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Developmental Biology

प्रतिलेखन कारक के साथ माउस भ्रूणीय Fibroblasts Reprogramming एक Hemogenic कार्यक्रम प्रेरित करने के लिए

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

Hematopoiesis एक जटिल विकास की प्रक्रिया जहां hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) hemogenic endothelium और ऐसे महाधमनी-gonad-मेसोनेफ्रॉस के रूप में भ्रूण hematopoietic साइटों नाल 1,2 की एक किस्म में उपस्थित बंद कली है। इन विट्रो में संस्कृति एचएससी करने में असमर्थता इस प्रक्रिया का गहराई से विश्लेषण करने के साथ ही इन अध्ययनों के नैदानिक आवेदन रोकता है। इस सीमा को नाकाम करने के लिए, पिछले अध्ययनों प्राप्त करने का प्रयास किया एचएससी नए सिरे से या तो स्टेम कोशिकाओं (पीएससी) 3, या दैहिक कोशिकाओं में प्रेरित plasticity और निर्देशित भेदभाव reprogramming मीडिया 4,5 का उपयोग करने का भेदभाव के माध्यम से। ये अध्ययन, हालांकि, चिकित्सकीय सुरक्षित engraftable कोशिकाओं को उत्पन्न नहीं है या निश्चित विकासात्मक hematopoiesis के अध्ययन की अनुमति "एक थाली में।"

उपन्यास काम यामानाका और उनके सहयोगियों द्वारा स्थापित प्रेरित उत्पन्न करने के लिए स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) दैहिक fibroblasts पी सेप्रतिलेखन कारक (टीएफ) reprogramming सेल भाग्य 6.7 में आधारित overexpression रणनीतियों के लिए एक रूपरेखा rovides। इस काम के कई क्षेत्रों में जांचकर्ताओं को प्रेरित किया है आसानी से प्राप्य दैहिक कोशिकाओं के टीएफ reprogramming के माध्यम से अपनी पसंद के प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए। यहाँ वर्णित reprogramming रणनीति के लक्ष्य माउस दैहिक मानव प्रणाली क्रम में रोगी विशेष fibroblasts reprogram करने के लिए इन निष्कर्षों का अनुवाद इन विट्रो में मानव hematopoiesis अध्ययन करने के लक्ष्य के साथ एक टीएफ आधारित reprogramming दृष्टिकोण का उपयोग कोशिकाओं और से एक hemogenic प्रक्रिया प्रेरित करने के लिए है रोग मॉडलिंग, दवा के परीक्षण के लिए रोगी विशेष रक्त उत्पादों उत्पन्न, और सेल प्रत्यारोपण स्टेम।

इस माउस प्रणाली में उचित reprogramming सुनिश्चित करने के लिए पहला कदम एक संवाददाता लाइन है कि CD34 अभिव्यक्ति, endothelial पूर्वज कोशिकाओं और एचएससी में एक ज्ञात मार्कर के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में सेवा करने के लिए विकसित किया गया था। ऐसा करने के लिए, huCD34-TTA और teto-H2BGFP ट्रांसजेनिक माउस लाइनों जी के लिए इस्तेमाल किया गयाenerate डबल ट्रांसजेनिक माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs), अब 34 / H2BGFP, कि CD34 प्रमोटर 8 के सक्रियण पर हरी प्रतिदीप्ति चिह्नित। यह hematopoietic विनिर्देश और विकास के दौरान आवश्यक होने के लिए जाना विभिन्न बिंदुओं पर TFS की एक किस्म की स्क्रीनिंग की अनुमति दी। (साहित्य खनन और GFP लेबल पहले से एचएससी बनाए रखने की रूपरेखा के माध्यम से निर्धारित वर्णित 34 / H2BGFP चूहों) PMX retrovial वैक्टर 18 TFS के साथ शुरू, 34 / H2BGFP MEFs stromal कोशिकाओं AFT024 एचएससी-समर्थन करने पर सभी कारकों और सुसंस्कृत साथ transduced थे। 34 / H2BGFP सक्रियण का पता लगाने के बाद, TFS बाद में reprogramming कॉकटेल से हटा दिया गया है जब तक रिपोर्टर सक्रियण के लिए TFS का इष्टतम सेट की पहचान की थी। इस प्रारंभिक स्क्रीन के बाद, कारकों एक DOX inducible pFUW वेक्टर व्यवस्था करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया TFS का चलाया हुआ अभिव्यक्ति की अनुमति है। चूंकि इन दोनों DOX चलाया सिस्टम असंगत हैं (34 / H2BGFP कोशिकाओं और pFUW inducible वैक्टर), से MEFsजंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों आवश्यक थे। यह भी hemogenesis आगे बढ़ना है और multilineage clonogenic पूर्वज बनाने के लिए अनुमति देने के लिए एक उपयुक्त microenvironment प्रदान करने के लिए जरूरी हो गया था।

