Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של Published: August 31, 2016 doi: 10.3791/54386
Automatic Translation
1, 1
1Unité de Génétique et Biologie du Développement, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934

Abstract

השליה נובעת שושלת חוץ עוברית אחד, trophectoderm. בשנת הבלסטוציסט murine פרי-ההשתלה, תאים trophectoderm ציור קיר להתמיין לתאי ענק trophoblast העיקרי (TGCs) בעוד trophectoderm הקוטב שמעל מסת התאים הפנימית ממשיך להתרבות הבחנה מאוחר יותר לתוך TGCs משנית. TGCs לשחק תפקיד מפתח בפיתוח השליה חיוני הריון מוצלח. חקירת תקנת תעתיק של גנים ספציפיים במהלך הפיתוח לאחר השתלה יכולה לתת תובנה פיתוח TGCs. תאים של חרוט ectoplacental (EPC) מעוברים ב 7-7.5 ימים של ההיריון (E7-7.5), נגזר trophectoderm קוטב, להתמיין TGCs משנית 1. TGCs ניתן ללמוד באתרו, על סעיפי cryostat של עוברי E7 אם כי מספר TGCs נמוך מאוד בשלב זה. קיימות דרכים אחרות של ניתוח TGCs המשנית היא להשתמש לטווח קצר תרבויות של EPCs הפרט מעובר E7ים. אנו מציעים טכניקה לחקור את סטטוס התעתיק של גנים של עניין הוא in vivo ו במבחנה ברמת התא הבודד באמצעות ניאון הכלאה באתרו (RNA FISH) כדי לחזות תמלילי מתהווה. טכניקה זו מספקת הודעה ישירה של ביטוי גנים ומאפשרת הערכה על מצב כרומוזומליות של TGCs, אשר הוא תאי endoreplicating גדולים. אכן, תכונת מפתח של בידול הטרמינל של TGCs היא שהם לצאת ממעגל התא לעבור סבבים רבים של הגישה endoreplication.This ניתן ליישם כדי לזהות ביטוי של כל גן לידי ביטוי מתוך אוטוזומים ו / או כרומוזומי המין והוא יכול לספק מידע חשוב לתוך התפתחותי מנגנונים כמו גם מחלות השליה.

Introduction

תאים ענקים trophoblast יונקים (TGCs) מהווים מחסום בין רקמות אימהיות עובריות. הם לתווך השתלה ופלישה של conceptus לתוך הרחם ממלא תפקידים קריטיים בהתפתחות להיווצרות של השליה. הם מייצרים גורמי גדילה אחדים (ציטוקינים) והורמונים של המשפחה לקטוגן הפרולקטין / שלית הסטרואידים, הכרחית לצמיחה עוברית והישרדות. TGCs גדול, mononucleated ו polyploid תאים עם מחזור תא, endocycle, שמורכב לסירוגין שלבי S ו- G. ואכן, TGCs הוא endoreplicating תאים, מסוגלים לעבור סבבים רבים של סינתזת ה- DNA ללא כל חלוקה 2. על מנת לחקור את מצב תעתיק של גנים in vivo, ב TGCs לעומת סוגי תאים עובריים extraembryonic אחרים, FISH RNA המתהווה ניתן לבצע in vivo על סעיפים cryostat 3 בשלבים שלאחר ההשתלה ספציפיים. TGCs ניכרים בקלות על סעיפים בשל their גודל גדול ופעילות גן התעתיק שלהם ניתן להקליט אך מספרם בשלבים שלאחר השתלה מוקדם הוא נמוך. מיעוט TGCs על סעיפים עובריים E7, הוביל אותנו לבצע לטווח קצר תרבויות של רקמות trophectodermal עובריים להשיג TGCs הבדיל כדי ללמוד את הרגולציה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות trophectoderm. יתר על כן, על מנת להישאר פיסיולוגי ככל האפשר, שורות תאים הוקמו כלומר trophectoderm תאי גזע (TS) הם לא תמיד מתאימות לחקור דור מנגנוני התפתחותי של TGCs המשנית לספק כלי רב ערך כדי ללמוד הריונות פתולוגי קשורים לפגמי TGCs בשל גן נורמלי תקנה בעכברים.

