Introduction
tissus porteurs de charge de compression tels que le cartilage articulaire ou les disques intervertébraux sont constitués de régions de tissus hétérogènes qui sont essentiels à la fois pour fonction biomécanique et mécano-transduction appropriée dans le tissu. Non seulement est l'organisation cellulaire et la fonction distincte dans différentes régions, mais les matrices extracellulaires (ECM) sont également variés dans la composition et de l'organisation. Par exemple, le cartilage articulaire est constituée de trois zones principales variant avec la morphologie cellulaire, la fonction mécanique, et l'ECM. Les différences dans leur ECM conduisent à une différence de charge portant des responsabilités; la couche superficielle est principalement impliquée dans la réponse à la traction à charger, tandis que les zones intermédiaires et profondes sont principalement responsables de la réponse à la compression 1. De même, dans le disque intervertébral, un noyau pulpeux de type gel est entourée par une fibrose lamellaire annulaire et les cellules dans ces deux domaines distincts ont présenté différents types de stimuli biophysiques2. Dans ces types de tissus, des cellules et des matrices extracellulaires au sein des couches de tissu interagissent les unes avec les autres que le tissu est soumis et réagit à des forces mécaniques.
Récapitulation de telles structures de tissus hétérogènes reste un défi dans l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative, et notre compréhension de leur signification biologique est limitée. Il existe un besoin pour cultiver des plates-formes d'analyse des tissus stratifiés, ainsi que des co-cultures de différentes populations de cellules au sein d'une construction. Dans le cartilage articulaire génie tissulaire, les constructions d'échafaudage moins couches ont été construits en exploitant la capacité des chondrocytes zonales pour déposer ECM varié pour imiter les différentes couches de ce tissu 3,4. Cependant, les constructions d'hydrogel en couches offrent une occasion pour étudier l'interaction de divers types de populations de cellules qui manquent de la capacité à former un tissu robuste indépendamment. Par exemple, pop différentepopu- des cellules souches mésenchymateuses peuvent être co-cultivés à l'intérieur des constructions en couches. Ces échafaudages stratifiés ont été utilisés avec les chondrocytes et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses pour améliorer 5 l' ingénierie tissulaire. Non seulement les populations de cellules différentes peuvent être co-cultivées dans des couches d'hydrogel similaires, mais un seul type de cellule peuvent également être mises en culture dans des couches qui ont été manipulées pour faire varier la raideur ou le contenu biochimique pour obtenir des réponses différentes à partir de cellules 6,7.
De nombreux hydrogels différents biomatériaux ont été utilisés pour superposer des populations cellulaires pour l' ingénierie tissulaire du cartilage tels que ceux utilisant du polyethylene glycol ou des bases d'alcool vinylique poly 7-9. Toutefois, les hydrogels d'alginate sont l'une des plus simples biomatériaux à partir duquel créer des échafaudages en couches pour l'étude de populations de cellules hétérogènes en co-culture. Alors que hydrogels agarose sont également facilement formés, les hydrogels d'alginate ont l'avantage supplémentaire de permettre facile estolation de cellules provenant de la construction en 3-D pour l' analyse des cellules individuelles comme cela a été 10 précédemment décrit. Dans des études précédentes, les hydrogels d'alginate bi-couches ont été formées en feuilles minces et à partir de ces feuilles, les sections ont été tranchés (par exemple., En utilisant un poinçon de biopsie) pour des applications particulières telles que l' analyse du contenu biochimique ou des propriétés de cisaillement interfaciale 11,12. Un autre procédé pour former des feuilles minces à base d'alginate a été décrit en relation avec le potentiel de la stratification en plusieurs couches, mais nécessiterait la modification de l'hydrogel pour utilisation dans les essais mécaniques 13.
Ici, nous présentons une méthode pour créer des disques de manière reproductible d'hydrogel d'alginate bi-couches pour une utilisation dans des co-culture de différentes populations de cellules. Cette plate-forme de disque d'alginate possède plusieurs avantages. Principalement, la forme reproductible et de petite taille est propice à la stimulation mécanique des cellules embarquées sans nécessiter une biopsie puNCH ou toute autre altération physique de l'hydrogel pour de nombreuses applications. En outre, la viabilité cellulaire reste élevée pendant le processus de stratification, et après la formation de gel une séparation claire des deux populations de cellules dans le gel est visible sans zone de chevauchement initial.
