Abstract
La placenta se deriva de un linaje extraembrionario, el trophectoderm. En el peri-implantación de blastocisto murino, células trophectoderm murales se diferencian en células gigantes trofoblasto primaria (TGC), mientras que el trophectoderm polar que recubre la masa celular interna continúa proliferando más tarde diferenciarse en TGC secundarias. TGC jugar un papel clave en el desarrollo de la placenta y son esenciales para un embarazo exitoso. La investigación de la regulación transcripcional de genes específicos durante el desarrollo post-implantación puede dar una visión de desarrollo TGC. Las células del cono ectoplacental (EPC) a partir de embriones en 7-7.5 días de gestación (E7-7.5), derivado de la trophectoderm polar, se diferencian en TGC secundarias 1. TGC se puede estudiar in situ, en las secciones de criostato de embriones en E7 aunque el número de TGC es muy baja en esta etapa. Un medio alternativo para el análisis de TGC secundaria es el uso de cultivos a corto plazo de las CPE individuales a partir de embriones E7s. Proponemos una técnica para investigar el estado transcripcional de genes de interés tanto in vivo como in vitro a nivel de una sola célula usando hibridación fluorescente in situ (FISH RNA) para visualizar las transcripciones nacientes. Esta técnica proporciona una lectura directa de la expresión génica y permite evaluar el estado cromosómico de TGC, que son células grandes endoreplicating. De hecho, una característica clave de diferenciación terminal de TGC es que se aproximan a la del ciclo celular y se someten a múltiples rondas de enfoque endoreplication.This puede ser aplicado para detectar la expresión de cualquier gen expresado a partir de autosomas y / o cromosomas sexuales y pueden proporcionar información importante en el desarrollo mecanismos, así como enfermedades de la placenta.
Introduction
trofoblasto células gigantes mamíferos (TGC) forman una barrera entre los tejidos maternos y embrionarios. Que median en la implantación y la invasión del embrión en el útero y juegan un papel crítico en el desarrollo de la formación de la placenta. Producen varios factores de crecimiento (citoquinas) y las hormonas de la familia y los esteroides prolactina / Lactógeno placentario, necesaria para el crecimiento y la supervivencia embrionaria. TGC son células grandes, mononucleadas y poliploide con un ciclo celular, la endocycle, que consiste en alternar fases S y G. De hecho, se TGC endoreplicating células, capaces de someterse a múltiples rondas de síntesis de ADN sin ninguna división 2. Con el fin de investigar el estado transcripcional de genes in vivo, de TGC en comparación con otros tipos de células embrionarias y extraembrionarias, naciente ARN FISH se puede realizar in vivo en secciones de criostato de 3 en etapas específicas después de la implantación. TGC son fácilmente reconocibles en las secciones debido a their su actividad transcripcional de genes de gran tamaño y se pueden grabar pero su número en las etapas posteriores a la implantación temprana es baja. Escasez de TGC en E7 secciones embrionarias, nos llevó a realizar los cultivos a corto plazo de los tejidos embrionarios trophectodermal obtener TGC diferenciadas con el fin de estudiar la regulación de la expresión génica durante el desarrollo trophectoderm. Por otra parte, con el fin de seguir siendo tan fisiológico como sea posible, las líneas celulares establecidas, es decir trophectoderm células (TS) Tallo no siempre son adecuados para investigar la generación de mecanismos de desarrollo del TGC secundarias proporcionan una valiosa herramienta para estudiar los embarazos patológicos asociados con defectos en TGC debido al gen anormal la regulación en ratones.
Las células trofoblásticas del cono ectoplacentario (EPC) son precursores de TGC secundarias 4. Diferenciación espontánea de CPE cultivadas a TGC secundaria ha sido previamente informado 5. Sin embargo, en contraste con TGC primarios, estudios sobre secundaria differen TGCciación se han mantenido limitadas, presumablydue a las dificultades de aislar explantes EPC, libre de todo los tejidos maternos o embrionarias. Hemos adaptado estos métodos, con el fin de realizar ARN FISH en TGC secundarios derivados de embrión individual en E7, una etapa de desarrollo después de la implantación donde TGC son muy pocos, pero podrían ser generados a partir de precursores de EPC. ARN FISH para analizar las transcripciones primarias nucleares nunca se ha hecho a nivel del nivel de células individuales en TGC secundarias. Esto permite un análisis preciso de la transcripción y se utilizó para mostrar la inestabilidad epigenética de TGC en las etapas posteriores a la implantación 3.
