Introduction
Trykkbelastning bærende vev så som leddbrusk eller mellomvirvelskiver består av heterogene vev regioner som er kritiske for både biomekanisk funksjon og passende mekanisk-transduksjon i vevet. Ikke bare er mobilnettet organisering og funksjon tydelig i ulike regioner, men de ekstracellulære matriser (ECM) er også variert i sammensetning og organisasjon. For eksempel, leddbrusk består av tre hovedsoner med varierende cellemorfologi, mekanisk funksjon, og ECM. Forskjeller i deres ECM fører til forskjellslastbærende ansvar; overfladiske laget er primært involvert i strekk respons å laste, mens de midtre og dype sonene er i hovedsak ansvarlig for respons på kompresjon en. Tilsvarende, i intervertebral skive, er et gel-lignende nucleus pulposus er omgitt av en lamellær ringrom fibrose og cellene i disse to forskjellige områder oppleve forskjellige typer av biofysiske stimuli2. I disse typer av vev, celler og den ekstracellulære matriser innenfor vev lag kommuniserer med hverandre som vevet gjennomgår og svarer til mekaniske krefter.
Gjentagelse av slike heterogene vev strukturer fortsatt en utfordring i tissue engineering og regenerativ medisin, og vår forståelse av deres biologiske betydningen er begrenset. Det er et behov for dyrking av plattformene for å analysere stratifiserte vev, så vel som ko-kulturer av forskjellige populasjoner av celler i en konstruksjon. I artikulært bruskvev engineering, har stillaset-mindre lagdelte konstruksjoner blitt konstruert ved å utnytte muligheten for sone kondrocytter til å avsette variert ECM å etterligne de forskjellige lag av dette vevet 3,4. Imidlertid lagdelte hydrogel-konstruksjonene gi en mulighet for å undersøke vekselvirkningen av forskjellige typer av cellepopulasjoner som mangler evnen til å danne en robust vev uavhengig av hverandre. For eksempel forskjellig popskrifter av stamceller kan brukes sammen dyrkes innenfor lagdelte konstruksjoner. Slike lag stillasene har blitt brukt med både chondrocytes og differensierende stamceller for bedre tissue engineering 5. Ikke bare kan forskjellige cellepopulasjoner ko-dyrket i et tilsvarende hydrogel lag, men en enkelt celletype kan også dyrkes i løpet av sjiktene som har blitt manipulert til å ha varierende stivhet eller biokjemisk innhold for å fremkalle forskjellige reaksjoner fra celler 6,7.
Mange forskjellige biomateriale hydrogeler har blitt brukt til lag cellepopulasjoner for bruskvev teknikk slik som de som benytter polyetylenglykol eller poly vinylalkohol-baser 7-9. Men alginat hydrogel er en av de enkleste biomaterialer som å lage lagdelte stillaser for å studere heterogene cellepopulasjoner i co-kultur. Mens agarose hydrogeler er også lett å forme, alginat hydrogel har den ekstra fordelen av å la enkelt erolation av celler fra 3-D-konstrukt for analyse av individuelle celler som har blitt beskrevet tidligere 10. I tidligere studier har bi-lag alginat hydrogeler blitt dannet i tynne ark og fra disse arkene, ble deler skiver (f.eks. Ved hjelp av en biopsi slag) for bestemte applikasjoner som for analyse av biokjemisk innhold eller grense skjær egenskaper 11,12. En annen fremgangsmåte for å danne tynne alginat ark er blitt beskrevet med potensial for lagdeling i flere lag, men likevel ville kreve endring av den hydrogel til bruk ved mekanisk testing 13.
