Abstract
Le placenta dérive d'une lignée extra-embryonnaire, le trophectoderme. Dans le péri-implantatoire blastocyste murin, les cellules trophectoderme murales se différencient en cellules géantes trophoblastiques primaires (VAM), tandis que le trophectoderme polaire recouvrant la masse cellulaire interne continue à proliférer dans la différenciation ultérieure des VAM secondaires. VAM jouent un rôle clé dans le placenta et le développement sont essentiels pour une grossesse réussie. Etude de la régulation transcriptionnelle des gènes spécifiques au cours du développement post-implantation peut donner un aperçu de développement VAM. Les cellules du cône ectoplacentaire (EPC) à partir d' embryons à 7-7,5 jours de gestation (E7-7.5), dérivé du trophectoderme polaire, se différencient en VAM secondaires 1. VAM peut être étudiée in situ, sur des sections de cryostat d'embryons à E7 bien que le nombre de VAM est très faible à ce stade. Un autre moyen d'analyse VAM secondaire est d'utiliser des cultures à court terme de EPCs individuels de E7 embryons. Nous proposons une technique pour étudier l'état de la transcription de gènes d'intérêt à la fois in vivo et in vitro au niveau d'une seule cellule en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH ARN) pour visualiser les transcriptions naissantes. Cette technique permet une lecture directe de l'expression génique et de l'évaluation de l'état chromosomique de VAM, qui sont de grandes cellules endoreplicating permet. En effet, un élément clé de la différenciation terminale de VAM est qu'ils sortent du cycle cellulaire et subissent plusieurs cycles d'approche endoreplication.This peut être appliquée pour détecter l'expression d'un gène exprimé de autosomes et / ou des chromosomes sexuels et peuvent fournir des informations importantes sur le développement des mécanismes ainsi que les maladies du placenta.
Introduction
cellules géantes trophoblastiques Mammifères (VAM) forment une barrière entre les tissus maternels et embryonnaires. Ils médient l'implantation et l'invasion du conceptus dans l'utérus et jouent un rôle crucial dans le développement de la formation du placenta. Ils produisent plusieurs facteurs de croissance (cytokines) et des hormones de la famille et de stéroïdes prolactine / placentaire Lactogen, nécessaire à la croissance embryonnaire et la survie. VAM sont grandes, mononucléées et cellules polyploïdes avec un cycle cellulaire, l'endocycle, qui se compose d'une alternance de phases S et G. En effet, VAM sont endoreplicating cellules, capables de subir de multiples cycles de synthèse d'ADN sans aucune division 2. Afin d'étudier l'état de la transcription de gènes in vivo, in VAM par rapport à d' autres types de cellules embryonnaires et extra - embryonnaires, naissant FISH d'ARN peut être réalisée in vivo sur des sections cryostat 3 à des stades spécifiques post-implantation. VAM sont facilement reconnaissables sur les sections en raison de Their grande taille et leur activité de gènes de transcription peuvent être enregistrés mais leur nombre aux premiers stades post-implantation est faible. Rareté de VAM sur E7 sections embryonnaires, nous a amenés à effectuer des cultures à court terme des tissus trophectodermal embryonnaires pour obtenir des VAM différenciés afin d'étudier la régulation de l'expression des gènes au cours du développement de trophectoderme. Par ailleurs, afin de rester en tant physiologique que possible, des lignées cellulaires établies ie trophectoderme cellules souches (TS) ne sont pas toujours adaptés pour étudier les mécanismes de développement génération de VAM secondaires constituent un outil précieux pour étudier les grossesses pathologiques associées à des défauts dans VAM en raison de gène anormal la régulation chez la souris.
Les cellules du trophoblaste du cône ectoplacentaire (EPC) sont des précurseurs de VAM secondaires 4. La différenciation spontanée des EPCs cultivées à VAM secondaire a déjà été rapporté 5. Cependant, contrairement aux TGC primaires, des études sur les différen TGC secondairenégo- sont restées limitées, presumablydue aux difficultés d'isolement explants EPC libre de tout tissus maternels ou embryonnaires. Nous avons adapté ces méthodes, afin d'effectuer l'ARN FISH sur des VAM secondaires provenant de l'embryon individuel à E7, un stade de développement post-implantation où VAM sont très rares, mais pourraient être générés à partir de précurseurs de l'EPC. ARN FISH pour analyser les transcriptions primaires nucléaires n'a jamais été fait au niveau du niveau de la cellule unique sur VAM secondaires. Ceci permet une analyse précise de la transcription et a été utilisé pour montrer l'instabilité épigénétique de VAM à des étapes post-implantation 3.
