Swirl å blande.
- Plasser forseglede prøver i 37 ºC bad i 30 min. Sørge for at vannivået er et minimum på 1-2 mm over nivået av prøvevæsken. Ta ut og la prøver å kjøle seg ned. Mens prøvene er i vannbad, merke små glassflasker med prøve-IDer (10 ml hetteglass med PTFE-lined cap).
- Tilsett 2,0 ml heksan til hver prøve og virvel. Deretter legger 0,2 ml 1,0 M eddiksyre til hver prøve og virvel for å blande igjen; faseseparasjon skal bli synlig.
- Tilsett 2,0 ml dH 2 O til hver prøve for å bryte fase. Vortex prøver for 30 sek. Deretter sentrifugeres prøvene ved 226 xg i 2 min.
- Ved hjelp avkort Pasteur pipette overføre toppfasen til å rydde merket 10 ml hetteglass. Vær forsiktig med å overføre noen av de lavere (vandige) fase.
- Tilsett 2,0 ml heksan til hver prøve sentrifugerør og virvel. Vortex prøver for 30 sek. Deretter sentrifugeres prøvene ved 226 xg i 2 min.
- Ved hjelp av kort Pasteur pipette, igjen legge til toppfasen til det merkede 10 mL hetteglass.
- Fordamp løsningsmidlet i stemplet-10 mL hetteglass ved romtemperatur under N2. Skru på PTFE-lined cap og lagre prøvene i fryseren ved -20 ºC innpakket i aluminiumsfolie (wrap i grupper i stedet for enkeltvis) til den er klar til å fortsette med GC-analyse. Husk å merke alle prøvene.
- Gasskromatograf (GC) analyse
MERK: Identifikasjon og kvantifisering av de individuelle PLFAs oppnås ved hjelp av en GC koplet til enten en FID eller en MS-detektor. Mens instruksjonene nedenfor er for GC-FID, ville prøveopparbeidelse være gyldig for GC-MS som well. Et eksempel oppsett for en GC-FID system ville inkludere en 25 m × 0,2 mm × 0,33 mikrometer (5% fenyl) -methylpolysiloxane kolonne med følgende temperatur protokoll: innledende temperatur 190 ºC, rampe 10 ºC / min til 285 ºC hold 9,5 min, rampe 60 ºC / min til 310 ºC, holder 0,42 min 31.- Klargjør GC intern standard (ISTD) ved å tilsette en dråpe MeC10: 0 (metyl decanoate) til 100 ml heksan (rekord lagt vekt på 0,1 mg). Slå på gasser til GC og deretter slå på GC. Sørge for at H2, N2 og luftsylindre er åpne, og at det er tilstrekkelig gass til å kjøre analyse (H 2 bør aldri bli lavere enn 500 psi).
- Kontroller at betingelsene for en god kalibrerings blir møtt ved å kjøre kalibreringsstandarder som inneholder en blanding av fettsyrer, etterfulgt av en heksan blank. Identiteten til den enkelte fettsyrer kan tildeles manuelt basert på sammenligninger med retensjonstider innhentet for standarder, eller kan dette være automatically tildelt bruker kommersielt tilgjengelige programvare 31. I alle tilfeller kan utvetydig identifikasjon oppnås ved hjelp av en MS-detektor 2.
MERK: Flere tegn på en god kalibrering har flatskjerm baseline og ingen forurensning i heksan skylling. - Oppløs hver PLFA prøve rest (som inneholdes i 10 mL hetteglass fra lipid-metylering trinn 3) i 150 ul av den ISTD oppløsningen og overfør til GC ampulle (alternativt bruke 50 til 75 ul hvis prøven reaksjon er forventet å være svakt, slik som i meget sandbunn).
- Sett prøven injeksjonsvolumet til 2 pl. Sett FID temperaturen til 300 ºC. Kjøre prøvene ved hjelp av en innløpstemperatur på 250 ° C, med H-2 som bæregass (strømningshastighet 1,3 ml / min) og et delingsforhold på 30: 1.