Her presenterer vi en metode for reproduserbar skape bi-lag alginat hydrogel-plater til bruk i co-dyrking forskjellige populasjoner av celler. Dette alginat platen plattformen i besittelse av flere fordeler. Først og fremst, reproduserbar form og liten størrelse er rette for mekanisk stimulering av de innebygde celler uten å kreve en biopsi puNCH eller annen fysisk endring av hydrogelen for mange anvendelser. I tillegg forblir høy cellelevedyktighet under lagdeling prosessen, og etter geldannelse en klar separering av de to cellepopulasjoner i gelen er synlig uten innledende overlappende region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse til Dannelse av Alginat plater
- Fremstille en 4% (vekt / volum) alginatoppløsning i 1x Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning uten tilsetning av kalsiumklorid eller magnesiumklorid, og plasser i et 37 ° C vannbad. Konsentrasjoner av alginat oppløsningen kan variere, men til 1 - 4% (w / v) alginatløsninger anbefales.
- Bland alginatoppløsning i et forhold på 1: 1 med varm cellekulturmedier base (f.eks Dulbeccos modifiserte Eagle-medium.) For den ønskede celletype. Alginatet Konsentrasjonen er nå halvparten av den opprinnelige konsentrasjon, f.eks., 2% (vekt / volum). Steril alginat / media-løsning ved hjelp av sterile 0,2 mikrometer nylon sprøytefilter.
- Fremstille et bad av steril 102 mM kalsiumklorid dihydrat i sterilt vann med tilstrekkelig oppløsning til å senke formene (~ 200 - 300 ml).
- Samle sterile "gel dannelsen mold" (6 mm diameter x 3 mm høye sylindriske brønner i et tre i x 3 i aluminiumsplate, se
- Grovere filterpapir (blotter filterpapir) og cellen microsieve membran (10 um porestørrelse) for å størrelser av de øvre og nedre endeplater, og plassere dem i kalsiumkloridet badet inntil mettet, omtrent 1 min. Om ønsket, sterilisere den tykke filterpapir og microsieve membranen via autoklav eller ultrafiolett lys i 30 minutter før bruk.
- Sett opp en halv (nedre halvdel) av mold konstruksjon.
- Plasser følgende elementer oppå hverandre i følgende rekkefølge og jevnes med en steril spatel: stor gavl (3 x 3 tommer), tykk filterpapir, og deretter microsieve membran.
- Snu og trykk formen på en bunke med papirhåndklær for å sikre tap av overflødig kalsiumklorid løsning.
- Plasser "geldannelsen mugg" med de sylindriske brønner på toppen av cell microsieve membran og forsiktig feste formen sammen på to sider ved hjelp av bindemiddel klipp på venstre og høyre side. Sørg for å forlate nok plass til den øverste gavlen (1,5 x 3 tommer) for å dekke brønnene helt senere.
- Sette opp andre halvparten (den øverste halvdelen) av mold konstruksjon.
- Plasser følgende elementer oppå hverandre i følgende rekkefølge og jevnes: liten gavl, tykt filter papir, microsieve membran.
- Snu og trykk denne halvdelen av formen på en bunke med papirhåndklær for å sikre tap av overflødig kalsiumklorid løsning. Ikke fest denne halvparten av formen ved hjelp av bindemiddel klipp på denne tiden.
Merk: Når du bruker denne metodenfor å lage lag med ulike celletyper, sørg for å kultur to celletyper i parallell for lagdeling. Mesenchymale stamceller (MSC) sådd ut ved en celletetthet på 1 x 10 6 celler / ml vil bli brukt som et eksempel for den følgende protokoll. Celle nummer og platenummer kan skaleres for eksperimenter som trengs.
- En til to uker før innebygging, frø stamceller ved en celletetthet på 3000 - 5000 celler / cm 2 i 10 ml basale vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium, 10% fetalt bovint serum, 2% L-glutamin, 1 % ikke-essensielle aminosyrer, 1% Penicillin / streptomycin) i T-75 kolber.
- Fjern brukte media hver 2 - 3 dager, og erstatte med 10 ml basal vekstmedier til cellene er 80-90% sammenflytende.
- For å høste celler, fjerne brukt medium, og pipette 3 ml 1x Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning uten tilsetning av kalsiumklorid eller magnesiumklorid for å skylle cellene. Fjerne denne løsning pipette 3 ml 0,25% Prøvpsin-EDTA på celler som vokser i T-75 kolber, og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C. Etter celler har løftet fra tilhenger overflaten, legger 6 - 9 ml basal vekstmedier.