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Protocol
1. Préparation pour la formation de disques alginate
- Préparer une 4% (p / v) de solution d'alginate dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans chlorure 1x ajouté de calcium ou le chlorure de magnésium et le placer dans un bain-marie à 37 °. Les concentrations de la solution d'alginate peuvent varier, mais de 1 à 4% (p / v) de solution d'alginate sont recommandées.
- Mélanger la solution d'alginate dans un rapport de 1: 1 avec la base de milieux de culture cellulaire chaud (par exemple, milieu de Eagle modifié par Dulbecco.) Pour le type cellulaire souhaité. La concentration de l' alginate est maintenant la moitié de la concentration initiale, à savoir., 2% (p / v). Stériliser alginate solution / des médias en utilisant des filtres de seringue en nylon 0,2 um stérile.
- Préparer un bain d'eau stérile 102 mM de chlorure de calcium dihydraté dans de l'eau stérile avec suffisamment de solution pour immerger les moules (~ 200 - 300 ml).
- Recueillir la "formation de gel moule" stérile (6 mm de diamètre x 3 mm puits cylindriques de hauteur dans un 3 en x 3 en tôle d'aluminium, voir
- Couper le papier épais de filtre (papier filtre buvard) et la membrane microtamis cellulaire (10 taille um des pores) aux dimensions de la partie supérieure et de plateaux bas et placez-les dans le bain de chlorure de calcium jusqu'à saturation, environ 1 min. Si vous le souhaitez, stériliser le papier filtre épais et la membrane microtamis par autoclave ou lumière ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation.
- Mettre en place une moitié (la moitié inférieure) de la construction du moule.
- Placer les éléments suivants au sommet d'une autre dans l'ordre suivant et lisser à l'aide d'une spatule stérile: un grand plateau vertébral (3 pouces x 3 pouces), le papier filtre épais, puis la membrane micro-tamis.
- Inversez et appuyez sur le moule sur une pile de serviettes en papier pour assurer la perte de solution de chlorure de calcium en excès.
- Placer le "moule formation de gel» avec les puits cylindriques au-dessus du cmembrane microtamis ell et doucement fixer le moule ensemble sur deux côtés à l'aide des clips de liant sur les côtés gauche et droit. Assurez-vous de laisser assez de place pour le plateau vertébral supérieur (1,5 po x 3 po) pour couvrir complètement les puits plus tard.
- Mise en place de la seconde moitié (la moitié supérieure) de la construction du moule.
- Placez les éléments suivants au sommet de l'autre dans l'ordre suivant et lisser: petit endplate, papier filtre épais, membrane microtamis.
- Inversez et appuyez sur cette moitié du moule sur une pile de serviettes en papier pour assurer la perte de solution de chlorure de calcium en excès. Ne pas fixer cette moitié du moule en utilisant des clips liant à ce moment.
Remarque: Lorsque vous utilisez cette méthodepour la fabrication de couches avec différents types de cellules, assurez-vous de la culture de deux types de cellules en parallèle pour la superposition. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ensemencées à une densité cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml , on utilisera , par exemple , pour le protocole suivant. Le nombre de cellules et le numéro de disque peuvent être mis à l'échelle pour des expériences au besoin.
- Une à deux semaines avant l'enrobage, les cellules souches mésenchymateuses d'ensemencement à une densité cellulaire de 3.000 - 5.000 cellules / cm2 dans 10 ml de milieu de croissance de base (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, 10% de sérum bovin fœtal, 2% de L-Glutamine, 1 % non-acides aminés essentiels, 1% de pénicilline / streptomycine) dans T-75 flacons.
- Retirez le support passé tous les 2 - 3 jours et le remplacer par 10 ml de milieu de croissance basale jusqu'à ce que les cellules sont 80 - 90% de confluence.
- Pour récolter les cellules, enlever les milieux épuisés, et la pipette 3 ml de solution saline tamponnée phosphate 1x Dulbecco sans chlorure de calcium ajouté ou de chlorure de magnésium pour rincer les cellules. Retirer cette solution, pipette 3 ml de 0,25% TryPSIN-EDTA sur des cellules en croissance en flacons T-75, et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Après que les cellules ont soulevé de la surface adhérente, ajouter 6 - 9 ml de milieu de croissance de base.