תאים Trophoblast של חרוט ectoplacental (EPC) הם סימנים מקדימים של TGCs משנית 4. התמיינות ספונטנית של EPCs תרבותי משנית TGCs כבר בעבר דווח 5. עם זאת, בניגוד TGCs העיקרי, מחקרים על בידול משני TGCtiation נותר מוגבל, presumablydue לקשיים לבודדים explants EPC ללא כל רקמות של האם או עובר. מתאמנים שיטות אלה, על מנת לבצע FISH RNA על TGCs משנה מכחו מעובר פרט E7, שלב התפתחותי לאחר השתלה שבו TGCs מעט מאוד אבל יכול להיות שנוצר מבשרי EPC. FISH RNA לנתח תמלילים עיקריים גרעיניים מעולם לא נעשה ברמה ברמת התא הבודדה על TGCs המשנית. אופציה זו מאפשרת ניתוח מדויק של שעתוק שימש כדי להראות את חוסר היציבות אפיגנטיים של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה 3.

דוגמה קלאסית של אפיגנטיקה ביונקים, את איון כרומוזום X (xci) נלמדת במעבדה הרד 6. בתהליך זה אחד 2 הכרומוזומים X ב הנקבה מומת. המגזר השקלי הלא צמוד קידוד מעילים תמליל Xist כרומוזום X שממנו הוא בא לידי ביטוי בתאים נקבה ומפעיל השתקת ברוב הגנים. באמצעות FISH RNA,תמלילי מתהווה של גני X-linked יכולים להיחקר כפי שניתן את ההצטברות של Xist RNA על כרומוזום X הפעיל (Xi). אנו מתארים כאן הליך לבצע RNA FISH על סעיפים של עוברים לאחר ההשתלה ועל לטווח קצר תרבויות של EPC. פרוטוקול זה מותאם מאלה ששמשו ללמוד xci להבדיל מתאי גזע עובריים נשיים עוברת preimplantation 7-11. אנו מספקים דוגמאות של xci בעוברים נקבה in vivo, כמו גם במבחנה TGCs.

Protocol

נהלים בעלי חיים בוצעו בהתאם הטיפול בבעלי החיים המוסדי המאושר ולהשתמש ועדה של קירי Institut (CEEA-IC) הפרוטוקולים (C 75-05-18). העבודה גם נערך תחת אישור ממשרד צרפתית להשכלה גבוהה ומחקר לשימושם של אורגניזמים מהונדסים גנטית (מספר הסכם 5549CA-I).

1. הכנת סעיפי cryostat

  1. איסוף עוברים מן מבייצת באופן טבעי F1 C57BL / 6 x DBA / 2J עכברים כמתואר שיאה et al., 12. ביום 7 של ההריון (E7), להקריב העכבר 8-12 בן שבוע על ידי נקע בצוואר הרחם. אסוף את decidua כלומר conceptus כולו 12.
  2. לבודד E7 conceptuses, כמתואר שיאה et al., 12. מניחים אותם בצלחת פטרי 60 מ"מ המכיל PBS.
  3. להקפיא את conceptus העכבר E7 סעיפים cryostat.
    1. הכן בארות רדיד אלומיניום מותאמות 1cm בגובה ( "תוצרת בית" באמצעות פיפס זכוכית פסטרet). להפקיד ירידה של המדיום הקפאת רקמות בחלק התחתון של מיכל הקטנה הזו. להפקיד את conceptus בכיוון הנכון (כלומר, עבור סעיפים אורכים conceptus צריך לשמור על הכיוון האופקי שלה).
    2. מלא את המכיל את conceptus היטב עם רקמות הקפאה בינוניות. להשעות אותו עם מלקחיים אדי מעל נוזלי N 2 על מנת לאפשר לו לקפוא לאט - אז לטבול לחסום בנוזל N 2 למשך מספר שניות עד שהוא הופך לבן. בהמשך לכך, להעביר את הבלוק לתוך בקבוקון הקפאה ולאחסן ב -80 ° C (ניתן לאחסן במשך מספר חודשים).
  4. לפני-חתך קריו, את הגוש הקפוא המכיל את conceptus ב -20 ° C ב cryostat למשך 30 דקות. בצע cryosections של עובי 8 מיקרומטר. סעיפי פיקדון 4 בשקופית כדי לאפשר התקשרות יעילה. סעיפי מקום קרובים מספיק כדי להתאים את עצמו coverslip 2 18 x 18 מ"מ.
  5. בדוק את האיכותסעיפים (ללא פגע וללא סריטות) ואת הכיוון של העובר (סעיפים אורכים) עם סטראו ולבחור את החלקים מתאימים לניתוח נוסף. מהר ככל האפשר להפקיד אותם בצנצנת coplin ולבצע RNA FISH (ראה 3.3.2).