Un ejemplo clásico de la epigenética en los mamíferos, la inactivación del cromosoma X (XCI) es estudiada en el laboratorio Heard 6. En este proceso uno de los 2 cromosomas X en mujeres se inactiva. El no codificante Xist capas de transcripción del cromosoma X de los que se expresa en las células femeninas y desencadena el silenciamiento de la mayoría de genes. El uso de ARN FISH,naciente transcripciones de los genes ligados al cromosoma X pueden ser investigados al igual que la acumulación de Xist ARN en el cromosoma X inactivo (Xi). Se describe aquí un procedimiento para realizar ARN FISH en secciones de embriones después de la implantación y en cultivos de corto plazo de la EPC. Este protocolo adaptado de aquellos que fueron utilizados para estudiar XCI en la diferenciación de las células madre de embriones femeninos y embriones de preimplantación 7-11. Proporcionamos ejemplos de XCI en embriones femeninos en vivo, así como in vitro en TGC.
Protocol
procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el cuidado de los animales institucional aprobado y el uso comité de los protocolos Instituto Curie (CEEA-IC) (C 75-05-18). El trabajo también se ha llevado a cabo bajo la aprobación del Ministerio de Educación Superior e Investigación de Francia para el uso de Organismos Genéticamente Modificados (número de contrato 5549CA-I).
1. Preparación de las secciones de criostato
- Recoger los embriones de ovular naturalmente F1 C57BL / 6 x DBA 2J ratones / como se describe en Shea et al., 12. En el día 7 de gestación (E7), sacrificar el ratón 8-12 semanas de edad mediante dislocación cervical. Recoger todo el producto de la concepción es decir decidua 12.
- Aislar conceptuses E7, como se describe en Shea et al., 12. Colocarlos en una placa de Petri de 60 mm que contenía PBS.
- Congelar el embrión de ratón E7 para las secciones de criostato.
- Preparar pozos de papel de aluminio adaptadas 1 cm de altura ( 'hecho en casa' usando una Pasteur de vidrio de pepitaet). Depositar una gota de medio de congelación de tejido en la parte inferior de este recipiente pequeño. Depositar el conceptus en la orientación correcta (es decir, para las secciones longitudinales del conceptus debe mantenido en su orientación horizontal).
- Llenar el pocillo que contiene el conceptus con el tejido medio de congelación. Suspenderlo con fórceps en vapor por encima de N2 líquido con el fin de permitir que se congele lentamente - luego sumerja el bloque en el líquido N2 durante unos pocos segundos hasta que se vuelve blanco. Posteriormente, transferir el bloque en un vial de congelación y se almacena a -80 ° C (se puede almacenar durante varios meses).
- Antes de crio-seccionamiento, colocar el bloque congelado que contiene el producto de la concepción a -20 ° C en el criostato durante 30 minutos. Realizar criosecciones de espesor 8 micras. Depósito 4 secciones en una diapositiva para permitir la unión eficiente. Se colocan los cortes lo suficientemente cerca como para caber debajo de un cubreobjetos de 18 x 18 mm 2.
- Comprobar la calidad de la(secciones intactas y sin arañazos) y la orientación del embrión (secciones longitudinales) con un microscopio estereoscópico y elegir las secciones adecuadas para su posterior análisis. Lo más rápidamente posible depositarlos en una jarra Coplin y realizar ARN FISH (Ver 3.3.2).
2. Preparación de TGC Secundaria
- Aislar el Conceptus (ver 1.1 y 1.2).
- Diseccionar el Ectoplacental Cono E7 (EPC)
- Utilizar un microscopio estereoscópico y cajas de Petri con PBS estéril. Diseccionar la decidua con unas pinzas. Pierce la muestra y fórceps abierto para despedazar los dos lados de la decidua aparte.