Representative Results
Fettsyrer er betegnet som X: YωZ, hvor X betegner antallet av karbonatomer, Y representerer antall dobbeltbindinger, og Z angir posisjonen til den første dobbeltbinding fra den alifatiske (ω) enden av molekylet. Suffiksene "c" og "t" angir cis- og trans-geometriske isomerer. Den prefikser og suffikser 'a' og 'i' refererer til anteiso og iso forgrening og Meg og OH spesifisere metylgrupper og hydroksylgrupper, henholdsvis.
Post-GC løp, sjekk at prøvene mottatt tilstrekkelig ISTD ved å se på 10: 0 peak. Sjekk også responsen fra GC standarder, dvs. de ampuller inneholdende heksan tilsatt ISTD løsning; disse skal ikke ha noen andre topper. Intern standard svar bør være lik i alle løyper.
Figur 1 viser en representative prøvekjøringen. Den store heksan Løsningsmidlet topp karakteristisk vises ved en retensjonstid (RT) rundt 1,8 min. Den ISTD standard peak (C10: 0) vises på en RT på 3,4 min, mens C19: 0 har en RT på 16,2 min. GC-analyse separerer de PLFAs basert på deres kjedelengde, med lengre kjeder eluering langsommere; for eksempel, C18: 0 eluerer ved 14,4 min mens C16: 0 eluerer ved 10,8 min. I tillegg kan denne analytisk protokollen separere PLFAs basert på deres grad av umettethet og plasseringen av deres dobbeltbinding; for eksempel, C18: 0 eluerer ved 14,4 min, mens C18: 1 9c, og C18: 1 7c eluerte ved 14,0 og 14,1 min, henholdsvis (figur 1). Til slutt kan PLFAs av lignende kjedelengde og metning, men forskjellig forgrening konfigurasjon (anteiso versus iso) skilles; for eksempel, C15: 0i og C15: 0a eluerte ved 8,6 og 8,7 min, henholdsvis (figur 1).
Områdene av de forskjellige GC toppene kan være importet til et regneark for ytterligere å behandle gasskromatografi informasjon. Hver identifiserte PLFA kvantifiseres (nmol g -1 tørr jord) ved hjelp av følgende ligning:
hvor F er en justeringsfaktor som tar hensyn til FID-selektivitet og molariteten forskjellene mellom fettsyrer 32, er areaPLFA topparealet for hver identifiserte PLFA, areaC10: 0 er topparealet for ISTD (MeC10: 0), C10: 0 std tilsettes er den mengden av ISTD (nmol) tilsatt til hver prøve før GC løp, forholdet (C19: 0 std tilsatt / C19: 0-prøve) svarer til utvinning av PC-en (C19: 0 / C19: O) surrogat standard, og prøvevekten er mengden av ovnstørket jord (g) tilsettes til den opprinnelige prøven sentrifugerør og brukes til å trekke PLFAs.
MERK: Arealene under different toppene er uttrykt som topparealene, reaksjon eller respons% avhengig av GC-systemet. Innenfor området som er relevant for jord PLFA karakterisering, kan områder antas å være lineært proporsjonal med vekten av fettsyrer; Alternativt kan små korrigeringsfaktorene brukes til å gjøre rede for FID selektivitet 32. I tillegg, fordi resultatene blir initielt uttrykt på en vektprosentbasis, må de være normalisert for å gi molare mengder. Justering for molaritet forskjeller oppnås ved å ta hensyn til molekylvektene til de individuelle fettsyrer; publiserte tabeller 32 og kommersiell programvare 31 er også tilgjengelig for å hjelpe når normalisering for molaritet.