वर्तमान hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में दैहिक कोशिकाओं reprogram करने के लिए (HSPCs) के प्रयास में पढ़ाई के सफलता 9-11 के विभिन्न स्तरों से मुलाकात की है। तिथि करने के लिए, दोनों माउस और दीर्घकालिक और स्वयं renewing repopulating की क्षमता के साथ मानव transplantable HSPCs की पीढ़ी TFS के एक ही सेट का उपयोग कर हासिल नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले से स्थापित की रणनीति का एक विस्तृत वर्णन reproducibly MEFs में hemogenesis प्रेरित करने के लिए प्रदान करते हैं। हम TFS (Gata2, Gfi1b, सीएफओ, और Etv6) की एक न्यूनतम सेट की शुरूआत का प्रदर्शन इन विट्रो में एक जटिल विकासात्मक कार्यक्रम है कि एक मंच है जिसके द्वारा विकासात्मक hematopoiesis और hematopoietic reprogramming के नैदानिक आवेदन आगे अध्ययन किया जा सकता 12 प्रदान करता है भड़काने के लिए सक्षम है।

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Protocol

आचार बयान: माउस सेल लाइनों माउंट सिनाई मेडिसिन में Icahn स्कूल के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का पालन प्राप्त कर रहे हैं, और किसी भी मेजबान संस्था के अनुपालन में किया जाना चाहिए।

1. माउस भ्रूण fibroblast (MEF) C57BL / 6 चूहों का अलगाव

  1. समय पर संभोग के 13 सेट करें। एक बार एक योनि प्लग कल्पना है, इस दिन 0.5 पर विचार करें।
  2. प्लग तारीख पर अलग खामियों को दूर महिलाओं और गर्भावस्था की पुष्टि करने के लिए डे 10-11 पर उन पर जाँच करें।
  3. डे 13.5-14.5 पर 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ के माध्यम से गर्भवती मादा चूहों euthanize।
  4. 70% इथेनॉल के साथ गर्भवती महिला के पेट लेना, बाँझ कैंची और midline नीचे संदंश के साथ उदर गुहा काटना, और शल्य चिकित्सा द्वारा भ्रूण 14 युक्त गर्भाशय सींग निकाल दें। जबकि शेष पेट ऊतक को काटने धीरे भ्रूण बाहर ले जाओ।
    नोट: प्रत्येक पक्ष पर 4 से 8 के बारे में भ्रूण की वसूली।
  5. गर्भाशय ज की जगहबाँझ ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 5-10 मिलीलीटर के साथ एक 10 सेमी डिश में भ्रूण युक्त orns।
  6. बाँझ कैंची और संदंश के साथ, गर्भाशय सींग के साथ एक चीरा थैलियों भ्रूण को ले जाने को अलग-थलग करने के लिए बनाते हैं। बाँझ के 5-10 मिलीलीटर के साथ एक नया 10 सेमी डिश के लिए थैलियों स्थानांतरण ठंडा पीबीएस और बर्फ पर जगह है।
  7. थैलियों के कुछ बाँझ ठंडा पीबीएस के 5-10 मिलीलीटर के साथ एक नया 10 सेमी डिश में रखें। बाँझ कैंची और संदंश धीरे खुले में कटौती की थैलियों आदेश भ्रूण भेदी से बचने के लिए (भी गहरी काटने के बिना) का उपयोग करना।
  8. गर्भनाल काटने से नाल से भ्रूण को अलग करें।
  9. एक नया 10 सेमी ठंडा पीबीएस के 5-10 मिलीग्राम से युक्त डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण और जबकि शेष विच्छेदन पूरा बर्फ पर छोड़ दें।
  10. बाँझ संदंश का उपयोग भ्रूण सिर काटना। ध्यान से नीचे बाँझ कैंची और संदंश, decapitated क्षेत्र से शुरू का उपयोग कर पेट को खोलने के लिए भ्रूण के midline काटा। स्थिति टी के नीचे संदंशवह आंत अंगों (दिल, जिगर सहित, और फेफड़ों) और उन्हें बाहर परिमार्जन 15।
  11. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार trypsin के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब करने के लिए कैंची और संदंश और हस्तांतरण का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में शेष ऊतक में कटौती।
  12. Pipet और 20-30 बार एक 10 मिलीलीटर pipet के साथ नीचे मिश्रण और ऊतकों को अलग कर देना।
  13. 45 मिनट के लिए ऊतक और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में trypsin मिश्रण सेते हैं, कभी कभी घूमता।
  14. Pipet और के बारे में 5 मिनट के लिए एक 10 मिलीलीटर pipet के साथ नीचे सामग्री मिश्रण करने के लिए।
  15. मानक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ (एफबीएस), की मात्रा 3x करने के लिए trypsinized कोशिकाओं जोड़ें 10 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), और 1 मिमी एल glutamine (एल भरमार) में 10 सेमी व्यंजन (~ 10 मिलीलीटर) और (2-4 दिन) मिला हुआ है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति। प्रति 10 सेमी पकवान 1-2 भ्रूण के बारे में संस्कृति।
    नोट: प्लेटें एक बार रुक कोशिकाओं मिला हुआ हैं। जमे हुए कोशिकाओं thawed और 2 अधिक बार passaged जा सकता है। प्रकोष्ठों वैकल्पिक रूप से हो सकता हैthawed होने के बाद 2 बार विभाजित ठंड से पहले, और उसके बाद एक बार फिर।