- Sentrifuger MSC ved 600 xg i 5 minutter ved romtemperatur, aspirer supernatanten, og re-suspen i 1 - 5 ml av basalvekstmedier. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer via datamaskinens instruksjoner.
- Fjern 1 x 10 6 celler fra det totale celle resuspensjon, sentrifuger ved hjelp av de samme betingelser, og aspirer supernatanten.
2. Dannelse av Cell Last Alginat Discs
- Re-suspen cellepelleten med 1 ml av det sterile alginat / media-løsning for å oppnå en celletetthet på 1 x 10 6 celler / ml. Den celle-alginat blandingen vil være homogent klart utseende når cellene er blandet i riktig måte.
- Pipetter 130 mL av celle-alginat blandingen i seks 6 mm diameter x 3 mm høye brønner i nedre halvdel av formenkonstruere dråpevis, for ikke å skape noen bobler. En svak konveks menisk bør være synlig over kanten av hver brønn.
- jevnes forsiktig den øverste halvdelen av formen konstruksjonen ved hjelp av en steril spatel og snu det, slik at cellen microsieve membranen er på toppen av brønnene. Sett formen bygge på toppen av brønnene, og pass på å dekke brønnene som inneholder cellen og alginat blandingen helt.
- Løft lastet mold konstruksjon og, mens du trykker hardt ned på midten, bindemiddel klipp de resterende to sider (topp og bunn) for å feste de øvre og nedre halvdelen av mold konstruksjon. De celle-alginat løsninger skal være forsvarlig plassert i brønnene på dette tidspunktet.
- Dypp festet mold konstruksjon i 102 mM kalsiumklorid bad, og pass på at hele konstruksjonen er under vann. Inkuber i cellekulturen hetten ved romtemperatur i 90 min.
- Ved slutten av den 90 min, fjerne mugg konstruksjonen fra 102 mM kalsiumkloridbad og plass på en bunke med papirhåndklær i cellekultur panseret. Fjern alle fire bindemiddel klipp og skille de to halvdelene av mold konstruksjon. Hydrogeler dannet i brønnene bør ikke ha noen bobler og bør fylle brønnene helt.
- Ved hjelp av en slikkepott, spore nøye kanten av brønnene inneholder hydrogeler å nøye løsne og kile ut hydrogeler. Etter fjerning av hydrogelene fra formen konstruksjonen, slipp hydrogelene direkte inn i et bad av 1x Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning med kalsiumklorid og magnesiumklorid. Dekk gels helt å vaske av overflødig kalsiumklorid løsning for 1-5 min.
- Overfør hydrogeler i basal vekstmedier løsning i ønsket fatet (f.eks., 6 brønners plater) som dekker de hydrogeler. Inkuberes i minst 1 time i cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 før de fortsetter til den lagdeling trinn.
Note: Hydrogeler inneholdende celler kan holdes icellekulturinkubator ubestemt tid ved denne gangen til lagdeling av geler med en annen cellepopulasjon er ønsket, forutsatt at medie endringer er utført hver 2 - 3 dager.
3. lagdeling av Alginat plater
- I løpet av den siste halvtimen av en time inkubasjon, samle og forberede sterile mugg og løsning for gløde gels.
- Klargjør "cutting formen" ved å feste en form som har brønner halvparten av høyden av "gel-dannelse mold" (6 mm diameter x 1,5 mm høye brønner i en 3 x 3 i aluminiumsplate) til en endeplate (3 x 3 i aluminiumsplate) ved hjelp av bindemiddel klipp på venstre og høyre side.
- Klargjør "annealing formen" ved å feste en form som er 3 mm større i diameter enn den "gel-dannelse mold" (9 mm diameter x 3 mm høye brønner i en 3 i x 3 i aluminiumsplate) til en endeplate (3 x 3 i aluminiumsplate) ved hjelp av bindemiddel klipp på venstre og høyre side.