Mengden av ISTD (nmol) tilsatt til hver prøve kan videre beregnes som:
C10: 0std lagt = [ISTD] × V (STD lagt til)
[ISTD] er den konsentrasjon (nmol l -1) av MeC10: 0 (metyl- dekanoat) oppløst i heksan (se trinn 3.4.1), og V (STD tilsatt) er volumet (L) av klare for ISTD oppløsning satt til hver prøve før GC løp (dvs. 150 ul i henhold til trinn 3.4.4).
Mengden av C19: 0 (nmol) som er tilstede i hver prøve i løpet av GC-analyse tilsvarer:
hvor areaC19: 0 er den topparealet for C19: O, mens den tilsvarende mengde av C19: 0 (nmol) tilsatt til hver prøve ved begynnelsen av den PLFA utvinning metoden (jfr trinn 3.1.3) er:
hvor [19: 0] Std (mg L -1 (19: 0 std tilsatt) blir volumet av klare surrogat standard tilsatt til hver prøve ved begynnelsen av PLFA utvinning metode (se trinn 3.1.3), M 19: 0 er molekylvekten av 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (PC (19: 0/19: 0)).
NB: Et mol av C19: 0 nonadecanoate surrogat standard utbytter to mol av C19: 0 Følgende metylering trinnet, mens C10: 0-standard ble tilsatt etter metylering.
De følgende PLFAs vanligvis ekskluderes fra analysen av jord mikrobielle samfunn: i) PLFAs som er <14 C og> 20 C i lengde, og ii) PLFAs med mindre enn 0,5% av total i toppområdet. Når disse PLFAs har blitt utelukket, kan svarene fra alle de gjenværende PLFAs summeres for å oppnå den totale PLFA biomass (nmol g -1 av tørr jord). Univariat analyse av PLFA data (f.eks ANOVA, følgende datatransformasjon som er hensiktsmessig for å oppfylle forutsetningene for testen som skal utføres) kan brukes til å sammenligne total PLFA biomasse og / eller PLFA biomasse av utvalgte grupper blant eksempel grupper / behandlinger. For eksempel, figur 2 viser resultater for den relative fordeling av forskjellige PLFA grupper, for eksempel rettkjedet mettet PLFAs, mettet PLFAs med enten midt i kjeden (10-metyl) eller terminalforgrening, og mono- eller flerumettede PLFAs, samt summen av totale PLFAs (nmol g -1 tørr jord). I dette eksempelet, i en alder av trærne (som reduserer fra Site 1 til Site 3) er sett til å påvirke både totalt PLFAs og den relative fordelingen av de ulike PLFA grupper.
For å evaluere generelle mønstre i PLFA sammensetningen blant prøvene, kan multivariat analyse av alle PLFAs være conducted 33. De PLFA data må bli forvandlet som nødvendig før det valgte multivariat analyse for å møte de forutsetninger av den statistiske testen og problemstillingen tas opp, for eksempel, er en Hellinger transformasjon ofte brukt til å relativisere dataene. Figur 3 viser resultatene fra en ikke -metric flerdimensjonale skalering (NMDS) ordinasjon av de samme dataene som ble brukt i figur 2; NMDS er en ikke-parametrisk, multivariat teknikk som produserer 2- eller 3-dimensjonale posisjonering av datapunkter basert på likhet i vurdering score mellom prøvene.