- MSCs centrifuger à 600 xg pendant 5 min à température ambiante, Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1-5 ml de milieu de croissance basale. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre en utilisant des instructions de l'appareil.
- Enlever 1 x 10 6 cellules provenant de la remise en suspension des cellules totales, centrifuger en utilisant les mêmes conditions, et aspirer le surnageant.
2. Formation de cellule ensemencée alginate Disques
- Remettre en suspension le culot de cellules avec 1 ml de la solution d' alginate / support stérile pour obtenir une densité cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml. Le mélange de cellules alginate sera homogène aspect trouble lorsque les cellules sont mélangés dans de manière appropriée.
- Introduire à la pipette 130 ul du mélange de cellules-alginate dans six 6 mm de diamètre x 3 mm de hauteur des puits dans la moitié inférieure du moule,construire goutte à goutte, afin de ne pas créer de bulles. Un léger ménisque convexe doit être visible au-dessus du bord de chaque puits.
- lisser soigneusement la moitié supérieure de la construction de moule à l'aide d'une spatule stérile et retournez-le, de sorte que la membrane microtamis cellulaire est au-dessus des puits. Placer le moule construire au-dessus des puits, en veillant à couvrir les puits contenant la cellule et le mélange alginate complètement.
- Soulever la construction du moule chargé et, tout en appuyant fermement sur le centre, Pince les deux côtés restants (haut et bas) pour fixer les moitiés supérieure et inférieure de la construction du moule. Les solutions de cellules alginate doivent être solidement niché dans les puits à l'heure actuelle.
- Immerger le produit d'assemblage de moule fixé dans le bain de chlorure de calcium 102 mM, en veillant à ce que l'ensemble de la structure est submergée. Incuber dans la hotte de culture cellulaire à la température ambiante pendant 90 min.
- A la fin des 90 minutes, enlever le produit d'assemblage de moule à partir du chlorure de calcium 102 mMsalle de bain et le placer sur une pile de serviettes en papier dans la hotte de culture cellulaire. Retirez tous les quatre clips de liant et de séparer les deux moitiés de la construction du moule. Les hydrogels formés dans les puits ne doivent pas avoir de bulles et doivent remplir les puits complètement.
- Avec une spatule, tracer soigneusement le bord des puits contenant les hydrogels pour desserrer soigneusement et caler les hydrogels. Après avoir enlevé les hydrogels de la construction du moule, laisser tomber les hydrogels directement dans un bain de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco 1x avec du chlorure de calcium et chlorure de magnésium. Couvrir les gels complètement pour laver la solution de chlorure de calcium en excès pendant 1 - 5 min.
- Transférer les hydrogels dans la solution de base de milieu de croissance dans le plat désiré (par exemple., Des plaques de 6 puits) qui couvre complètement les hydrogels. Laisser incuber pendant au moins 1 h dans l'incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 avant de procéder à l'étape de stratification.
Note: Les hydrogels contenant des cellules peuvent être conservées dansl'incubateur de culture cellulaire indéfiniment à ce moment jusqu'à ce que la superposition de gels avec une autre population cellulaire est souhaité, à condition que les changements de médias sont remplis tous les 2 - 3 jours.
3. Superposition des disques alginate
- Au cours de la dernière demi-heure de l'incubation de 1 h, recueillir et préparer des moules stériles et solution pour le recuit des gels.
- Préparer le "moule de coupe" par la fixation d'un moule qui comporte des puits de la moitié de la hauteur de la "formation de gel moule" (6 mm de diamètre x 1,5 mm de haut de puits dans un 3 x 3 en tôle d'aluminium) à une plaque d'extrémité (3 pouces x 3 dans la plaque d'aluminium) en utilisant des clips liant sur les côtés gauche et droit.
- Préparer le "moule de recuisson" par la fixation d'un moule qui est à 3 mm de diamètre plus grand que la «formation moule de gel" (diamètre 9 mm x 3 mm de haut de puits dans un 3 in x 3 in plaque d'aluminium) à une plaque d'extrémité (3 pouces x 3 dans la plaque d'aluminium) en utilisant des clips liant sur les côtés gauche et droit.