Un exemple classique de l' épigénétique chez les mammifères, l'inactivation du chromosome X (XCI) est étudié dans le laboratoire Heard 6. Dans ce processus, l'un des 2 chromosomes X chez les femelles est inactivé. La non codante Xist transcription enrobe le chromosome X à partir de laquelle elle est exprimée dans des cellules femelles et déclenche le silençage de la plupart des gènes. Utilisation de l'ARN FISH,transcriptions naissantes de gènes liés à l'X peuvent être étudiés comme on peut l'accumulation de l' ARN Xist sur le chromosome X inactif (Xi). Nous décrivons ici une procédure pour effectuer l'ARN FISH sur des coupes d'embryons post-implantation et sur les cultures à court terme de la CBE. Ce protocole adapté de celles qui ont été utilisées pour étudier XCI dans la différenciation des cellules souches embryonnaires femelles et les embryons de pré - implantation 7-11. Nous fournissons des exemples de XCI dans les embryons femelles in vivo, ainsi que in vitro VAM dans.
Protocol
procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec la protection des animaux approuvé et utilisent comité des protocoles Institut Curie (ACEE-IC) (C 75-05-18). Le travail a également été menée sous l'approbation du ministère français de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche pour l'utilisation des organismes génétiquement modifiés (numéro de contrat 5549CA-I).
1. Préparation des Sections de cryostat
- Recueillir des embryons à partir d' ovuler naturellement F1 C57BL / 6 x DBA / 2J , comme décrit dans Shea et al., 12. Au jour 7 de la gestation (E7), sacrifier vieux 8-12 semaine souris par dislocation cervicale. Recueillir l'ensemble conceptus ie decidua 12.
- Isolât conceptus E7, comme décrit dans Shea et al., 12. Placez-les dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant du PBS.
- Congeler la souris conceptus E7 pour les sections de cryostat.
- Préparer adaptés puits en feuille d'aluminium 1cm de hauteur ( «fait maison» en utilisant un verre Pasteur pipet). Déposer une goutte de milieu de congélation de tissu sur le fond de ce petit récipient. Déposez le conceptus dans le bon sens (ie, pour les sections longitudinales du conceptus devrait maintenir son orientation horizontale).
- Remplir le puits contenant le conceptus avec le tissu du milieu de congélation. Suspendre l' aide de pinces à vapeur au- dessus du N2 liquide afin de lui permettre de se congeler lentement - puis immerger le bloc dans le N2 liquide pendant quelques secondes jusqu'à ce qu'il devienne blanc. Par la suite, transférer le bloc dans un flacon de congélation et conserver à -80 ° C (peut stocker pendant plusieurs mois).
- Avant cryo-découpe, placer le bloc congelé contenant le conceptus à -20 ° C dans le cryostat pendant 30 minutes. Effectuer cryosections d'une épaisseur de 8 pm. Dépôt 4 sections sur une lame pour permettre la fixation efficace. Sections de place assez près pour se glisser sous un 18 x 18 mm 2 lamelle.
- Vérifiez la qualité de lasections (intactes et sans rayures) et l'orientation de l'embryon (sections longitudinales) avec un stéréomicroscope et choisir les sections appropriées pour une analyse ultérieure. Aussi rapidement que possible les déposer dans un bocal de Coplin et effectuer ARN FISH (voir 3.3.2).
2. Préparation de VAM secondaire
- Isoler le Conceptus (voir 1.1 et 1.2).
- Disséquer le E7 ectoplacentaire Cone (EPC)
- Utilisez un stéréomicroscope et des boîtes de Petri contenant du PBS stérile. Disséquer le decidua avec une pince. Pierce l'échantillon et des pinces ouvertes à déchirer les deux côtés de la decidua à part.