Figur 1. Representative GC-FID-kromatogram. En prøve erholdt fra et dyrket Brown Chernozemic jord ble benyttet i denne analysen. Retensjonstider og tilsvarende PLFAs (i parentes) og deres topparealet (pA) enre angitt på figuren for representative topper. For klarhet, er ikke alle toppene er angitt på figuren, selv om denne prøven ga 33 identifiserte PLFAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Relativ mengde av seks forskjellige klasser av PLFAs (% av total PLFAs), og total PLFA biomasse (nmol g -1 av tørr jord). Prøver fra skog Luvisolic jord ble anvendt for denne analysen. Resultatene indikerer større totale PLFAs for jord på nettstedet 1, som er plassert under eldre trær (> 50 år), etterfulgt av de mellomliggende-alderen (25 år) trær (Side 2), og til slutt de yngste (10 år) trær ( Site 3). Relativt mer mettede PLFAs er til stede på de yngstestedet, mens flere umettede PLFAs er til stede på det eldste området. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ikke-metrisk flerdimensjonal skalering (NMDS) samordning av PLFAs (som% av total PLFAs data) for aksene 2 og 3 i en 3-dimensjonal oppløsning. Denne koordinering ble beregnet ved hjelp av de samme data som de som brukes for figur 2. Den yngste nettstedet (Site 3) skiller veldig klart fra de eldre to nettstedene (nettsteder 2 og 3), som viser overlapping i sin PLFA mikrobielle samfunn sammensetning. Mengden av variasjonen i PLFA fellesskap data forklares ved hver akse er inkludert i parentes; 72,5% av variasjonen er forklart av disse to aksene for en tre-dimensjonell NMDS løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
For å minimere og unngå feiltolkning av PLFA data, må nøye data screening gjøres fordi noen PLFAs som finnes i jord mikrobielle samfunn er også til stede i enkeltrom og flercellede eukaryote organismer, som for eksempel planterøttene, alger, og jord dyr. I tillegg trenger Archaea ikke inneholde PLFAs; i stedet blir archaeal membraner består av fosfolipid-eterlipider (PLELs). Følgelig kan PLFA protokollen ikke benyttes til å karakterisere archaeal miljøer i jord.
Knytte individuelle PLFAs til bestemte mikrobielle grupper bør utvises forsiktighet (se 2011 publikasjon av Frostegård og kolleger 34 for en utmerket diskusjon av noen av begrensningene til PLFA metoden). I stedet kan det være mer hensiktsmessig, slik det ble gjort i figur 2, for å gruppere PLFAs basert på deres kjemiske struktur, for eksempel, i) rettkjedede mettede PLFAs, ii) mettet med PLFAs mid-chaiN (10-metyl) forgrening, iii) terminalt-forgrenede mettede fettsyrer, iv) enumettet PLFAs, v) polyumettede PLFAs, og VI) hydroxy fettsyrer.
Prøve vekt må kanskje justeres basert på mengden av ekstraherbare PLFAs som finnes i en gitt jordprøve. Ved ikke å justere mengden jord ut i mindre mikrobielt aktive jordsmonn, brukerne er i fare for ikke å få et tilstrekkelig antall PLFA svar (topper) til nøyaktig representere den totale mikrobielle samfunn. I svært mikrobielt aktive jord med høye konsentrasjoner av PLFAs, brukerne er i fare for overbelastning av GC-kolonnen, og dermed hindre nøyaktig kvantifisering av PLFAs. I begge tilfeller, jordprøver må igjen analyseres for PLFAs. Et godt utgangspunkt er å legge til 0,5 g for økologiske jordprøver (for eksempel skog etasjer), og ca 3 g for mineraljordprøver. Siden mengden av ekstraherbare PLFAs er vanligvis korrelert til mengden av organisk karbon i en jord, prøve viight kan justeres på grunnlag av jord karboninnhold, for eksempel, kan en g mineraljordprøve være tilstrekkelig til å oppnå en god PLFA kvantifisering når karboninnholdet er 10-15%, mens> 5 g kan være nødvendig hvis karboninnholdet er 0,5 ≤ %. Det er alltid en god idé å gjøre en prøvetur med noen prøver å optimalisere prøve vekt før hele settet kjøres.