- Préparer une solution decitrate de sodium mM 100/30 mM EDTA (citrate de sodium dihydraté, éthylènediaminetétraacétique tétrasodique d'acide sel dihydrate) dans de l'eau stérile.
- Retirer gels de populations cellulaires désirées (dans cet exemple, deux disques avec CSMh) des médias dans le plat, et la placer dans le "moule de coupe" puits. Chaque gel doit être bien ajusté dans les puits avec la moitié du gel en saillie au-dessus du moule.
- L'utilisation d'un scalpel, découper le gel le long de la surface du moule (ce qui coupe l'hydrogel dans la moitié). Retournez la moitié supérieure du gel et le placer dans un puits de moule ouvert. La moitié du gel devrait également être bien ajusté dans le moule bien, mais maintenant les deux gels demi devrait être la hauteur du moule avec la surface intérieure coupée visible. Répétez avec le deuxième gel.
Note: Attention: Seules les surfaces intérieures coupées formeront des disques en couches. En utilisant les surfaces extérieures entraînera la séparation des moitiés. On soupçonne que la texture de la membrane micro-tamis transférée sur la surface du gel empêchents succès du processus de recuit. - Placer un morceau de membrane de micro-tamis de la pile sèche au-dessus des puits, en veillant à ce que la membrane micro-tamis est en contact avec toutes les demi-gel à recuire et en les recouvrant complètement. Placez du papier filtre épais sur le dessus de la membrane microtamis, en veillant à couvrir les gels complètement.
- Pipeter une solution de citrate de sodium 100 mM / EDTA 30 mM (citrate de sodium dihydraté, l'acide éthylènediaminetétraacétique tétrasodique dihydraté du sel) sur le papier filtre épais jusqu'à ce qu'il soit saturé. Environ 750 ul est suffisant pour quatre puits.
- Incuber les gels pendant 1 min à température ambiante. Ensuite, retirez la membrane cellulaire et microtamis papier filtre épais et jetez-les. Retirez les clips de liant et ouvrir le moule.
- Pour chaque gel recuite, le transfert d'un citrate de sodium / EDTA demi-traitée de l'hydrogel préparé à l' "moule de recuit" à la surface de coupe tournée vers le haut. Ce sera une moitié de la const recuiteruct.
- À l'aide d'une spatule, soulever et placer un citrate deuxième de sodium / demi-gel traité à l'EDTA (peut contenir un type de cellule différent) sur le gel déjà dans le "moule de recuit», le retournement de cette seconde moitié du gel de telle sorte que la surface de coupe est en contact avec la surface du gel de coupe déjà dans le "moule de recuit».
- Appuyez doucement sur les deux gels à l'aide d'une spatule pour éliminer les bulles entre les deux gels. En outre, repositionner les gels au besoin pour faire en sorte qu'ils sont directement sur le dessus les uns des autres.
- Soulevez doucement le «moule de recuit" et le plonger dans le bain de chlorure de calcium 102 mM pendant 30 min. Ne pas couvrir les puits avec une plaque d'extrémité.
- Après l'incubation de 30min, retirez le «moule de recuit" et placez-le sur du papier absorbant. Retirez les clips de liant et de séparer le moule du plateau vertébral.
- Avec une spatule, recueillir les gels recuites et les placer dans un 1x Dulbecco saline tamponnée au phosphate avec du chlorure de calcium et mbain de chlorure agnesium pour laver les gels. Par la suite, le transfert hydrogels recuits à des milieux de culture cellulaire dans un plat désiré (par exemple., Plaque de 6 puits) pour la culture.
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Representative Results
La figure 1 représente la formation et la stratification des hydrogels d'alginate. Complété gels bi-couches présentent une première séparation complète des populations de cellules comme le montre la figure 2. La viabilité cellulaire des cellules souches mésenchymateuses humaines) incorporés dans ces hydrogels et des couches reste élevée et comparable à celle des hydrogels en vrac comme le montre la figure 3. La viabilité a été évaluée après le recuit, le tranchage, les gels verticalement pour accéder au centre, puis coloration des cellules vivantes dans les gels hybridées avec un suiveur de cellules vivantes, CMFDA (verte) et des cellules mortes (rouge) avec éthidium homodimère-1 en utilisant les instructions du fabricant. Z-piles confocale ont été prises de la surface de coupe à l'aide d'un microscope à fluorescence d'environ 100 um dans le gel. Ces images ont été projetées dans une image 2D. Les cellules vivantes et mortes ont ensuite été quantifiés à l'aide de la fonction de l'analyseur de particules dans le logiciel ImageJ.