2. הכנת TGCs משנית

  1. לבודד את conceptus (ראה סעיף 1.1 ו -1.2).
  2. לנתח את E7 Ectoplacental קונוס (EPC)
    1. השתמש סטראו ו צלחות פטרי המכילות PBS סטרילית. לנתח את decidua עם מלקחיים. פירס מדגם מלקחיים פתוחים לקרוע שני הצדדים של decidua בנפרד.
    2. לשלם את העובר. השתמשו טיפים של מלקחיים בסדר סגורים (דומון מס '5) בתובענה מספרית דמוי להפריד את EPC מעובר נכון. השתמש טיפול מיוחד על מנת להשיג מדגם נקי לחלוטין, להפריד מרקמות אימהיות כמו גם מן השק סיסי וחלמון. יש לשטוף היטב את explants EPC ב PBS.
    3. בעזרת כף מעט, להעביר EPC גזור הפרט א-wel 4צלחת l המכיל coverslip סטרילי במדיום.
  3. לגזור TGCs מתרבויות לזמן קצר EPCs.
    1. כן צלחות 4-היטב המכילות coverslips. לעקר 12 מ"מ קוטר עגול זכוכית coverslips ידי טבילה באתנול, ואחריו-ייבוש להבה.
    2. הוסף 0.5 מ"ל בינוני EPC היטב כל (בינוני EPC: RPMI 1640 בתוספת 15% FCS, 0.1mm 2-mercaptoethanol ואנטיביוטיקה).
    3. יחיד מיזוג אויר, גזור-EPCs במרכז של coverslip בבאר יחד עם המדיום לתרבות. שימוש במלקחיים בסדר ליישם את EPC על coverslip הזכוכית. Culturefor 3-5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. Explant הפרט מהווה תולדה שמתפשט כמו בשכבה של TGCs שטוח (איור 2 א).

3. RNA FISH

הערה: הפרוטוקולים מבוססים על אלה המתוארים עבור תאי גזע עובריים (ESCs) ב Chaumeil ואח ', 8 ו Pollex ושמעתי 13..