- Forbered en løsning av100 mM natriumcitrat / 30 mM EDTA (natriumcitrat-dihydrat, etylendiamintetraeddiksyre-tetranatriumsalt-dihydrat) i sterilt vann.
- Fjern gels av ønskede cellepopulasjoner (i dette eksempelet, to plater med hMSCs) fra media i fatet, og legg inn i "cutting mold" brønner. Hver gel skal sitte tett inn i brønnene med halvparten av gelen som stikker ut over formen.
- Ved hjelp av en skalpell, skjære gelen langs overflaten av formen (dette vil kutte hydrogelen i to). Vend den øverste halvdelen av gel og plassere den i en åpen form også. Halvparten av gelen bør også passer tett inn i formen godt, men nå begge halv geler bør være høyden av formen med den kuttet indre overflate er synlig. Gjenta med andre gel.
Merk: Advarsel: Det er bare de indre snittflatene vil danne lag plater. Ved hjelp av de ytre overflater vil resultere i at halvdelene skille. Det er mistanke om at teksturen fra microsieve membranen overført til gel overflaten forhindrersuksess av glødeprosessen. - Legg et stykke tørr celle microsieve membran på toppen av brønnene, noe som gjør at microsieve membranen er i kontakt med alle de gel halvdeler som skal glødet og dekker dem helt. Legg et tykt filter papir på toppen av microsieve membran, og pass på å dekke gels helt.
- Pipetter en oppløsning av 100 mM natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumsitrat-dihydrat, Etylendiamintetraeddiksyre tetranatriumsalt-dihydrat) på tykke filterpapiret til den er mettet. Omtrent 750 ul er tilstrekkelig for fire brønner.
- Inkuber gelene i 1 minutt ved romtemperatur. Deretter fjerner celle microsieve membran og tykt filter papir og kast dem. Fjern bindemiddel klipp og åpne formen.
- For hvert herdet gel, overføre en natriumsitrat / EDTA-behandlet halvparten av hydrogel til forberedt "annealing mold" med snittflaten vendt oppover. Dette vil være en halvdel av herdet construct.
- Ved hjelp av en slikkepott, heis og plassere et andre natriumsitrat / EDTA-behandlet halv gel (kan inneholde en annen celletype) på gelen allerede i "annealing mold", bla denne andre halv gel slik at snittflaten er i kontakt med snittflaten av gelen allerede i "annealing formen".
- Trykk forsiktig ned på de to geler ved hjelp av en slikkepott for å fjerne eventuelle bobler mellom de to geler. Også omplassere gels som nødvendig for å sørge for at de er direkte oppå hverandre.
- Løft forsiktig "annealing formen" og senke den ned i 102 mM kalsiumklorid-bad i 30 minutter. Ikke dekk til brønner med en endeplate.
- Etter 30 min inkubasjon, fjerne "annealing mugg" og plassere den på tørkepapir. Fjern bindemiddel klipp og skille mold fra gavl.
- Ved hjelp av en slikkepott, samle glødet gels og plassere dem i en 1x Dulbeccos fosfatbuffret saltvann med kalsiumklorid og magnesium klorid bad for å vaske gels. Deretter overfører glødet hydrogeler til cellekultur media i en ønsket tallerken (f.eks., 6-brønns plate) for kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser dannelsen og lagdeling av alginat hydrogeler. Fullført bi-lag geler oppviser et fullstendig første separering av cellepopulasjoner, som vist i figur 2. Cellenes levedyktighet av humane stamceller) innleiret i disse hydrogeler og lagdelte forblir høy, og kan sammenlignes med bulk hydrogeler som vist i figur 3. Levedyktigheten ble vurdert etter gløding, slicing gels vertikalt for å få tilgang til sentrum og deretter farging av levende celler i herdet gels med en levende celle tracker, CMFDA (grønn) og døde celler (rød) med Ethidium homodimer-en ved hjelp av produsentens instruksjoner. Konfokale Z-stabler ble tatt av snittflaten ved hjelp av et fluorescens mikroskop omtrent 100 mikrometer inn i gelen. Disse bildene ble projisert inn i en 2D-bilde. Levende og døde celler ble deretter kvantifisert ved hjelp av partikkelanalysefunksjonen i ImageJ programvare.