2. वायरल उत्पादन

  1. 10% FBS, 1% पी / एस, और 1% अभिकर्मक के लिए एल भरमार के साथ 10 मिलीलीटर DMEM के साथ 10 सेमी प्लेटों में 293T कोशिकाओं का विस्तार करें।
    1. 2 मिलीलीटर trypsin के साथ Trypsinize 293T कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 300 XG पर 15 मिलीलीटर ट्यूब, स्पिन में कोशिकाओं को इकट्ठा, और उचित प्लेट (प्रति 10 सेमी पकवान 10 मिलीलीटर)।
  2. 6 और लेपित 10 सेमी जिलेटिन में बीज (पीबीएस में 0.1% जिलेटिन) प्लेटों: 24 घंटा अभिकर्मक के लिए पहले, 293T कोशिकाओं 1 से मिला हुआ 10 सेमी की थाली विभाजित।
    नोट: वायरस प्रति 4 प्लेटों की आवश्यकता होगी।
    1. जिलेटिन में कोट प्लेटों के लिए, 10 सेमी प्लेटों के नीचे कोट करने के लिए 0.1% जिलेटिन समाधान के कम से कम 2 मिलीलीटर जोड़ें। कम से कम 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। महाप्राण बंद जिलेटिन प्लेटों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने से पहले।
  3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ने के लिए, 84 माइक्रोग्राम प्रति प्लाज्मिड (जैसे Gata2, Gfi1b, सीएफओ, या Etv6 (pFUW-teto vect में उप क्लोनया 16) या FUW-M2rtTA 17), 84 माइक्रोग्राम psPAX2, और 42 माइक्रोग्राम pMD2.G. पानी जोड़ें (एच 2 ओ) के लिए 2 मिलीलीटर मात्रा बनाने के लिए। प्रत्येक कारक के लिए एक ट्यूब तैयार (जैसे। Gata2, Gfi1b, सीएफओ, Etv6 और FUW-M2rtTA)।
  4. (Gata2, Gfi1b, सीएफओ, Etv6 या FUW-M2rtTA) 2 मिलीलीटर चुना जीन के 84 माइक्रोग्राम से बना मिश्रण युक्त प्रत्येक ट्यूब 2 एम 2 CaCl के 250 μl जोड़ें + 84 माइक्रोग्राम psPAX2 + 42 माइक्रोग्राम pMD2.G + एच 2 ओ ।
  5. एक पाश्चर pipet pipet सहायता में डाला प्रयोग, रिहाई 2.25 मिलीलीटर डीएनए + एच 2 ओ + 2 एम 2 CaCl मिश्रण में बुलबुले। के रूप में बुलबुले का उत्पादन किया जा रहा है, कांच pipet के खिलाफ एक P1000 की नोक जगह है और धीरे-धीरे बाहर निकालें 2 के 100 मिमी एन, एन-बीआईएस (2-hydroxyethyl) -2-aminoethane सल्फोनिक एसिड (BES) पाश्चर pipet 1 नीचे खारा मिलीलीटर एक समय में मिलीलीटर।
  6. कम से कम 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संस्कृति हुड में सभी ट्यूबों को सेते हैं।
    नोट: 4.25 मिलीलीटर मिश्रण (अब डीएनए + एच 2 ओ + 2 एम 2 CaCl
  7. मिश्रण incubates, महाप्राण मीडिया से दूर 293T प्लेटें और 10 मिलीलीटर DMEM + 10% FBS + 1 मिमी एल glutamine + 25 एनएम क्लोरोक्वीन जोड़ने के रूप में।
    नोट: यह मीडिया पी / एस शामिल नहीं है।
  8. ऊष्मायन के कम से कम 15 मिनट के बाद (या 293T कोशिकाओं पर मीडिया बदल रहा है जब तक), 4.25 मिलीग्राम डीएनए + एच 2 ओ + 2 एम 2 CaCl + BES खारा मिश्रण 293T कोशिकाओं के लिए वार छोड़ देता है, ट्यूब प्रति 4 सेल प्लेटों भर में समान रूप से वितरण जोड़ने (यानी थोड़ा प्रति प्लेट मिश्रण से अधिक 1 मिलीलीटर)।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों रातोंरात (हे / एन) सेते हैं।
  10. 24 घंटे बाद ऊष्मायन, 4 मिलीलीटर मानक DMEM (कदम 1.15 देखें) के साथ सभी प्लेटों पर मीडिया की जगह।
  11. अब से एक 32 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रखें।
  12. 24 घंटा 2.10 कदम के बाद, अलग 50 मिलीलीटर ट्यूब में मीडिया इकट्ठा। मानक DMEM के 4 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक थाली से एकत्र मीडिया बदलें।
    नोट: एकत्र मीडिया के 16 मिलीलीटर में प्रारंभिक ट्यूब मिश्रण परिणामों के अनुसार 4 प्लेटें।
    1. एfter ऊष्मायन के 12 घंटा, वही 50 मिलीलीटर ट्यूब में फिर से मीडिया को इकट्ठा करने और मानक DMEM के एक और 4 मिलीलीटर के साथ बदलें।
    2. ऊष्मायन के 12 घंटे के बाद, मीडिया को इकट्ठा करने और एक ही 50 मिलीलीटर ट्यूबों को जोड़ने।
      नोट: प्रत्येक ट्यूब अब वायरस युक्त मीडिया के बारे में 48 मिलीलीटर शामिल करना चाहिए।
  13. 0.45 माइक्रोन कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर के माध्यम से एकत्र वायरस, पहले फिल्टर एकत्र मीडिया ध्यान केंद्रित।
  14. फ़िल्टर मीडिया वायरल एकाग्रता अपकेंद्रित्र ट्यूब (एक समय में लगभग 16 मिलीलीटर) में वायरस युक्त डालो।
  15. 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर स्पिन और प्रवाह के माध्यम से हटा दें।
    ध्यान दें: केंद्रित मीडिया और वायरस की एक छोटी मात्रा फिल्टर में दिखाई जाएगी।
  16. केंद्रित मीडिया + वायरस फिल्टर में शेष मात्रा के लिए फ़िल्टर वायरस युक्त मीडिया के एक और 16 मिलीलीटर जोड़ें और inverting ट्यूब द्वारा मिश्रण।
  17. स्पिन ट्यूब फिर 25 मिनट और त्यागने के माध्यम से प्रवाह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर।
  18. शेष फ़िल्टर जोड़ेकेंद्रित मीडिया + वायरस की मात्रा के संग्रह फिल्टर में छोड़ दिया और inverting ट्यूब द्वारा मिश्रण।
  19. (फिल्टर में मात्रा पर निर्भर करता है) 10-20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बार फिर 4000 XG पर स्पिन और यह सुनिश्चित करें कि केंद्रित मीडिया + वायरस फिल्टर में छोड़ दिया की शेष मात्रा के बारे में 1 मिलीलीटर है। केंद्रित मीडिया + वायरस के एक से अधिक 1 मिलीलीटर फिल्टर में रहता है, 1 मिनट के लिए 4000 XG पर फिर से स्पिन और दोहराने 1 मिलीलीटर फिल्टर में छोड़ दिया है जब तक।
  20. अशेष 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में केंद्रित वायरस के 200 μl और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज या तुरंत का उपयोग करें।