  1. המתקדם Prepaמנה של פתרונות מניות
    1. כן pH חיץ נתרן יצטט 3M 5.2.
    2. הכן חיץ הכלאה 2x המכיל 40% (w / v) סולפט dextran נתרן, 20x BSA, 400 מ"מ Vanadyl Ribonucleoside מורכבים (VRC) ב 4x מלוחים סודיום ציטראט (SSC).
    3. כן הרכבה בינונית המכילים 90% (v / v) גליצרול, 0.1% (w / v) p-phenylenediamine, pH 9 ב PBS.
  2. פתרונות מוכנים טרי
    1. כן פתרון מקבע מורכב 3% מוכנים טרי paraformaldehyde (PFA) ב- PBS. הכן פתרון permeabilization המכיל 0.5% Triton-X-100 ב PBS בתוספת 2 מ"מ VRC. הכן חיץ לשטוף על ידי ערבוב 50 לפוראמיד% (FA) ו 2x SSC ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4.
    2. הכן פתרון ה- DNA נגד מכתים המורכב DAPI 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​(4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) ב 2x SSC.
  3. קיבוע Permeabilization כהכנה FISH
    1. עבור תאים על coverslips, לשטוף התאים PBS 1x במשך 5 מ 'ב. תקן תאים על coverslips, או חלקים עובריים בשקופיות, במשך 10 דקות ב מקבע (3% PFA) פתרון ב RT.
    2. יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1X PBS. Permeabilize תאים למשך 5 דקות בתמיסת permeabilization קר כקרח על קרח. שטפו תאים שלוש פעמים עם אתנול 70%. coverslips חנות צלחות 4-היטב שקופיות תיבת טיסה 4 שקופיות באתנול 70% ב -20 ° C.
      הערה: Coverslips ומגלשות יכולים להיות מאוחסנים במשך מספר חודשים ב -20 ° C. צלחות קופסאות המכילות אותם צריך להיות אטום עם parafilm כדי למנוע אידוי אתנול.
  4. תיוג DNA Probe
    1. לייבל בדיקות DNA על ידי תרגום ניק באמצעות נוקלאוטידים ניאון. פעל על פי הוראות היצרן (ראה טבלה 1) 8.
    2. לקבלת תערובת תגובה 50 μl, להוסיף 1-2 מיקרוגרם של פלסמיד, כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BAC) או הגברת עקירה מרובה (מד"א) (הגברת DNA, ראה 3.4.4) DNA 17.5 מי μl 2.5 μl 0.2 מ"מSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 μl 10 מ"מ כל תמהיל dNTP (dGTP, dATP, dCTP), 5 μl 10 מ"מ dTTP, 5 μl חיץ תרגום ניק 10x ו -8 μl האנזים התרגום ניק.
    3. דגירה במשך 16 שעות ב 15 ° C בחושך. להשבית את התגובה על ידי הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס. בדיקות חנות במשך חודשים ב -20 ° C.
    4. מד"א
      הערה: לקבלת DNA BAC, כמות ה- DNA המתקבל לאחר הכנה קלסית היא נמוכה, ולכן ניתן להשתמש צעד של הגברת DNA לפני התיוג באמצעות מד"א. השתמש ערכה מסחרית ופעל לפי הוראות היצרן (ראה טבלה 1).
    5. מערבבים 0.5 μl DNA BAC עם 9.5 חיץ מדגם μl. מחממים 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. מיד להרוות על הקרח; להשאיר על 10 דקות קרח. כן תגובת חיץ / תמהיל אנזים: (9.5 μl + 0.5 תמהיל אנזים μl) ולשמור על קרח.
    6. מערבבים 10 תמהיל μl תערובת DNA + 10 μl התגובה חיץ / האנזים. לדגור על 20 שעות 30 מעלות צלזיוס לפחות. להשבית אנזים על ידי מדגם חימום 10 דקות ב 65 & #176; ג. מדגם מצנן 4 ° C לפני האחסון ב -20 ° C.
    7. בדוק מד"א על ​​ידי עיכול. הוסף 1 μl מד"א, 2 μl 10x חיץ, 2 μl הינד III ו- 15 μl H 2 O. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הפעל לאט על ג'ל agarose 0.8-1% כדי לאשר הגברת DNA מדויקת. קטעי דנ"א ברורים של משקל מולקולרי גבוה יש לשים לב על הג'ל.
  5. הכנת Probe
    1. השתמש 0.1 או 1 מיקרוגרם בדיקה לכל coverslip או שקופיות.
      הערה: להוסיף 2-5 מיקרוגרם של ה- DNA מיטת-1 אם תחרות נדרשת למשל, רוב הבדיקות כפי שהם יכולים להכיל רצפים חוזרים אשר אחרת לחצות להכליא ולהגדיל ברקע.
      1. לקבלת ממטרים, להוסיף DNA זרע סלמון 5 מיקרוגרם, 1/10 נפח 3 M pH אצטט נתרן 5.2 ו -3 כרכים אתנול. ספין על XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. לשטוף כדורים עם אתנול 70% ומסובבים שוב במשך 5 דקות.
    2. גלולה יבשה 2 דקות בתוך VAC רכז / מהירות. Resuspend בצורה 100%אמיד בחצי נפח נדרש הכלאה (למשל, 2.5 μl עבור coverslip או 7 μl עבור סעיפים עובריים בשקופית). מניחים 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד בתוך thermomixer. לפגל עבור 7 דקות ב 75 מעלות צלזיוס.
    3. להרוות על הקרח, או אם התחרות נדרש לשים ישירות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. מערבבים את הפתרון בדיקה עם נפח שווה של פתרון הכלאה 2x.
  6. הכלאה ושוטפת
    1. לְיַבֵּשׁ; coverslips בבארות, ומגלשות בצנצנת Coplin, על ידי שטיפה רציפים 1x 80%, 1x 95% ו 100% אתנול 2x עבור 5 דקות כל אחד. coverslips ושקופיות יבשות לחלוטין.
    2. עבור הכלאה, להחיל את תערובת הכלאה בדיקה 5 μl (ראה 3.5) לשקופית ולהפחית את coverslip, עם תאים מול לתערובת הכלאה. עבור חלקים בשקופית, להחיל לערבב הכלאה בדיקה 14 μl (ראה 3.5) ומכסים עם coverslip 18 x 18 מ"מ 2.
    3. מקום שקופית בתא לח (נייר טישו טבול50% FA / 2x SSC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בחושך.
    4. רוחץ פוסט כלאה:
      1. הוסף 1 מ"ל של 50% FA / 2x SSC על coverslip בשקופית כדי לשחרר אותו; להסיר את coverslip בזהירות משקופית (נזהרת שלא לגרד את התאים) ולמקם אותו בצד התא למעלה לתוך צלחת 4-היטב המכיל 50% FA / 2x SSC. עבור חלקים בשקופית, להסיר את coverslip באופן דומה במקום להחליק בצנצנת Coplin המכיל 50% FA / 2x SSC.
      2. בצע 3 שוטף, כל אחד 7 דקות עם SSC מחומם מראש 50% FA / 2x ב 42 מעלות צלזיוס או 44 מעלות צלזיוס למשך coverslip או שקופיות, בהתאמה.
      3. בצע 3 שוטף עם מחומם מראש 2x SSC במשך 5 דקות כל אחד ב 42 מעלות צלזיוס או 44 מעלות צלזיוס למשך coverslip או שקופיות, בהתאמה.
    5. Counterstain גרעינים ידי שטיפה ב 2x SSC עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI דקות 3 ב RT. יש לשטוף פעמיים עם 2x SSC.
  7. התקנת Coverslips ומצגות
    1. עבור coverslip קטן מ TGCs תרבותי, להחיל 5 & #181; l הרכבה בינונית בשקופית. מניח את התא בצד coverslip למטה על גבי הירידה.
    2. עבור שקופיות עם קטעים, להחיל 15 μl הרכבה בינונית בשקופית. מניחים coverslip מ"מ 2 22 x 22 על גבי ירידה.
    3. הימנע בועות. לקנח פתרון הרכבה עודף. חותם את coverslip עם כמות קטנה של לק. במידת האפשר, תמונה שקופיות מיד או חנות של עד מספר חודשים ב -20 ° C.