jpg "/>
Figur 1:. Skjematisk av Layered Hydrogel Formation A. Bilde av den stablede støpeformen for tilsetningen av 2% alginat + celleblanding med en beskrivelse av stabelen for de nederste og øverste formhalvdelene. B. Skjematisk viser prosedyren for lagdeling av gel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Representant Separering av cellepopulasjoner i lagdelte Hydrogel Modell cellelinje 293ft HEK celler ble enten farget med levende celle tracker CMFDA (grønn) eller CMTPX (rød). Hver av disse cellegrupper ble innleiret i 2% (vekt / volum) alginat plater, og deretter halvdelene av disse platene ble lagt lagvis sammen. Et stykke ble skåret fra CMTPX side for å identifisere det under avbildning. Scale bar = 100 & #181; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Høy celleviabilitet innen Lagdelt Hydrogel etter Lagdeling er fullført menneske stamceller innebygd i bulk og bi-lag hydrogeler ble farget med levende celle (grønn) tracker CMFDA og døde celler (rød) ble farget med Ethidium homodimer-1 . Levedyktighet forble høy for begge hydrogel grupper etter lagdeling prosessen. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figure. 4: signifikant forskjellig Trender av lagdelte Hydrogel Cyclic Compression Response to Cyclic Compression Hydrogeler ble inkubert i en cellekultur inkubator i syv dager og deretter utsatt for 0-10% unconfined syklisk komprimering i fire timer på en Hz. Peak påkjenninger (± SEM) for hver syklus ble isolert og trender over lasting analyseperioden. Trender i henhold unconfined syklisk komprimering 0-10% belastning for lag (n = 9) og bulk (n = 8) gels er signifikant forskjellig (p = 0,03). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for dannelsen av lagdelte alginat hydrogel-plater for å studere ko-kulturer av flere cellepopulasjoner, slik som de i fysiologisk lagdelt vev, for eksempel brusk. Lagdelte strukturer, slik som den som er beskrevet kulturen plattformen, kan brukes til å undersøke samspillet mellom to distinkte cellepopulasjoner som er utsatt for den samme kulturen miljø eller under belastning.
Alginat er en anionisk lineært polysakkarid som er blitt funnet å være biokompatible og har blitt brukt for brusk biologi og regenerering av vev forskning 12,14. Alginat hydrogeler er dannet ved hjelp av divalente kationer for tverrbinding, f.eks., Kalsiumioner. Disse tverrbindinger kan angres ved å fjerne kationene ved anvendelse av en chelator, så som natriumcitrat eller EDTA, og denne fremgangsmåte er blitt brukt tidligere for å isolere kondrocytter som er blitt dyrket i gelene 3,4,12. På tilsvarende måte, det samme prinsipphar også blitt brukt for å overholde alginat ark i bilag eller klynger av alginatkuler sammen 11,12,15. Plattformen som er beskrevet her er avhengig av den samme prosessen, men blir brukt til å danne små skiveformede lagdelte hydrogeler. Dette er en to-trinns prosess som først blir alginat plater dannet ved hjelp av støpeformer nedsenket i et kalsiumrike bad. Disse blir deretter skåret i to og behandlet med en kalsium-chelaterende løsning for lokalt å frigjøre kalsiumioner fra det tverrbundne alginatet. Ved å plassere disse behandlede overflater sammen og re-neddykking av platene i et kalsium-rik oppløsning, blir tverrbindinger reformert, slik at bi-lagdelte konstruksjoner. Disse små lagdelte geler eliminere behovet for biopsi slag for å generere lett kultur prøvene er kompatible med analyser og eksperimenter som mekanisk testing, som vist i figur 4, for derved å minimalisere avfall av ofte kostbare celler, så vel som fabrikasjons materialer.