3. MEF Reprogramming

  1. प्री-कोट 6 पीबीएस अच्छी तरह से प्रति 0.1% जिलेटिन के 0.5 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्लेटों, यह सुनिश्चित करना है कि जिलेटिन अच्छी तरह से पूरे क्षेत्र को शामिल किया गया है। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और कम से कम 20 मिनट के लिए सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, प्लेटों को हटाने और जिलेटिन aspirate।
  2. अच्छी तरह से प्रति 25,000 कोशिकाओं के घनत्व पर मानक DMEM के साथ प्लेट MEFs (150,000 कोशिकाओंप्रति 6 अच्छी तरह से थाली) gelatinized 6 अच्छी तरह से प्लेट (ओं) 3.1 कदम से पर और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. 50 μl M2rtTA मिश्रण और शेष 50 μl Gata2, Gfi1b, सीएफओ, और Etv6 का एक मिश्रण (12.5 μl प्रत्येक) द्वारा एक 100 μl वायरस कॉकटेल तैयार करें।
  4. MEFs से महाप्राण मीडिया और 8 माइक्रोग्राम / एमएल hexadimethrine ब्रोमाइड के साथ 2 एमएल मानक DMEM जोड़ें।
  5. वायरस कॉकटेल के 15 μl के साथ MEF प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से transduce और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
    नोट: इस reprogramming प्रक्रिया के दिन 0 है।
  6. दिन 1 पर, ऊष्मायन के 16-20 घंटे के बाद, 2 मिलीलीटर ताजा मानक DMEM 1 माइक्रोग्राम साथ / एमएल DOX प्रति अच्छी तरह से पूरक के साथ मीडिया की जगह।
  7. Hydrocortisone (10 -6 एम), 100 एनजी / एमएल स्टेम सेल कारक (एससीएफ), 100 एनजी / एमएल एफएमएस संबंधित tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), 20 एनजी / एमएल इंटरल्यूकिन 3 (IL- के साथ पूरक hematopoietic संस्कृति मीडिया तैयार 3), 20 एनजी / एमएल इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), और 1 माइक्रोग्राम / एमएल DOX।
  8. 4 दिन aspirat परई अच्छी तरह से प्रत्येक से मीडिया और अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  9. महाप्राण पीबीएस, अच्छी तरह से प्रति 0.05% trypsin के 1 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं को अलग कर देना और कोशिकाओं को इकट्ठा।
  10. कोशिकाओं 3.7 चरण में वर्णित hematopoietic मीडिया के 12 मिलीलीटर में 5 मिनट, resuspend के लिए 300 XG पर एक hemocytometer के साथ गणना, स्पिन और 0.1% जिलेटिन लेपित प्लेटों पर प्रति 6 अच्छी तरह से थाली 60,000 कोशिकाओं प्लेट (2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से, 10,000 कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति )।
  11. (35 से 36 दिन) संस्कृति की अवधि के लिए हर 6 दिनों ताजा पूरक hematopoietic संस्कृति मीडिया के साथ मीडिया बदलें।
  12. Hemogenic endothelial या एचएससी की तरह मार्करों और जीन अभिव्यक्ति के अधिग्रहण की पुष्टि करने के इम्युनो-धुंधला 12, FACS विश्लेषण 8,12, QRT- पीसीआर 12, और mRNA अनुक्रमण 12 के माध्यम से या तो मध्यवर्ती कोशिकाओं या उभरते hematopoietic कोशिकाओं की तरह का विश्लेषण।