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Figure 1:. Schéma de la formation Layered Hydrogel A. Image de moule empilé pour l'addition de 2% d'alginate + mélange de cellules avec une représentation de l'ordre d'empilement pour les moitiés de moule inférieure et supérieure. B. Schéma illustrant la procédure pour la superposition du gel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Séparation représentant des populations de cellules dans la lignée cellulaire Layered Hydrogel Modèle cellules 293FT HEK ont été soit colorées avec suivi de cellules vivantes CMFDA (vert) ou CMTPX (rouge). Chacun de ces groupes de cellules ont été noyées dans 2% (p / v) d'alginate de disques, puis les moitiés de ces disques ont été stratifiés ensemble. Une pièce a été coupée du côté CMTPX de l'identifier lors de l'imagerie. Barre d'échelle = 100 & #181;. M S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Viabilité cellulaire élevée dans les couches Hydrogel après Superposition processus est terminé les cellules souches mésenchymateuses humaines intégrées en vrac et bi-couches hydrogels ont été colorées avec des cellules vivantes (vert) suivi CMFDA et les cellules mortes (rouge) ont été marqués par éthidium homodimère-1 . Viabilité est restée élevée pour les deux groupes d'hydrogel après le processus de stratification. Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figur. e 4: significativement différent Tendances de Layered Hydrogel Réponse Compression Cyclique à compression cyclique hydrogels ont été incubées dans un incubateur de culture cellulaire pendant sept jours et ensuite soumis à 0 - 10% de compression cyclique unconfined pendant quatre heures à 1 Hz. contraintes de pointe (± SEM) pour chaque cycle ont été isolés et les tendances au cours de la période de chargement analysés. Tendances en compression cyclique unconfined de 0 - déformation de 10% pour les couches (n = 9) et en vrac (n = 8) gels sont significativement différentes (p = 0,03). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous décrivons un protocole pour la formation de disques d'hydrogel d' alginate pour l' étude des couches co-cultures de populations cellulaires multiples, tels que ceux dans les tissus physiologiquement stratifiés, par exemple, le cartilage. des structures en couches, telles que la plate-forme de culture décrit, peuvent être utilisés pour examiner l'interaction entre les deux populations cellulaires distinctes soumises au même milieu de culture ou sous charge.
Alginate est un polysaccharide linéaire anionique qui a été trouvé pour être biocompatible et a été utilisé avec succès pour la biologie du cartilage et de l' ingénierie tissulaire de recherche 12,14. Les hydrogels d' alginate sont formés en utilisant des cations divalents pour la réticulation, par exemple les ions calcium.,. Ces reticulations peuvent être annulées en supprimant les cations en utilisant un chélateur, tel que le citrate de sodium ou de l' EDTA, et ce procédé a déjà été utilisé pour isoler des chondrocytes qui ont été mises en culture dans les gels 3,4,12. De même, le même principea également été appliquée avec succès pour faire adhérer les feuilles d'alginate dans des bicouches ou même des groupes de billes d'alginate ensemble 11,12,15. La plate-forme décrite ici repose sur ce même procédé, mais il est utilisé pour former des hydrogels petites couches en forme de disque. Ceci est un procédé en deux étapes dans lequel en premier lieu, les disques d'alginate sont formés en utilisant des moules immergés dans un bain riche en calcium. Elles sont ensuite coupées en deux et on traite avec une solution de chélateur du calcium pour libérer localement les ions calcium de l'alginate réticulé. En plaçant ces surfaces traitées ensemble et ré-immersion des disques dans une solution riche en calcium, réticulations sont réformés, ce qui rend les constructions bi-couches. Ces petits gels couches éliminent le besoin de poinçons de biopsie pour générer des échantillons faciles à la culture compatibles avec des essais et des expériences telles que les essais mécaniques, comme le montre la figure 4, ce qui minimise les déchets des cellules souvent précieuses ainsi que des matériaux de fabrication.