- Shell sur l'embryon. Utilisez des conseils de pinces fines fermées (Dumont n ° 5) dans une action de ciseaux pour séparer l'EPC de l'embryon proprement dit. Utilisez un soin particulier pour obtenir un échantillon parfaitement propre, distincte de tissus maternels, ainsi que de chorion et le jaune sac. Laver explants EPC dans du PBS.
- Avec une petite cuillère, transférer EPC disséquée individu à un-wel 4l assiette contenant une lamelle stérile dans le milieu.
- Derive VAM de EPCs Cultures à court terme.
- Préparer des plaques 4 puits contenant des lamelles. 12 stériliser mm de diamètre autour de lamelles de verre par immersion dans de l'éthanol, suivie d'un séchage à la flamme.
- Ajouter 0,5 ml de milieu à chaque puits EPC (milieu EPC: RPMI 1640 supplémenté avec 15% de FCS, 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol et des antibiotiques).
- unique de dépôt, disséqués-EPCs au centre de la lamelle dans le puits le long du milieu de culture. Utilisez une pince fine pour appliquer la CBE sur la lamelle de verre. Culturefor 3-5 jours à 37 ° C, 5% de CO 2. Explant individuelle forme une excroissance qui se propage comme une monocouche de VAM aplatie (figure 2A).
3. ARN FISH
NOTE: Les protocoles sont basés sur ceux décrits pour les cellules souches embryonnaires (CSE) à Chaumeil et al, 8 et Pollex et Heard 13..
- avancée Preparation de solutions mères
- Préparer un tampon d'acétate de sodium 3 M pH 5,2.
- Préparer un tampon d'hybridation 2x contenant 40% (p / v) sulfate de dextrane sodique, 20 x BSA, 400 mM ribonucléoside vanadyle complexe (VRC) en 4x solution saline de citrate de sodium (SSC).
- Préparer un milieu de montage contenant 90% (v / v) de glycerol, 0,1% (p / v) de p-phénylènediamine, pH 9 dans du PBS.
- Des solutions fraîchement préparées
- Préparer la solution fixateur composé de 3% de paraformaldehyde fraîchement préparé (PFA) dans du PBS. Préparer une solution de perméabilisation contenant 0,5% de Triton-X-100 dans du PBS supplémenté avec 2 mM de VRC. Préparer le tampon de lavage en mélangeant 50% de formamide (FA) et 2x SSC et ajuster le pH à 7,2-7,4.
- Préparer une solution de contre-coloration à l'ADN consistant en 1 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) dans 2 x SSC.
- Fixation et perméabilisation dans la préparation de FISH
- Pour les cellules sur des lamelles, laver les cellules dans 1x PBS pendant 5 mdans. Fixer les cellules sur des lamelles couvre-embryonnaires ou des sections sur des lames pendant 10 minutes dans un fixateur (PFA 3%), la solution à la température ambiante.
- Rincer les cellules trois fois avec PBS 1x. Perméabiliser les cellules pendant 5 min dans une solution de perméabilisation glacée sur la glace. Laver les cellules trois fois avec 70% d'éthanol. lamelles de magasins dans les plaques 4 puits et diapositives dans la boîte de transport 4-diapositive dans 70% d'éthanol à -20 ° C.
NOTE: Lamelles et diapositives peuvent être stockés pendant plusieurs mois à -20 ° C. Les plaques et les boîtes qui les contiennent doivent être scellés avec du parafilm pour éviter l'éthanol évaporation.
- Étiquetage DNA Probe
- Etiqueter sondes ADN par translation de coupure en utilisant des nucléotides fluorescents. Suivez les instructions du fabricant (voir le tableau 1) 8.
- Pour un mélange de réaction de 50 ul, ajouter 1-2 ug du plasmide, les chromosomes bactériens artificiels (BAC) ou le déplacement multiple amplification (MDA) (pour l'amplification d'ADN; voir 3.4.4) l'ADN à 17,5 ul d'eau, 2,5 ul de 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 pi 10 mM de chaque mélange de dNTP (dGTP, dATP, dCTP), mM dTTP 5 pi 10, 5 ul 10x tampon de traduction nick et 8 pl nick traduction enzyme.
- Incuber pendant 16 heures à 15 ° C dans l'obscurité. Inactiver la réaction par congélation à -20 ° C. sondes de magasins pour mois à -20 ° C.