4. अपरा एकत्रीकरण और कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) Methylcellulose में Assays

  1. गर्भवती सी 5 से गर्भनालों काटना7BL / 6 चूहों के रूप में पहले E12.5 में 18 में वर्णित है और बर्फ पर ऊतक रहते हैं।
  2. नाल हदबंदी 19 प्रारंभ करने के लिए, अपरा ऊतक 2-5 0.2 मिलीलीटर% collagenase प्रकार में मैं पीबीएस में 20% FBS के साथ धोने और यंत्रवत् एक 18G सुई सुई के माध्यम से नाल और पीबीएस passaging द्वारा एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में फिट साथ अलग कर देना कम से कम 3 बार।
  3. यांत्रिक हदबंदी के बाद, 1.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर collagenase समाधान के 2-5 मिलीलीटर में अपरा कोशिकाओं रहते हैं।
  4. 20-25 ग्राम सुई के माध्यम से पारित होने कोशिकाओं 5 मिलीलीटर सीरिंज पर कई बार फिट आगे यंत्रवत् अपरा कोशिकाओं को अलग कर देना।
  5. 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से एकल कक्ष निलंबन फ़िल्टर।
  6. एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और mitotic निष्क्रियता 20 के लिए 2,000 cGy पर चमकाना।
  7. एक 10 सेमी के लिए 100 एनजी / एमएल एससीएफ, 100 एनजी / एमएल Flt3L, 20 एनजी / एमएल आईएल -3, 20 एनजी / एमएल आईएल -6, और 10 एनजी / एमएल thrombopoietin (टीपीओ) के साथ पूरक hematopoietic संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें पकवान।
    नोट: DOX इस स्तर पर की आवश्यकता नहीं है।
  8. डिश में hematopoietic संस्कृति मीडिया पर सीधे एक 0.65 माइक्रोन फिल्टर की जगह, यह एक तरल गैस इंटरफ़ेस बनाने और पकवान अलग सेट करने के लिए फ्लोट करने की इजाजत दी।
  9. दिन 25 transduced MEFs (3.11 कदम से प्राप्त) कदम 3.8-3.10 में वर्णित के रूप में अलग कर देना और 4.6 कदम से अपरा समुच्चय के 167,000 कोशिकाओं के साथ transduced MEFs के 33,000 मिश्रण (1: 6 अनुपात)।
  10. 300 x जी 5 मिनट के लिए एक समग्र 18,21, पहले MEF नीचे और अपरा सेल मिश्रण कदम 4.9 से स्पिन उत्पन्न करने के लिए। मीडिया Aspirate और एक P200 पिपेट का उपयोग मानक DMEM के 30-50 μl में pelleted कोशिकाओं resuspend, 200 μl nonbevelled विंदुक टिप में एकल कक्ष निलंबन ड्राइंग।
  11. आयल फिल्म के साथ विंदुक टिप रोक देना। अवरुद्ध टिप एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और नीचे 5 मिनट के लिए टिप के कवर अंत में 300 XG पर तो एक गोली रूपों स्पिन।
  12. ध्यान से 15 मिलीलीटर ट्यूब और जगह से टिप हटायेP200 पिपेट के अंत पर टिप। आयल फिल्म त्यागें और कदम 4.8 से चल फिल्टर पर सेल गोली बाहर निकालना।
    नोट: प्लेट फिल्टर प्रति ज्यादा से ज्यादा 3 समुच्चय।
  13. संस्कृति 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस में 4-5 दिनों के लिए चल 0.65 माइक्रोन फिल्टर पर समुच्चय।
  14. एक सेल खुरचनी के साथ समुच्चय (फिल्टर प्रति ज्यादा से ज्यादा 3) लीजिए उन्हें गठबंधन है, और 0.2% collagenase के साथ पचा, एक ही प्रोटोकॉल कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए पूरे गर्भनालों के साथ किया जाता है (4.2-4.5 कदम) के बाद।
  15. हदबंदी के बाद, समुच्चय धोने पीबीएस के 2-5 मिलीलीटर के साथ 5% FBS के साथ पूरक और 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन।
  16. FBS, पी / एस, या एल भरमार बिना DMEM के 500 μl में समुच्चय Resuspend। इस 500 μl मेजबान ले लो और 3 मिलीग्राम 1% methylcellulose 10 एनजी टीपीओ का / एमएल, ध्यान से बुलबुले के गठन से बचने के साथ पूरक मीडिया में जोड़ें। के लिए 3 35 x 10 मिमी गैर इलाज संस्कृति बर्तन में इस मिश्रण की प्लेट बराबर मात्राCFU 12 assays।
  17. एक नियंत्रण के रूप में, संस्कृति के रूप में कदम 4.7-4.16 में ऊपर वर्णित CFU assays में 4-5 दिन और जगह reprogrammed MEFs में मिश्रण के बिना अपरा समुच्चय किरणित।
    नोट: ये समुच्चय अकेले कालोनियों के रूप में नहीं है।
  18. मैन्युअल 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के 10-14 दिनों के बाद खुर्दबीन के नीचे hematopoietic कालोनियों गणना।
  19. Cytospin 22 एकल कक्षों के रूपात्मक phenotype दिखाने के लिए कालोनियों उठाया।