מיקרוסקופיה וניתוח 4.

  1. לרכוש תמונות ציר 3D רציפים z ב 0.3 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 63X) ולבצע ניתוח של ערימות התמונה 3D באמצעות תוכנת ImageJ 14.

Representative Results

TGCs ניתן לזהות על סעיפי E7 על מכתים DAPI בשל הלוקליזציה שלהם conceptus והגודל הגדול שלהם. זה מתואר באיור 1A על קטע אורך. RNA FISH בוצע על סעיפים עובריים כאלה כדי ללמוד איון כרומוזום X בשושלת חוץ עוברי זה.

שקופיות או coverslips כמה יכול להיות מעובד בו זמנית. באמצעות צבעים שונים לתייג RNA של גנים שונים, אפשר להבחין תמלילים עיקריים שונים באותה הגרעין. לפחות 2 בדיקות יכולות להיות מעורבות יחד, למשל Xist מצמיד SG (אות ירוקה) Atrx מצמיד את SR (האות אדומה). דוגמא נקבת TGC מוצגת באיור 1B שבו 2 שושלות אחרות מיוצגות, העובר התקין (E) ואת האנדודרם הקרבי (VE). גרעין TGC מוצג עם RNA Xist מכסה את Chrom Xosome אשר מומת (Xi) ואילו כרומוזום X השני הפועלת (Xa) מציג כמה סיכה. X-linked גן התמלילים העיקריים Atrx באים לידי ביטוי מן כרומוזום X הפעיל (מעוצב לא על ידי Xist) בכמה עותקים בשל endoreplication. זה ממחיש למשל הביטוי monoallelic, איון של Atrx על כרומוזום X אחד.