- MDA
NOTE: Pour l'ADN de BAC, quantité d'ADN obtenue après préparation classique est faible, donc on peut utiliser une étape d'amplification de l'ADN avant le marquage en utilisant MDA. Utilisez un kit commercial et suivez les instructions du fabricant (voir le tableau 1). - Mélanger l'ADN de BAC 0,5 pi avec 9,5 ul de tampon d'échantillon. Chauffer 3 min à 95 ° C. étancher immédiatement sur la glace; laisser sur la glace 10 min. Préparer un tampon de réaction / mélange enzymatique: (9,5 pi + 0,5 mélange d'enzymes pi) et garder sur la glace.
- Mélanger 10 ul de mélange d'ADN + 10 ul de tampon de réaction / mélange d'enzymes. Incuber à 30 ° C d'au moins 20 heures. Inactiver enzyme par exemple de chauffage 10 min à 65 & #176; C. échantillon Refroidir à 4 ° C avant de les stocker à -20 ° C.
- Vérifiez MDA par digestion. Ajouter 1 ul MDA, 2 ul 10x tampon, 2 ul Hind III et 15 pi de H 2 O. Incuber à 37 ° C pendant une nuit. Exécuter lentement sur un gel d'agarose à 0,8 à 1% pour confirmer l'amplification d'ADN exacte. Des fragments d'ADN clairs de masse moléculaire élevée doivent être observées sur le gel.
- Préparation de la sonde
- Utilisez 0,1 ou 1 pg sonde par lamelle ou glisser.
NOTE: Ajouter 2-5 pg de Cot-1 DNA si la concurrence est nécessaire , par exemple, la plupart des sondes car ils peuvent contenir des séquences répétées qui d'hybrider autrement croix et augmenter fond.- Pour la précipitation, ajouter 5 ug d'ADN de sperme de saumon, 1/10 de volume de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2 et 3 volumes d'éthanol. Centrifuger à 16 000 x g et 4 ° C pendant 25 min. Laver granulés avec 70% d'éthanol et centrifuger à nouveau pendant 5 min.
- culot sec pendant 2 min dans un vac concentrateur / vitesse. Resuspendre sous forme de 100%amide dans la moitié du volume requis pour l' hybridation (par exemple, 2,5 pi pour lamelle ou 7 pi pour les sections embryonnaires sur la diapositive). Placer 30 min à 37 ° C sous agitation dans un ThermoMixer. Dénaturer pendant 7 minutes à 75 ° C.
- Quench sur la glace, ou si la concurrence est requise mis directement à 37 ° C pendant 30-60 min. Mélanger la solution de la sonde avec un volume égal de solution d'hybridation 2x.
- Utilisez 0,1 ou 1 pg sonde par lamelle ou glisser.
- Hybridation et Washes
- Déshydrater; des lamelles dans les puits et les lames dans une jarre de Coplin, par lavage séquentiel dans 1x 80%, 1x 95% et 2x éthanol à 100% pendant 5 minutes chacun. lamelles et diapositives sécher complètement.
- Pour l'hybridation, appliquer la sonde mélange d'hybridation de 5 pi (voir 3.5) sur une lame et abaisser la lamelle, avec des cellules face dans le mélange d'hybridation. Pour les sections sur diapositive, appliquer 14 pi sonde mélange d' hybridation (voir 3.5) et couvrir avec un 18 x 18 mm 2 lamelle.
- Placer les lames dans une chambre humide (papier tissu trempé dans50% FA / 2x SSC) et incuber à 37 ° C pendant la nuit, dans l'obscurité.
- Washes Post-hybridation:
- Ajouter 1 ml de 50% FA / SSC 2x sur la lamelle sur la lame pour le desserrer; retirer la lamelle soigneusement de la diapositive (en prenant soin de ne pas gratter les cellules) et placez-cellule vers le haut dans une plaque 4 puits contenant 50% FA / 2x SSC. Pour les sections sur diapositive, retirer la lamelle d'une manière similaire et placer la lame dans une jarre de Coplin contenant 50% FA / 2x SSC.
- Effectuer 3 lavages, chacun pour 7 min avec préchauffée 50% FA / 2x SSC à 42 ° C ou 44 ° C pour lamelle ou glisser, respectivement.