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Representative Results

Hematopoiesis एक जटिल विकास की प्रक्रिया है कि विभिन्न भ्रूण साइटों में शुरू होता है। Hemogenic endothelial कोशिकाओं इन साइटों में रहते हैं और सेल नवोदित 23 के माध्यम से एचएससी को जन्म दे। इस प्रक्रिया को वर्तमान में, संस्कृति में एचएससी या hematopoietic व्यापारियों रखने, एक पद्धति की जरूरत महसूस किसी भी तरह इन विट्रो में इन कोशिकाओं को प्राप्त करने से reproduced नहीं किया जा सकता है या तो HSPC विस्तार पूर्व vivo या पीढ़ी नए सिरे से। इस प्रोटोकॉल हमारे उपन्यास प्रौद्योगिकी है कि MEFs में टीएफ overexpression के माध्यम से इन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए प्रयास को दर्शाता है।

चित्रा 1 कुल मिलाकर reprogramming प्रक्रिया को दिखाता है। MEF पीढ़ी और विस्तार के बाद, कोशिकाओं Gata2, Gfi1b, सीएफओ, Etv6 और FUW-M2rtTA साथ transduced रहे हैं। DOX करने के लिए विस्तार और जोखिम ट्रांस्जीन सक्रियण शुरू करने के 3 दिन बाद, कोशिकाओं अलग और 4 दिन पर विभाजित कर रहे हैं जिलेटिन लेपित प्लेटों पर औरपूरक hematopoietic मीडिया में हो।

reprogramming मीडिया के साथ लंबे समय तक संस्कृति पोस्ट पारगमन के बाद, कोशिकाओं स्पष्ट morphological परिवर्तन को अपनाने। दिवस पर 20 कोशिकाओं endothelial आकृति विज्ञान MEFs से अलग अपनाने। डे को आगे संस्कृति 35 परिणाम कई दौर hematopoietic-तरह endothelial की तरह मध्यवर्ती और दाग hematopoietic मार्कर Sca1 और CD45 (चित्रा 2) के लिए सकारात्मक (जब 34 / H2BGFP MEFs का उपयोग) है कि GFP + कर रहे हैं से उभरते कोशिकाओं में। यह धुंधला हो जाना यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं hemogenic प्रेरण के विचारोत्तेजक प्ररूपी मार्कर लाभ। इसके अलावा संस्कृति CD45 व्यक्त करते हुए huCD34 रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को बनाए रखने की कोशिकाओं में यह परिणाम है। पर अपरा एकत्रीकरण संस्कृति कोशिकाओं clonogenic संभावित अपनाने के लिए और विभिन्न hematopoietic morphologies और विस्फोट की तरह कोशिकाओं (चित्रा 3) युक्त methylcellulose में कालोनियों उत्पन्न करते हैं।