Vanlige feilsøkings strategier for PLFA protokollen og GC-analyse er som følger. Dersom GC kromatogrammet grunnlinjen er for høy, bør H 2 gassflaske endres. Dersom løsemiddel eller ISTD topper mangler fra kromatogrammet, kan det være et problem med prøveinjeksjon (f.eks plugget sprøyte, problem med autosampler, tom eller mangler hette feil med hette posisjonering). Dersom mer enn tre topper detekteres ved fremgangsmåten / blindprøve, er forurensning av emnet, og det er en stor sannsynlighet for at den samme forurensningen (e) vil være tilstede i prøven GC chromatograms. Finne kilden for forurensning (vanligvis vandige media), eller i det minste å sikre at toppene tilsvarende forurensningen er fjernet fra prøve kromatogrammene, og at disse toppene er ikke inkludert i noen statistisk analyse av dataene PLFA. Dessuten er det en god idé å kjøre heksan skyller mellom prøver ved mistanke om carry-over. Flere topper i heksan skylle vil indikere carry-over (dvs. tyngre komponenter som elueres fra forrige løp).
Lipider er spesielt utsatt for oksidasjon, og spesiell forsiktighet må utøves gjennom protokollen for å beskytte prøver fra luft og lys eksponering, for eksempel lagre dem i mørket og holde dem under nitrogen. Alle prøver og blanks må ha tilstrekkelig C19: 0 surrogat standard. En manglende C19: 0-topp, i enten prøver eller blanke, indikerer en dårlig gjenvinning eller et fullstendig tap av analytter. En reaksjon av C19: 0 i prøvene som er betydelig lavere enn den method / sample blanks indikerer et tap av analytter på et tidspunkt i PLFA metodikk. Når man står overfor dårlig C19: 0 utvinning, alle aspekter av fremgangsmåten må være nøye vurdert og undersøkt, inkludert den første ekstraksjonen, alle stadier av prøveoverføring, SPE ekstraksjon, fettsyre metylering, tørking, lagring og sample manipulasjon for å isolere trinn eller stadier hvor analytter er tapt. På den annen side kan det være at utvinning av enkelte jordprøver kan gi C19: 0, i hvilket tilfelle utvinning av surrogat standarden kan overvurderes. Mens du bruker to standarder ((PC (19: 0/19: 0) og MeC10: 0) er ikke et absolutt krav, vi har funnet dette å være svært nyttig når du trenger å feilsøke Så lenge MeC10. 0 svar er tilstrekkelig kan feilsøking fokusere på trappen før GC-analyse.
Som tidligere nevnt, må det utvises forsiktighet ved tolkning økologiske betydning og økosystem relasjoner basert utelukkende på biomarkører utleded fra PLFA data, fordi rene kulturstudier viser at isolerte bakteriestammer vil inneholde ulike kategorier av PLFAs. I stedet bør biomarkør PLFAs bli sett på som et nyttig tillegg i en pakke med bevis når du gjør bredere økologiske slutninger. I litteraturen har individuelle PLFAs blitt foreslått og anvendt som biomarkører for ulike mikrobielle grupper. Mettede PLFAs blir typisk brukt til å representere gram-positive bakterier og enumettede PLFA brukes for gram-negative bakterier. Anerkjente biomarkører for gram-negative bakterier omfatter enumettede fettsyrer med umetningen ved ω5 eller ω7 stilling, som for eksempel C16: 1ω7, C18: 1ω7, og C18: 1ω5. I tillegg kan syklopropyl- fettsyrer også være representativ for gram-negative bakterier 35. Derfor kan PLFAs fra gram-negative bakterier bli beregnet som er lik summen av A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Anerkjent biomarkører for gram-positive bakterier er terminalt forgrenet SAturated fettsyrer, iso-forgrenet slik som C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; eller anteiso-forgrenet, for eksempel C15: 0a og C17: 0a. Mettet PLFAs med middels kjede (10-metyl) forgrening, som for eksempel 10Me16: 0 og 10Me18: 0 er karakteristisk til stede i actinomycetes 36. Således kan PLFAs fra gram-positive bakterier bli beregnet som er lik summen av A: 0 (ISO, ANTEISO, 10-methyl).