- Desembolsar el embrión. Usar puntas de unas pinzas finas cerradas (Dumont # 5) en una acción de tijera para separar el EPC del embrión propiamente dicho. Utilice especial cuidado para obtener una muestra perfectamente limpio, separado de tejido materno, así como de corion y el saco vitelino. Lavar la explantes EPC en PBS.
- Con un poco de cuchara, transferir EPC disecado individuo a un 4-well placa que contiene un cubreobjetos estéril en medio.
- TGC derivar de EPC Los cultivos a corto plazo.
- Preparar placas de 4 pocillos que contenían cubreobjetos. Esterilizar 12 mm de diámetro ronda cubreobjetos de vidrio por inmersión en etanol, seguido de la llama de secado.
- Añadir 0,5 ml de medio de EPC a cada pocillo (medio EPC: RPMI 1640 suplementado con 15% de FCS, 0,1 mM 2-mercaptoetanol y antibióticos).
- Único depósito, EPCs-disecados en el centro del cubreobjetos en el pozo junto con medio de cultivo. Utilice unas pinzas finas para aplicar el CPE sobre el portaobjetos de vidrio. Culturefor 3-5 días a 37 ° C, 5% de CO 2. Explante individual constituye una derivación que se extiende como una monocapa de TGC aplanado (Figura 2A).
3. ARN FISH
NOTA: Los protocolos se basan en las descritas para las células madre embrionarias (CME) en Chaumeil et al, 8 y 13 Pollex y oído..
- avanzada la AEEración de archivo Soluciones
- Preparar un tampón de acetato de sodio 3 M pH 5,2.
- Preparar tampón de hibridación 2x que contiene un 40% (w / v) de sulfato de dextrano sódico, 20x BSA, 400 mM Vanadilo ribonucleósido Complejo (VRC) en 4x salina citrato de sodio (SSC).
- Preparar medio de montaje que contiene 90% (v / v) de glicerol, 0,1% (w / v) p-fenilendiamina, pH 9 en PBS.
- Soluciones recién preparadas
- Preparar la solución de fijación que consiste en paraformaldehído al 3% recién preparada (PFA) en PBS. Preparar la solución de permeabilización que contiene 0,5% de Triton-X-100 en PBS suplementado con 2 mM VRC. Preparar el tampón de lavado mediante la mezcla de 50% de formamida (FA) y 2x SSC y ajustar el pH a 7.2 a 7.4.
- Preparar la solución de contra-tinción de ADN que consiste en 1 mg DAPI / ml (4 ', dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol) en 2x SSC.
- La fijación y permeabilización de Preparación para FISH
- Para las células sobre cubreobjetos, lavar las células en 1 x PBS durante 5 men. Fijar las células sobre cubreobjetos, o secciones embrionarias en portaobjetos, por 10 min en fijador solución (3% PFA) a TA.
- Enjuagar las células tres veces con 1x PBS. Permeabilizar las células durante 5 min en solución de permeabilización enfriado en hielo en hielo. Lavar las células tres veces con 70% de etanol. cubreobjetos almacenar en placas de 4 pocillos y se desliza en caja de transporte 4-deslizante en el 70% de etanol a -20 ° C.
NOTA: Los cubreobjetos y portaobjetos pueden almacenarse durante varios meses a -20 ° C. Placas y cajas que los contienen tienen que ser selladas con parafilm para evitar la evaporación del etanol.
- Etiquetado de ADN de la sonda
- Etiqueta de sondas de ADN por desplazamiento de la mella utilizando nucleótidos fluorescentes. Siga las instrucciones del fabricante (véase la Tabla 1) 8.
- Para una mezcla de reacción de 50 l, añadir 1-2 g de plásmido, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o la amplificación múltiple de desplazamiento (MDA) (para la amplificación del ADN; véase 3.4.4) de ADN a 17,5 l de agua, 2,5 l 0,2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 l de 10 mM de cada dNTP mix (dGTP, dATP, dCTP), dTTP 5 l 10 mM, 5 l de 10x tampón de traslación de corte y la enzima traslación de corte 8 l.
- Incubar durante 16 horas a 15 ° C en la oscuridad. Inactivar la reacción por congelación a -20 ° C. sondas para almacenaje de meses a -20 ° C.