- Effectuer 3 lavages avec préchauffée 2x SSC pendant 5 minutes chacun à 42 ° C ou 44 ° C pour lamelle ou glisser, respectivement.
- les noyaux par lavage à contre-colorant dans 2 x SSC avec 1 pg / ml de DAPI pendant 3 min à température ambiante. Rincer deux fois avec 2x SSC.
- Montage de Lamelles et Diapositives
- Pour les petites lamelle de culture VAM, appliquer 5 & #181; l milieu de montage sur une lame. Placez la cellule côté de la lamelle sur le dessus de la goutte.
- Pour diapositive avec sections, appliquer 15 pi de milieu sur la glissière de montage. Placer un mm 2 lamelle 22 x 22 sur le dessus de la goutte.
- Éviter les bulles. Essuyez solution de montage en excès hors tension. Sceller la lamelle avec une petite quantité de vernis à ongles. Si possible, l'image glisse immédiatement ou conserver pendant plusieurs mois à -20 ° C.
4. Microscopie et analyse
- Acquérir séquentielles images 3D axe z à 0,3 um en utilisant un microscope à fluorescence (objectif 63X) et effectuer l'analyse de 3D piles d' images en utilisant le logiciel ImageJ 14.
Representative Results
VAM peut être identifié sur des sections E7 sur la coloration DAPI en raison de leur localisation dans le conceptus et leur grande taille. Ceci est illustré sur la figure 1A sur une section longitudinale. ARN FISH a été réalisée sur ces sections embryonnaires afin d'étudier l'inactivation du chromosome X dans cette lignée extra-embryonnaire.
Diapositives ou plusieurs lamelles peuvent être traitées en même temps. En utilisant différents colorants pour marquer l'ARN de gènes différents, on peut détecter différents transcrits primaires dans le même noyau. Au moins 2 sondes peuvent être mélangés, par exemple Xist couplé à SG (signal vert) et ATRX couplé à SR (rouge signal). Un exemple d'une TGC femelle est représentée sur la figure 1B où 2 autres lignées sont représentées, l'embryon proprement dit (E) et l'endoderme viscéral (VE). Un noyau TGC est représenté avec l' ARN Xist couvrant la X chromOSOME qui est inactive (Xi) tandis que l'autre chromosome X qui est activé (Xa) affiche quelques petits points. Géniques ATRX transcrits primaires liées à l'X sont exprimés à partir du chromosome X actif (non décoré par Xist) en plusieurs exemplaires en raison de endoréplication. Ceci illustre l' expression monoallélique par exemple, l' inactivation de ATRX sur un chromosome X.
Depuis VAM sont hétérogènes en taille comme illustré sur la figure 2B, seuls les plus grands sont enregistrés. Trois sondes peuvent également être utilisées comme cela est illustré sur la figure 2C pour TGC secondaire. Dans ce cas, Xist -SG (vert), deux gènes liés à l'X: G6PD -SR (rouge) et Huwe1 -Cy (magenta) ont été analysés en même temps dans le même noyau. Alors que la G6PD est monoallelically exprimé comme indiqué ici (et montré précédemment dans VAM secondaire 3) Huwe1 est biallelically exprimé démontrant sa propriété pour échapper à XCI. Endoréplication, avec plusieurs pointes d' épingle -à- dire, des transcriptions naissantes copies, est également évidente.