Mange biomarkører forbundet med sopp PLFA er ofte flerumettede, men noen sopp biomarkører enumettet. For eksempel i form av sopp enumettet biomarkører, C16: 1ω5 har blitt identifisert som en indikator på arbuscular mykorrhizasoppene (AMF) 37, C18: 1ω9 er vanlig i saprophytic sopp, og ectomycorrhizae typisk inneholde C16: 1ω9. Tilstedeværelsen av di-umettede C18: 2ω6,9 forekommer ofte i forbindelse med C18: 1ω9 og korrelerer også godt med den sterol fungal ergosterol, noe som indikerer at C18: 2ω6,9 kan tilstrekkelig representere ectomycorrhizae og saprophytic sopp 38. Tri-umettede C18: 3ω 6,9,12 har også blitt brukt som en biomarkør for sopp 10; imidlertid, C18: kan 3ω6c finnes i andre eukaryote organismer som planter og alger, selv om det vanligvis ikke er funnet i bakterier. På sikt av jord protister, C20: har 4ω6c blitt anerkjent som en protoktister biomarkør 39, selv om, annet arbeid ikke klarte å oppdage C20: 4ω6c selv når levedyktige protoktister populasjoner ble bekreftet visuelt ved hjelp av lysmikroskopi 40.
Mange studier ta økologiske spørsmål knyttet til den generelle jord mikrobielle samfunn ved å benytte multivariate koordinering teknikker som PLFA data analyseverktøy. Ved bruk av denne tilnærmingen, har enkelte forfattere valgt for å utelukke sjeldne PLFAs fra datasettet ved å fjerne PLFAs som er til stede i mindre enn 5% av prøvene 4. Den normale mettede C16: 0 og C18: 0 er rikelig i alle jord mikroorganismer, inkludert prokaryoter og EUKaryotes. Derfor noen forskere velger å fjerne disse PLFAs før statistisk analyse på grunnlag av at de ikke kan være sensitive indikatorer på sammensetningen av jordsmonnet mikrobielle samfunnet - selv om C16: 0 og C18: 0 er fortsatt å bli inkludert når summere alle PLFAs for en indeks av mikrobiell biomasse. På sikt av statistiske analyser, mange forskere velger å gjennomføre en ikke-metriske multidimensjonal skalering (NMDS) ordinasjonen som denne teknikken er godt egnet til data som ikke kan bli normalfordelt 33. Ytterligere analyser knyttet til kategoriske variabler kan inkludere indikatorarter analyse, som kan relatere forekomsten av spesifikke PLFAs til kategoriske grupperinger og flere svar permutasjon prosedyrer (MRPP), som kan hjelpe bestemme likheter eller forskjeller mellom mikrobielle samfunn tildelt kategoriske grupper. I tillegg kan multivariate regresjons trær (MRT) være spesielt nyttig når påvirkningen av flere eksperimentelle variabler ellerbehandlinger må vurderes som potensielle forklaringsvariabler 5 (f.eks jord tekstur, fuktighet, gjenvinning alder).
Når etablert, er det PLFA protokollen en relativt enkel analysemetode som kan være svært nyttig når kvantifisere jord mikrobiell respons på miljøendringer og menneskeskapte forstyrrelser. Selv om molekylære teknikker som genetisk fingeravtrykk er bedre egnet til den detaljerte karakteriseringen av mikrobielle samfunn, presenterer den PLFA fremgangsmåten den fordelen av å gi kvantitativ informasjon om total mikrobiell biomasse 34. I vårt forskningslaboratorium, kan en person komfortabelt behandle et sett med 20 prøver over 4 dager, og vi har funnet protokollen presenteres her for å være en robust og reproduserbar teknikk for å vurdere jord biologisk kvalitet.
Kraften av PLFA fremgangsmåten kan sterkt forlenges ved å koble det til en stabil isotop-analyse 41, 42. Spesielt tilsetning of 13 C-merkede substrater til jord tillater kvantifisering av substratet inkorporering i jord mikroorganismer selv om isotopisk analyse av individuelle PLFAs 41. I tillegg vises denne metoden til å være en svært lovende verktøy for å belyse trofiske koblinger i jord næringskjeder 42.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