- MDA
NOTA: Para el ADN de BAC, la cantidad de ADN obtenido después de la preparación clásica es baja, por lo tanto, se puede usar una etapa de amplificación de ADN antes de su etiquetado mediante el uso de MDA. Utilice un kit comercial y seguir las instrucciones del fabricante (ver Tabla 1). - Mezclar 0,5 l de ADN BAC con 9,5 l de tampón de muestra. Calentar 3 min a 95 ° C. Inmediatamente apagar en hielo; dejar en hielo 10 min. Prepare la mezcla de tampón de reacción / enzima: (9,5 l + 0,5 l de mezcla de enzimas) y mantener en hielo.
- Mezclar 10 l de mezcla de ADN + 10 l de mezcla de reacción tampón / enzima. Incubar a 30 ° C al menos 20 horas. Inactivar la enzima en la muestra de calentamiento 10 min a 65 & #176; C. muestra fresca a 4 ° C antes de almacenar a -20 ° C.
- Compruebe MDA mediante digestión. Añadir 1 l MDA, 2 l de 10x tampón, 2 l Hind III y 15 l de H2O Incubar a 37 ° C durante la noche. Ejecutar lentamente en un gel de agarosa al 0,8 hasta 1% para confirmar la amplificación de ADN exacta. Los fragmentos de ADN claras de alto peso molecular se deben observar en el gel.
- Preparación de la sonda
- Use 0,1 o 1 mg sonda por cubreobjetos o portaobjetos.
NOTA: Añadir 2-5 g de ADN Cot-1 si se requiere la competencia, por ejemplo, la mayoría de las sondas, ya que pueden contener secuencias repetidas que se hibridan otra manera transversal e incrementar el fondo.- Para la precipitación, se añaden 5 g de ADN de esperma de salmón, 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 3 volúmenes de etanol. Centrifugado a 16.000 x g y 4 ° C durante 25 minutos. Lavar gránulos con 70% de etanol y centrifugar de nuevo durante 5 min.
- gránulo seco durante 2 minutos en una aspiradora de concentrador / velocidad. Volver a suspender en forma 100%amida en la mitad del volumen requerido para la hibridación (por ejemplo, 2,5 l de cubreobjetos o 7 l para las secciones de embriones en la diapositiva). Coloca 30 min a 37 ° C con agitación en un Thermomixer. Desnaturalizar durante 7 minutos a 75 ° C.
- Saciar en hielo, o si competición tiene que poner directamente a 37 ° C durante 30-60 minutos. Mezclar la solución de la sonda con un volumen igual de solución de hibridación 2x.
- Use 0,1 o 1 mg sonda por cubreobjetos o portaobjetos.
- La hibridación y los lavados
- Deshidratar; cubreobjetos en los pozos, y se desliza en una jarra Coplin, por lavado secuencial en 1x 80%, 1x y 2x 95% etanol al 100% durante 5 minutos cada uno. cubreobjetos y portaobjetos secos completamente.
- Para la hibridación, aplicar el 5 l de mezcla de sonda de hibridación (véase 3.5) en un portaobjetos y bajar el cubreobjetos, con células que enfrenta en la mezcla de hibridación. Para las secciones de la diapositiva, aplique 14 l de mezcla de sondas de hibridación (véase 3.5) y cubrir con un cubreobjetos de 18 x 18 mm 2.
- Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda (papel de seda en remojo50% FA / 2x SSC) y se incuba a 37 ° C durante la noche, en la oscuridad.
- Los lavados post-hibridación:
- Añadir 1 ml de 50% FA / 2x SSC en el cubreobjetos sobre el portaobjetos para aflojarla; quitar el cubreobjetos con cuidado de la corredera (con cuidado de no raspar las células) y colocarla del lado celda hacia arriba en una placa de 4 pocillos que contiene 50% FA / 2x SSC. Para las secciones de la diapositiva, retirar el cubre de una manera similar y colocar la placa en un vaso de Coplin que contiene 50% FA / 2x SSC.