Figure 1. expression de transcription primaire en VAM de la section féminine embryonnaire E7. (A) Coupe longitudinale du conceptus E7 colorées avec DAPI. L'embryon et les tissus extra-embryonnaires sont entourés par le tissu de la mère, la caduque. La localisation des différentes lignées se fait lors de la coloration DAPI avec l'objectif 5X. VAM sont identifiés en raison de leur grande taille. Ch, chorion, E, embryon, CBE, cône ectoplacentaire, VE, endoderme viscéral, TGC, cellules géantes trophoblastiques. Barre d'échelle = 100 um. (B) de grossissement supérieur de la zone encadrée-in A (objectif 63X) ARN FISH. Transcrit primaire ATRX dans l' ARN Xist rouge et en vert sont visualisés sur le 3 lignées = E, VE, TGC. Caroline du Sudbar à bière = 10 pm. Exemple d'un TGC in vivo où ATRX est monoallelically exprimé (Xa, arrowhead) et silencieux sur le Xist revêtu de chromosome X (Xi); plusieurs signaux ATRX vus sur le Xa sont dues à endoréplication. ATRX = BAC clone RP23-260I15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. expression de transcription primaire dans VAM secondaires dérivés de la CBE. (A) Vue générale de la croissance VAM secondaire (objectif x5). Barre d'échelle = 100 um. Exemple de VAM (B) Asterisk indique en fonction de leur taille (objectif 10X). Barre d'échelle = 60 pm. (C) Exemple d'une femelle secondaire TGC ARN FISH avec l'utilisation de 3 sondes (Xist domaen vert, couvrant le chromosome X inactivé: Xi) montrant endoréplication de G6PD et Huwe1 transcrits primaires (plusieurs petits points, en rouge et magenta). Alors que la G6PD est exprimée monoallelically, expression Huwe1 est biallélique dans ce noyau Huwe1 = BAC clone RP24-157H12;. G6PD = BAC clone RP23-13D21. Xi = flèche; Xa = arrowhead (objectif 63X). Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Naissant ARN FISH représente une méthode simple et sensible pour l'analyse cellulaire unique de l'activité transcriptionnelle dans les tissus embryonnaires à différents stades de développement. La puissance de cette approche est la capacité d'identifier différentes lignées embryonnaires à tout stade particulier selon des critères morphologiques. Toutefois, cela exige également que minime fluorescence de fond est présent. Un tel contexte rend l'identification des différentes régions embryonnaires et types de cellules difficiles. Pour assurer un minimum de fond, il y a deux étapes critiques dans ce protocole. Le premier est la qualité de la cryosection et le second est le rendement (rapport signal sur bruit) de l'ARN de poisson, qui dépend du niveau d'expression du gène et la qualité de la sonde. Pour ce dernier, les sondes sont donc toujours testées sur des cellules cultivées sur des lamelles couvre-objet (cellules souches embryonnaires ou des cellules somatiques) avant utilisation sur les sections.
Dans ce protocole, nous fournissons ee techniques nécessaires pour effectuer une analyse FISH d'ARN sur VAM de deux types différents de préparation des échantillons (sections de cryostat et des cultures primaires d'explants embryonnaires). Une telle analyse cellulaire unique permet des changements dynamiques dans l'expression des gènes à différents stades post-implantation à évaluer.
Les méthodes que nous décrivons pour générer des VAM secondaire (à E7-7.5 stades post-implantation) ont été utilisés dans notre laboratoire pour étudier les modèles X-chromosome inactivation d'une lignée extra-embryonnaire qui est constitué de VAM à des étapes post-implantation. développement extra-embryonnaire chez les rongeurs dépend de la différenciation des VAM. En effet, VAM sont essentiels pour le développement placentaire et donc embryonnaire. Des défauts dans la différenciation TGC provoquent une létalité embryonnaire (pour revue , voir référence 15). L' activité transcriptionnelle de VAM en utilisant l' ARN FISH nous a permis de démontrer un chromosome X état d'inactivation inhabituelle de ce type de cellules au cours du développement de la souris 3.
in vivo VAM et VAM in vitro dérivés de EPC explant. Ce procédé pourrait être étendu à l'analyse de souris transgéniques et / ou par l'addition de molécules d'inhibiteur dans le milieu de culture. Nous avons utilisé avec succès cette méthode d'ARN FISH sur un autre type de VAM, comme VAM primaires qui apparaissent à un stade précoce du développement de la souris, blastocyts de E3.0, qui peuvent être cultivées individuellement pendant 4-5 jours au cours de laquelle ont développé excroissance, les ICM étant entouré de grands VAM primaires 16,17. transcriptions Nascent pour différentsgènes ainsi que Xist pourraient être visualisées et quantifiées en utilisant l'approche FISH même ARN 3.