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चित्रा 1: MEFs में hemogenic शामिल करने के लिए रणनीति। आरेख reprogramming प्रक्रिया और यह के भीतर हर कदम को दर्शाता हुआ। सामान्य reprogramming प्रक्रिया पहले MEF विस्तार, जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटों में उचित घनत्व में बंटवारे के द्वारा पीछा करना शामिल है। कोशिकाओं तो Gata2, Gfi1b, सीएफओ, Etv6, और FUW-M2rtTA का कॉकटेल के साथ transduced रहे हैं। प्रकोष्ठों मानक DMEM DOX के साथ पूरक के साथ आगे सुसंस्कृत हैं। दिवस पर 4 कोशिकाओं trypsinized और 6 अच्छी तरह प्लेटों में विभाजित कर रहे हैं। हर 6 दिनों मीडिया बदल रहा है और चुने हुए समय बिंदुओं पर कोशिकाओं FACS, CFU, या जीन अभिव्यक्ति assays से विश्लेषण किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: व्यापारियों से उभर hematopoietic कोशिकाओं की प्रेरण। Sca1 और CD45 के लिए दाग 34 / H2BGFP के लिए सकारात्मक कोशिकाओं एक hemogenic कार्यक्रम की प्रेरण प्रदर्शित करता है। (ए) इस छवि को CD45 और Sca1 के लिए दाग जबकि reprogrammed कोशिकाओं का एक अंतर्निहित brightfield छवि के साथ GFP fluorescing कोशिकाओं का एक मर्ज पता चलता है। फ्लैट सेल की आबादी का केवल एक सबसेट Sca1, एक endothelial / hemogenic मार्कर व्यक्त करता है, और केवल hematopoietic की तरह इन कोशिकाओं CD45, अखिल hematopoietic मार्कर के लिए लाल दाग से उभर कोशिकाओं गोल। (बी) इस छवि को स्पष्ट रूप से दिखा Sca1 + कोशिकाओं के साथ CD45 + कोशिकाओं के निकट सहयोग, brightfield छवि के बिना दाग और GFP फ्लोरोसेंट कोशिकाओं से पता चलता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3: CD45 + hematopoietic कोशिकाओं का सृजन। (ए) 34 / H2BGFP MEFs Gata2, Gfi1b, सीएफओ, और Etv6 साथ ट्रांसड्यूस के बारे में 12.7% + GFP CD45 + reprogramming के 35 दिनों के बाद कर रहे हैं। साफ माइलॉयड morphologies और विस्फोट की तरह कोशिकाओं एच ई धुंधला (बी) CD45 के cytospin + 10-14 दिनों के लिए methylcellulose में चढ़ाया हल कोशिकाओं के बाद निम्नलिखित देखा जा सकता है। यह reprogrammed कोशिकाओं है कि TFS के इस न्यूनतम सेट के साथ पारगमन के बाद hematopoietic समारोह को अपनाने का प्रतिरूप multilineage क्षमता को दर्शाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आसानी से प्राप्य दैहिक कोशिकाओं से पैदा HSPCs नए सिरे से संभावित करने के लिए इन विट्रो में hematopoiesis, और अवसर का अध्ययन करने के लिए मानव प्रणाली के लिए इस तकनीक लागू एक अनूठा तरीका प्रदान करता है। यह बात एक थाली में मानव hematologic बीमारी अध्ययन करने के लिए, साथ ही औषधि परीक्षण प्लेटफार्मों और जीन उपन्यास चिकित्सा या एचएससी प्रत्यारोपण के साथ कई बीमारियों का इलाज करने के लिए अवसर प्रदान करते हैं लक्षित कर एक नया उपकरण पैदा होंगे। क्षेत्र में, हाल के अध्ययनों से HSPCs नए सिरे से उत्पन्न करने की क्षमता पर विस्तार किया है, reprogramming प्रक्रिया के कई सुविधाओं के महत्व का प्रदर्शन है। ये (आदि साइटोकिन्स, छोटे अणुओं,) शुरू सेल आबादी और TF कॉकटेल की पसंद है, साथ ही साथ कैसे संस्कृति की स्थिति (सह-संस्कृति आला) और पूरकता काफी 24-26 reprogramming की दक्षता प्रभाव शामिल हैं। कई अध्ययनों के माध्यम से यात्रा के बिना मानव प्रणाली के लिए reprogramming प्रौद्योगिकी आवेदन कर रहे हैंएक pluripotent मध्यवर्ती, 27,28 एक अवांछनीय इन प्रक्रियाओं में कदम।

यहाँ एक प्रोटोकॉल है कि पहली जबकि pluripotency कारकों का इस्तेमाल करते हैं और pluripotent मध्यवर्ती के गठन से बचने के लिए एक विकास की प्रक्रिया के माध्यम से दैहिक कोशिकाओं से कोशिकाओं को एचएससी की तरह उत्पन्न करने के लिए किया गया है। उत्पन्न एचएससी कोशिकाओं की तरह पहले के माध्यम से यात्रा करने के लिए कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, एक विकास की प्रक्रिया के माध्यम से विकसित करने के लिए दिखाई देते हैं एक hemogenic endothelial मध्यवर्ती एक EHT के समान है। reprogramming endothelial की तरह मध्यवर्ती रूप है कि endothelial और hematopoietic जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल शामिल के दिन 20 पर। एचएससी कोशिकाओं की तरह दिन 35 पर इन मध्यवर्ती कोशिकाओं है कि कोशिका की सतह इम्युनो-phenotypes और जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल अत्यधिक एचएससी के समान होते हैं और CFU assays में erythroid और माइलॉयड कालोनियों का उत्पादन कर सकते से उभरने। यह पता चलता है कि, सबसे अन्य अध्ययनों के विपरीत, इस reprogramming प्रोटोकॉल इन विट्रो में एक जटिल विकास की प्रक्रिया का स्मरण दिलाता है, और पेर्म कर सकते हैंयह hematopoiesis और hematologic रोग प्रक्रियाओं है कि भ्रूण hematopoiesis शामिल के आगे के अध्ययन। इन अध्ययनों से कैसे इलाज के लिए और hematologic विकारों है कि मौजूद है, और कैसे यह अंत करने के लिए hematopoiesis हेरफेर करने के लिए की भीड़ का इलाज करने पर और अधिक अनुसंधान की अनुमति है। यह रोगी विशेष fibroblasts में एक hemogenic कार्यक्रम उत्प्रेरण विट्रो रोग मॉडल में स्थापित करने के लिए किया जा सकता है। इन मॉडलों के साथ, सामान्य और रोगग्रस्त hematopoiesis पतले विच्छेदित किया जा सकता है और अध्ययन किया है, साथ ही दवा स्क्रीन और जीन संपादन के अधीन ब्याज की बीमारी के साथ जुड़े / सुधारें hematopoietic दोष के इलाज के लिए।