- Realizar 3 lavados, cada uno de 7 min con pre-calentado 50% FA / 2x SSC a 42 ° C o 44 ° C para cubreobjetos o diapositiva, respectivamente.
- Realizar 3 lavados con pre-calentado 2x SSC durante 5 min cada uno a 42 ° C o 44 ° C para cubreobjetos o diapositiva, respectivamente.
- Contratinción núcleos por lavado en 2x SSC con 1 g / ml DAPI durante 3 min a RT. Enjuague dos veces con 2 x SSC.
- Montaje del cubreobjetos y portaobjetos
- Para los pequeños cubreobjetos de TGC culta, aplique 5 y #181; medio de montaje sobre un portaobjetos l. Colocar la cubeta del lado del cubreobjetos hacia abajo en la parte superior de la gota.
- Para portaobjetos con las secciones, aplique 15 l medio en la diapositiva de montaje. Coloque una de 22 x 22 mm 2 cubreobjetos en la parte superior de la gota.
- Evitar las burbujas. Limpie el exceso de solución de montaje. Sellar el cubreobjetos con una pequeña cantidad de esmalte de uñas. Si es posible, la imagen se desliza inmediatamente o almacenar para un máximo de varios meses a -20 ° C.
4. Microscopía y análisis
- Adquirir imágenes en 3D del eje z secuenciales de 0,3 micras utilizando un microscopio de fluorescencia (objetivo 63X) y llevar a cabo el análisis de 3D pilas de imágenes utilizando el software ImageJ 14.
Representative Results
TGC puede ser identificado en las secciones E7 sobre tinción DAPI debido a su localización en el conceptus y su gran tamaño. Esto se ilustra en la Figura 1A en una sección longitudinal. ARN FISH se realizó en tales secciones de embriones con el fin de estudiar la inactivación del cromosoma X en este linaje extra-embrionario.
Varios diapositivas o cubreobjetos se pueden procesar al mismo tiempo. Mediante el uso de diferentes tintes para etiquetar ARN de diferentes genes, se puede detectar diferentes transcritos primarios en el mismo núcleo. Al menos 2 sondas pueden ser mezclados entre sí, por ejemplo Xist acoplado a SG (señal verde) y ATRX acoplado a SR (señal roja). Un ejemplo de un TGC femenina se muestra en la Figura 1B, donde están representados otros 2 linajes, el embrión adecuada (E) y el endodermo visceral (VE). Un núcleo TGC se muestra con Xist ARN que cubre el chrom XOsome que se inactiva (Xi), mientras que el otro cromosoma X que está activo (Xa) muestra un par de puntas de alfiler. ATRX genes transcritos primarios ligados al cromosoma X se expresan a partir del cromosoma X activo (no decorado por Xist) en varias copias, debido a endoreplication. Esto ilustra por ejemplo monoallelic expresión, la inactivación de ATRX en un cromosoma X.
Desde TGC son heterogéneas en tamaño como se ilustra en la Figura 2B, sólo las más importantes se registran. Tres sondas también se pueden utilizar como se ilustra en la Figura 2C para TGC secundarias. En este caso, Xist -SG (verde), dos genes ligados al cromosoma X: G6pd -SR (rojo) y Huwe1 -CY (magenta) se analizaron al mismo tiempo en el mismo núcleo. Mientras G6pd se expresa monoallelically como se muestra aquí (y anteriormente se muestra en TGC secundarias 3) Huwe1 se expresa biallelically demostrando su propiedad para escapar XCI. Endoreplication, con varias puntas de alfiler, es decir, transcripciones nacientes copias, es también evidente.