Comme représenté sur laLa figure 3, ce procédé consistant à former et la superposition des hydrogels a donné lieu à une viabilité élevée de façon similaire que la commande ou des hydrogels en vrac indiquant que cette procédure ne soit pas trop lourde charge pour la population de cellules en dépit de la longueur et de l' absence de nutriments réapprovisionnement. L'absence d'une région de chevauchement dans le gel initial permet une séparation physique pendant la co-culture initiale et la capacité d'observer des modifications à cette interface dans le temps. Des études ont montré que sur des périodes de culture longues cette interface peut perdre la définition en raison de contre-infiltration cellulaire et extracellulaire dépôt de matrice 11. Tandis que le disque stratifié initial ne contient pas de molécules d'adhésion, en tant que matrice extracellulaire est déposé, il y a également un potentiel pour étudier la fusion des populations de cellules et l'interface entre les couches changeant.
Ces disques bi-couches peuvent être utilisés facilement pour la stimulation de compression dynamique. Nous avons pu confirmer que these hydrogels résister à la compression dynamique sans séparation des moitiés. Cependant, au cours de ce processus, la charge maximale présentée par les hydrogels en couches lors de la compression cyclique de quatre heures se sont révélés être significativement différent du non stratifié, en vrac, des hydrogels. Ce résultat suggère complexe de transfert, de souche non-linéaire entre les couches et révèle un besoin pour un gel de contrôle physique en couches, par exemple., Hydrogel bi-couches avec la même population de cellules / condition dans chaque couche, un détail important de noter que lors de la planification de la conception expérimentale pour les études impliquant une charge mécanique. Une meilleure compréhension des différences observées pourrait être atteint grâce à la modélisation informatique de mécanique spatiale au sein de ces gels. Non seulement ces analyses aident à clarifier la répartition des contraintes et le transfert entre les couches, mais il serait également un rôle pour interpréter le comportement cellulaire dans ces gels en couches, en particulier avec des couches de différentes propriétés mécaniques.
Cette culture plateforme was développé pour des applications de recherche pour étudier les relations entre les différentes populations de cellules en culture 3D. Ainsi, il est limité par son manque d'adaptabilité pour les applications cliniques. Des méthodes alternatives pour la création d'hydrogels en couches, telles que l'impression 3D, peuvent finalement être plus cliniquement pertinente en raison de futures avancées d'évolutivité anticipées, le contrôle de la microstructure à l'intérieur du disque, et de personnalisation des caractéristiques géométriques macroscopique. Pour les applications de recherche, tel que présenté ici, les disques d'alginate ne fournissent pas indépendamment des fragments d'adhésion pour les cellules, ce qui pourrait limiter son application à d'autres types de cellules. L'alternative comparable à l'alginate lorsque l'on considère la facilité d'utilisation est d'agarose, qui souffre de limitations similaires. En outre, il nécessite l'utilisation d'enzymes pour libérer les cellules pour une analyse en aval, tandis que l'alginate reticulations peuvent être éliminés en toute sécurité en utilisant des agents chélatants du calcium. Principalement, cette plate-forme de culture contribuera à l'amélioration de l'understanding de relations entre les populations de cellules dans des hydrogels et potentiellement les effets de la stimulation mécanique de ces co-cultures. Cette compréhension informera ensuite le développement de thérapies pour les tissus hétérogènes, en particulier le chargement des tissus portant tels que le cartilage articulaire ou des disques intervertébraux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid sodium salt | Sigma Aldrich | A1112 | Solution made in wt% using DPBS (-/-) |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+) | Gibco Life Technologies | 14190 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco Life Technologies | 11965 | Example. Use desired medium type |
| Syringe Filters (0.02 μm Nylon) | FisherBrand | 0979C | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Bioreagents | BP510 | Prepare solution in sterile water |
| Criterion Blotter Filter Paper | Biorad | 1704085 | Cut to size of endplates for mold formation |
| Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size) | Biodesign Inc of New York | N10R | Cut to size of endplates for mold formation |
| Sodium citrate dihydrate | FisherScience | S93364 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA) | FisherBioreagent | BP121 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Life Technologies | 26140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco Life Technologies | 15140 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco Life Technologies | 25030081 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
| Non-essential Amino Acids (100x) | Gibco Life Technologies | 11140050 | Used in example mesenchymal stem cell basal growth media |
References
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