Immunofluorescence combiné et de l' ARN FISH peuvent également être effectuées sur des sections de cryostat, ainsi que in vitro VAM cultivées 3. Cela démontre que la méthode est très robuste, comme transcrits primaires sont très sensibles à la dégradation et il est une exigence absolue de composés libres RNase. IF / ARN FISH fournit des informations supplémentaires sur les niveaux de transcription, localisation cellulaire et de l'expression de la protéine, simultanément dans une cellule donnée. Bien que des sections de tissus inclus dans la paraffine ont été précédemment utilisés pour détecter l' ARN naissant dans des tumeurs humaines tout en conservant la morphologie des tissus 18, dans nos mains, des sections de cryostat sont plus appropriés pour préserver à la fois l'ARN naissant et les epitopes requis pour la détection par des anticorps au cours d' immunofluorescence .
En plus de l'ARN FISH, suivant immunofluorescence, l' ADN chromosomique FISH peut également être effectuée sur des VAM secondaires en utilisant des sondes marquées avec des fluorochromes, similaires à celles utilisées pour l' ARN FISH 3. Des sondes fluorescentes peuvent être des plasmides / fosmides ou BACs, marquées avec des dUTP fluorescents utilisés ici, et décrits dans Chaumeil et al., 8. Alternativement, les oligonucléotides marqués par fluorescence peuvent être utilisés 19. Étant donné que l'ADN FISH ne nécessite pas une spécificité de brin, les sondes oligonucléotidiques peuvent être conçues pour cibler l'un des deux brins complémentaires de la région cible. Des sondes d'ADN ramifiées, où l' amplification du signal est obtenue par deux cycles séquentiels de sondes spécifiques et d' amplification peuvent également être utilisés pour améliorer le rapport signal sur bruit de 20 signaux FISH. Alternativement, les sondes ARN tels que ribosondes peuvent être utilisés bien que dans nos sondes à base d'ADN garantir un meilleur compromis entre la qualité du signal, la spécificité et la facilité d'utilisation.
Enfin, l'image 3D acquisitiActivée est essentiel afin d'obtenir des informations spatiales nécessaires dans ces grandes cellules, et peut être réalisée en utilisant une variété de microscopes à fluorescence, tels que le microscope Apotome, ou des microscopes à épifluorescence avec déconvolution comme le Deltavision (GEH) ou d'autres microscopes conviennent pour des coupes de tissus d'imagerie, et grande (> 20 um) VAM. Il convient de noter que pour un seul locus d'ADN de copie, le signal de punctate détectée par FISH d'ARN ou d'ADN naissante FISH ne peut pas être facilement détectée par microscopie confocale.
En conclusion, les méthodes que nous décrivons ici devraient être utiles à la fois pour l'analyse détaillée de TGS dans un contexte de développement, mais aussi dans d'autres situations de la maladie. De nombreux gènes qui sont impliqués dans le développement et la fonction TGC chez les rongeurs sont conservés entre les rongeurs et les humains, tels que des facteurs de transcription, des protéases et des molécules d'adhésion cellulaire 21. Souris VAM sont un modèle cellulaire pour les gènes qui régulent étudient placentaire le développement d'und donnent donc un aperçu des maladies placentaires humaines. En outre, en raison du fait que ces cellules sont endoreplicating et puisque certaines cellules cancéreuses engagent des programmes de endocycle, en plus des processus d'amplification génique, les méthodes que nous décrivons devraient également être utiles dans les enquêtes de cellules individuelles nécessaires pour explorer les mécanismes conduisant à l'instabilité du génome dans les cellules cancéreuses .
Acknowledgments
Nous remercions Sophie Gournet de l'aide avec des illustrations, Julie Chaumeil pour lire le manuscrit, l'installation de logement des animaux et la plate-forme d'imagerie de l'unité. Ce travail a reçu le soutien dans le cadre du programme «Investissements d'Avenir» lancé par le gouvernement français et mis en œuvre par l'ANR avec les références ANR-10-LabX-0044 et PSL ANR-10-IDEX-0001-02, le EpiGeneSys FP7 pas. 257082 Réseau d'excellence à EH, une ERC Advanced Investigator award no. 250367 et EU FP7 SYBOSS accordent pas. 242129 EH Les auteurs tiennent à remercier le cellulaire et tissulaire Plate-forme de la Génétique et Biologie du développement Département (UMR3215 / U934) de l'Institut Curie, membre de France-Bioimaging (ANR-10-INSB-04), l'imagerie de l'aide avec la lumière microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
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