Figura 1. expresión transcrito primario en TGC de la sección femenina embrionaria E7. (A) Sección longitudinal del embrión E7 teñidas con DAPI. El embrión y tejidos extra-embrionarios están rodeados por el tejido madre, la decidua. La localización de los diferentes linajes se realiza la tinción DAPI con objetivo 5X. TGC son identificados debido a su gran tamaño. Ch, corion, E, embrión, EPC, cono ectoplacentario, VE, endodermo visceral, TGC, células gigantes trofoblasto. Barra de escala = 100 micras. (B) Mayor aumento del área de caja-en en A (objetivo 63X) ARN FISH. ATRX transcrito primario de ARN Xist rojo y en verde se visualizan en el 3 linajes = E, VE, TGC. Carolina del Surale barra = 10 micras. Ejemplo de TGC in vivo, donde se expresa ATRX monoallelically (Xa, punta de flecha) y guarda silencio sobre el Xist recubierta cromosoma X (Xi); varias señales ATRX visto en la Xa se deben a endoreplication. RP23-260I15 clon ATRX = BAC. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. expresión transcrito primario en TGC secundarios derivados de EPC. (A) Vista general de crecimiento TGC secundaria (objetivo x5). Barra de escala = 100 micras. (B) del asterisco indican ejemplo de TGC de acuerdo a su tamaño (objetivo 10X). Barra de escala = 60 micras. (C) Ejemplo de una hembra secundaria TGC ARN FISH con el uso de 3 sondas (doma Xisten color verde, que cubre el cromosoma X inactivado: Xi) que muestra endoreplication de G6PD y Huwe1 transcritos primarios (varias puntas de alfiler, en rojo y magenta). Mientras G6pd se expresa monoallelically, la expresión Huwe1 es bialélico en este núcleo RP24-157H12 Huwe1 = clon BAC;. G6pd = BAC clon RP23-13D21. Xi = flecha; Xa = punta de flecha (objetivo 63X). Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Nascent RNA FISH representa un método fácil y sensible para el análisis de células individuales de la actividad transcripcional en tejidos de embriones en diferentes etapas de desarrollo. El poder de este método es la capacidad de identificar diferentes linajes embrionarios en cualquier etapa particular de acuerdo con criterios morfológicos. Sin embargo, esto también requiere que un mínimo de la fluorescencia de fondo está presente. Cualquier fondo hace que la identificación de las diferentes regiones embrionarias y tipos de células difíciles. Para garantizar un mínimo de fondo, hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es la calidad de la sección criogénica y el segundo es la eficiencia (relación señal a ruido) del ARN de pescado, que depende del nivel de la expresión génica y la calidad de la sonda. En este último caso, las sondas son por lo tanto siempre probados en células cultivadas en cubreobjetos (células madre embrionarias o células somáticas) antes de su uso en secciones.
En este protocolo, proporcionamos THtécnicas e necesarios para realizar el análisis FISH de ARN en TGC a partir de dos tipos diferentes de preparación de la muestra (secciones de criostato y cultivos primarios de explantes de embriones). Tal análisis de células individuales permite cambios dinámicos en la expresión de genes en diferentes etapas post-implantación para ser evaluados.
Los métodos que describimos para generar TGC secundaria (en E7-7.5 etapas post-implantación) fueron utilizados en nuestro laboratorio para estudiar los patrones de inactivación del cromosoma X de un linaje extraembrionario que está constituido por TGC en las etapas posteriores a la implantación. desarrollo extraembrionario en roedores depende de la diferenciación de TGC. De hecho, TGC son esenciales para el desarrollo placentario y por lo tanto embrionario. Los defectos en la diferenciación TGC causan letalidad embrionaria (para una revisión véase la referencia 15). Actividad transcripcional de TGC utilizando ARN FISH nos ha permitido demostrar un estado de inactivación del cromosoma X inusual de este tipo de células durante el desarrollo del ratón 3.
in vivo en TGC TGC y en in vitro de explantes derivados de EPC. Este método podría extenderse al análisis de los ratones transgénicos y / o por la adición de moléculas inhibidoras en el medio de cultivo. Hemos utilizado con éxito este método de ARN FISH en otro tipo de TGC, como TGC primarios que aparecen en una etapa anterior de desarrollo del ratón, blastocyts E3.0, que pueden ser individualmente cultivaron durante 4-5 días durante los cuales desarrollaron consecuencia, las ICM estar rodeado de grandes TGC primaria 16,17. naciente transcripciones para diferentesgenes, así como Xist podrían ser visualizadas y cuantificadas utilizando el enfoque FISH mismo ARN 3.