Som vist iFigur 3 er denne prosessen med å danne og lagdeling hydrogelene resulterte i tilsvarende høy levedyktighet som kontroll eller masse hydrogeler som viser at denne fremgangsmåten ikke er altfor påkjenning til cellepopulasjonen til tross for lengden og fravær av påfyll av næringsstoffer. Mangelen på en første overlappende region i gelen gjør fysisk separasjon under den første ko-kultur og evnen til å observere endringer i den aktuelle grensesnitt over tid. Undersøkelser har vist at over lange dyrkningsperioder dette grensesnitt kan miste definisjon på grunn av cellulær tverr infiltrasjon og ekstracellulær matriks avsetning 11. Mens den første lagdelte platen ikke inneholder noen adhesjonsmolekyler, som ekstracellulær matriks er avsatt, er det også et potensial for å undersøke en sammenslåing av cellepopulasjoner, og den endrede grensesnittet mellom lagene.
Disse bi-lag plater kan brukes enkelt for dynamisk kompresjon stimulering. Vi var i stand til å bekrefte at these hydrogeler motstå dynamisk kompresjon uten separasjon av halvdelene. Men i løpet av denne prosessen, ble topplast utstilt av lagdelte hydrogeler under fire timers syklisk komprimering funnet å være vesentlig forskjellig fra den ikke-lagdelt, bulk, hydrogeler. Dette resultatet tyder komplekse, ikke-lineære belastning overføring mellom lagene og avdekker et behov for en fysisk lagdelt kontroll gel, f.eks., Bi-lag hydrogel med den samme cellepopulasjon / tilstand i hvert lag, en viktig detalj for å merke til ved planlegging av eksperimentell design for studier som involverer mekanisk belastning. Bedre forståelse av de observerte forskjellene kan oppnås gjennom beregnings modellering av romlige mekanikk innenfor disse geler. Ikke bare vil slike analyser å forklare den belastning fordeling og overføring mellom lagene, men det vil også være medvirkende til å tolke cellulær oppførsel hos disse lagdelte geler, spesielt med lag av varierende mekaniske egenskaper.
Denne kulturen plattform was utviklet for forskningsarbeid for å undersøke sammenhenger mellom ulike cellepopulasjoner i 3D kultur. Det er således begrenset av dens mangel på skalerbarhet for kliniske anvendelser. Alternative metoder for å lage lagdelte hydrogeler, for eksempel 3D-utskrift, kan til slutt være mer klinisk relevant på grunn av forventet fremtidig skalerbarhet fremskritt, kontroll over mikrostruktur i plate interiør, og skreddersy av mesoklimatisk geometriske funksjoner. For forskningssøknader, som presenteres her, alginat-plater kan ikke uavhengig gi vedheft andeler for celler, som kan begrense sin søknad til andre celletyper. Det sammenlignbare alternative alginat ved vurdering brukervennlighet er agarose, som er beheftet med samme begrensninger. Videre krever den bruken av enzymer for å frigjøre celler for genetisk analyse, mens alginat tverrbindinger trygt kan fjernes ved hjelp av kalsium-chelaterende midler. Primært vil denne kulturen plattformen hjelpe til med å forbedre understanding av relasjoner mellom cellepopulasjoner i hydrogel og potensielt effekten av mekanisk stimulering av disse co-kulturer. Denne forståelsen vil da informere utvikling av terapi for heterogene vev, spesielt lasting bærer vev som leddbrusk eller mellomvirvelskiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Neidlinger-Wilke, C., et al. Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level. Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).
- Klein, T. J., et al. Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations. Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).
- Han, E., et al. Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects. Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).
- Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity. Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).
- Ng, K. W., et al. A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs. J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).
- Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel. Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).
- Leone, G., et al. Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute. J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Sci. Rep. 3, (2013).
- Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation. Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).
- Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds. Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).
- Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).
- Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering. Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).
- Xu, J., et al. Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels. Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).
- Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system. Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).