माउस का प्रयोग इस fibroblasts reprogramming प्रक्रिया के विभिन्न लाभकारी गुणों का समर्थन करता है। fibroblasts खुद को, दाता चूहों से प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं सेल अधिग्रहण सरल बना रही है। मनुष्य के लिए इस तकनीक का अनुवाद इस प्रकार केवल मरीज त्वचा के नमूनों की जरूरत होगी, रोगी विशेष रक्त उत्पादों और बाद में सेल ते का अधिग्रहण कर रही हैhematologic की बीमारी के इलाज के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के डंक। इसके अतिरिक्त, fibroblasts बहुत epigenetically hematopoietic कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं, दोनों epigenetically दबाने fibroblast पहचान करने के लिए इस reprogramming प्रोटोकॉल में चुना TFS की क्षमता का प्रदर्शन, और भी शुरू कोशिकाओं 29,30 के epigenetic स्मृति बदलकर एक hemogenic कार्यक्रम भड़काने। प्रत्यारोपण के अध्ययन अभी तक, इन ली गई कोशिकाओं का पूरा multilineage engraftment समारोह का प्रदर्शन नहीं करते हालांकि देखकर यदि इन कारकों में एक hemogenic प्रोग्राम है कि मानव प्रणाली में पूरी तरह कार्यात्मक hematopoietic कोशिकाओं को उत्पन्न करता है महान ब्याज की हो जाएगा प्रेरित।

इस प्रोटोकॉल के भीतर कई कदम इस तरह के पारगमन के लिए पहले चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या और पारगमन के लिए इस्तेमाल वायरस की राशि के रूप में, reprogramming दौरान कठिनाई के मामले में संशोधित किया जा सकता है। इष्टतम परिणामों के छठी से पहले वर्णित मात्रा के साथ प्रति 6 अच्छी तरह से थाली (3.2 कदम) 150,000 कोशिकाओं का उपयोग करते देखे गएरस (कदम 3.3 और 3.5), लेकिन अधिक कोशिकाओं को वायरस के लिए जोखिम पर कोशिका मृत्यु के मामले में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी तरह, वायरस के छोटे संस्करणों सेल चाहिए मौत एक मुद्दा हो सकता है, के रूप में लंबे समय के reprogramming आय के रूप में के रूप में वर्णित है (जो FACS विश्लेषण, CFU assays, और जीन की रूपरेखा के माध्यम से जाँच की जा सकती है) का इस्तेमाल किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करना है कि कदम वायरस की 2.13-2.19 उपज उचित मात्रा में प्रोटोकॉल के बाकी की सफलता के लिए आवश्यक है। कदम 3.5-3.7 भी महत्वपूर्ण हैं, कोशिकाओं के रूप में सफल पारगमन इस hemogenic कार्यक्रम उत्प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है। transduced कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्रति DOX की उचित मात्रा में ट्रांसजीन (इस प्रकार बार-बार मीडिया में परिवर्तन की जरूरत महसूस) की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए लगातार और ताजा रखा जाना चाहिए। हालांकि बिल्कुल जरूरी नहीं है, अंधेरे में सेल संस्कृति DOX का उपयोग करते समय DOX समारोह के नुकसान को रोकने में मदद कर सकता है। पारगमन के बाद, कोशिकाओं को बारीकी से आकृति विज्ञान द्वारा माइक्रोस्कोप के तहत निगरानी की जानी चाहिए और (जैसे FACS और CFU assays के रूप में) विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों से यत्न सुनिश्चित करने के लिएuccessful वायरल पारगमन और reprogramming। Reprogrammed कोशिकाओं की उम्मीद के रूप में कई रूपात्मक परिवर्तन को अपनाने नहीं हो सकता है, जैसा कि पहले उल्लेख विश्लेषणात्मक तरीकों की आवश्यकता उचित reprogramming का सबसे अच्छा संकेतक के रूप में सेवा करने के लिए।

हाल के अध्ययनों से टीएफ कॉकटेल या शुरुआती सेल की आबादी 31-33 के रूप में इस तरह के fibroblasts Gata2 के रूप में इस reprogramming प्रोटोकॉल के विभिन्न सुविधाओं, का उपयोग किया है। इन तरीकों को भी reprogramming प्रक्रिया के दौरान विकास कार्यक्रमों के लिए प्रेरित करने के दिखाई देते हैं। अन्य रणनीतियों 9,10,25,26 reprogramming दौरान hematopoietic आला के महत्व को दिखाया गया है। सभी कारक है कि reprogramming में सहायता की पहचान प्रोटोकॉल है कि आसानी से प्राप्य रोगी विशेष कोशिकाओं से सदाशयी एचएससी उत्पन्न करता है विकसित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। सारांश में, यहाँ हम एक रणनीति के माध्यम से inducible Gata2, Gfi1b, सीएफओ, और माउस fibroblasts में एक प्रेरित विकास की प्रक्रिया से कोशिकाओं को एचएससी की तरह उत्पन्न करने का वर्णनEtv6 overexpression। इस तकनीक का मानव प्रणाली है, जहां अन्य प्रकाशित अध्ययन के साथ संयोजन में, रोगी विशेष रक्त उत्पादों की पीढ़ी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयुक्त अनुमति देगा करने के लिए अनुवाद किया जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

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References

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प्रतिलेखन कारक के साथ माउस भ्रूणीय Fibroblasts Reprogramming एक Hemogenic कार्यक्रम प्रेरित करने के लिए
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