Inmunofluorescencia Combinado y ARN FISH también se pueden realizar en secciones de criostato, así como in vitro TGC cultivadas 3. Esto demuestra que el método es bastante robusto, como transcritos primarios son altamente susceptibles a la degradación y existe un requisito absoluto de compuestos libres de RNasa. SI / ARN FISH proporciona información adicional acerca de los niveles de transcripción, localización celular y la expresión de proteínas, de forma simultánea en una célula dada. Aunque, las secciones de tejido incluido en parafina previamente se han utilizado para detectar el ARN naciente en los tumores humanos, manteniendo la morfología del tejido 18, en nuestras manos, secciones de criostato son más apropiados para la preservación tanto el ARN naciente y los epítopos requerido para la detección por anticuerpos durante inmunofluorescencia .
Además de ARN FISH, a raíz de immunofluorescence, ADN cromosómico de pescado también se puede realizar en TGC secundarias utilizando sondas marcadas con fluorocromos, similares a los utilizados para el ARN FISH 3. Las sondas fluorescentes pueden ser o bien plásmidos / fosmids o BACs, etiquetados con dUTPs fluorescentes tal como se utiliza aquí, y que se describen en Chaumeil et al., 8. Alternativamente, los oligonucleótidos marcados con fluorescencia se pueden utilizar 19. Dado que el ADN FISH no requiere cadena de especificidad, las sondas de oligonucleótidos se pueden diseñar para dirigirse a cualquiera de las dos cadenas complementarias en la región diana. Las sondas de ADN ramificado, donde amplificación de la señal se logra por dos rondas secuenciales de sondas específicas y el amplificador también se pueden utilizar para mejorar la relación señal a ruido de las señales de FISH 20. Alternativamente, sondas de ARN, tales como ribosondas se pueden utilizar aunque en nuestras sondas basadas en ADN garantizar un mejor compromiso entre la calidad de la señal, la especificidad y facilidad de uso.
Por último, acquisiti imagen en 3Den es esencial con el fin de obtener la información espacial requerida en estas células grandes, y se puede realizar utilizando una variedad de microscopios de fluorescencia, tales como el microscopio Apotome, o microscopios de epifluorescencia con deconvolución como el Deltavision (GEH), u otros microscopios adecuados para secciones de tejido de imágenes, y grandes (> 20 micras) TGC. Cabe señalar que para un solo loci de copias de ADN, la señal detectada por FISH punteada ARN naciente o FISH de ADN puede no ser detectado fácilmente por microscopía confocal.
En conclusión, los métodos que describimos aquí deben ser útiles tanto para el análisis detallado de TGS en un contexto de desarrollo, sino también en otras situaciones de enfermedad. Muchos de los genes que están involucrados en el desarrollo y la función de TGC en roedores se conservan entre roedores y humanos, tales como factores de transcripción, proteasas y moléculas de adhesión celular 21. Ratón TGC son un modelo celular para el estudio de los genes que regulan el desarrollo de la placenta de unaPor lo tanto, d dar una visión de las enfermedades de la placenta humana. Además, por el hecho de que estas células se endoreplicating y desde algunas células cancerosas involucran programas endocycle, además de procesos de amplificación de genes, los métodos que describimos debería también ser útil en las investigaciones de células individuales necesarios para explorar mecanismos que conducen a inestabilidad del genoma en células de cáncer .
Acknowledgments
Agradecemos a Sophie Gournet para obtener ayuda con ilustraciones, Julie Chaumeil por leer el manuscrito, las instalaciones de alojamiento de los animales y la plataforma de imágenes de la unidad. Este trabajo ha recibido el apoyo en el marco del programa «Investissements d'Avenir» puesto en marcha por el Gobierno francés y puesto en práctica por la ANR con las referencias ANR-10-LabX-0044 y PSL ANR-10-IDEX-0001-02, la EpiGeneSys 7PM no. 257082 red de excelencia a EH, una ERC avanzada Investigador de adjudicación. 250367 y el 7PM de la UE SYBOSS subvención no. 242.129 a EH Los autores desean reconocer la célula y Tejidos de imagen Plataforma del Departamento de Genética y Biología del Desarrollo (UMR3215 / U934) del Instituto Curie, miembro del Francia-Bioimagen (ANR-10-INSB-04), en busca de ayuda con la luz microscopía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
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