מאז TGCs הוא הטרוגניים בגודל כפי שמודגם באיור 2B, רק אלה הגדולים נרשמים. שלושה בדיקות יכול לשמש גם כפי שמודגם באיור 2C עבור TGCs משנית. במקרה זה, Xist -SG (ירוק), שני גנים צמודים X: G6PD -SR (אדום) ו Huwe1 -Cy (מג'נטה) נותחו באותו הזמן באותו הגרעין. בעוד G6PD מתבטא monoallelically כפי שמוצג כאן (ועוד קודם לכן שמוצג TGCs משני 3) Huwe1 מתבטא biallelically הוכחת PR שלהoperty לברוח xci. Endoreplication, עם כמה ראשי סיכה כלומר, עותקים תמלילי המתהווה, ניכר גם.

איור 1
באיור 1. ביטוי תמליל עיקרי TGCs ממדור עוברי נקבת E7. (א) בסעיף האורך של conceptus E7 מוכתם DAPI. העובר ורקמות חוץ עוברי מוקפים ברקמת האמא, את decidua. הלוקליזציה של השושלות השונות נעשתה על מכתים DAPI עם מטרת 5X. TGCs מזוהה בשל הגודל הגדול שלהם. Ch, סיסי, E, עובר, EPC, חרוט ectoplacental, VE, endoderm הקרבי, TGC, תאים ענקים trophoblast. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) הגדלה גבוהה של אזור התאגרף-ב א (המטרה 63X) FISH RNA. תמליל העיקרי Atrx ב RNA אדום Xist בירוק הם דמיינו על E 3 שושלות =, VE, TGC. Scאייל בר = 10 מיקרומטר. דוגמה in vivo TGC שבו Atrx מתבטא monoallelically (Xa, ראש חץ) ושקט הממוקם על כרומוזום X. Xist מצופה (Xi); כמה אותות Atrx לראות על Xa נובעים endoreplication. Atrx = BAC שיבוט RP23-260I15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ביטוי תמליל עיקרי TGCs משני נגזר EPC. (א) מראה כללי של גדל TGCs המשנית (אובייקטיבי X5). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) כוכבית מצביעה דוגמא TGCs פי גודלם (אובייקטיבי 10X). בר סולם = 60 מיקרומטר. דוגמה (C) של נקבה משני RNA TGC FISH עם שימוש של 3 בדיקות (Doma Xistב בירוק, המכסה את כרומוזום X המומת: Xi) מראה endoreplication של תמלילים עיקריים G6PD ו Huwe1 (כמה ראשי סיכה, באדום מגנט). בעוד G6PD מתבטא monoallelically, ביטוי Huwe1 הוא biallelic בגרעין זה Huwe1 = BAC שיבוט RP24-157H12;. G6PD = BAC שיבוט RP23-13D21. Xi = חץ; Xa = ראש חץ (אובייקטיבי 63X). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

ינוקא RNA FISH מייצג שיטה קלה ורגישה לניתוח התא הבודד של פעילות תעתיק ברקמות עובריות בשלבי התפתחותיים שונים. כוחה של גישה זו הוא היכולת לזהות שושלות עובריות שונות בכל שלב מסוים על פי קריטריונים מורפולוגיים. עם זאת זה גם דורש כי קרינת רקע מינימאלית היא הווה. כל רקע כזה הופך את זיהוי של אזורים עובריים שונים סוגי תאים מאתגרים. כדי להבטיח רקע מינימלי, ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא איכות cryosection והשנייה הוא היעילות (יחס אות לרעש) של דג RNA, אשר תלוי ברמת ביטוי גנטי ואת האיכות של החללית. עבור אלה האחרונים, בדיקות ולכן נבחנים תמיד על תאים בתרבית על coverslips (תאי גזע עובריים או תאים סומטיים) לפני השימוש על סעיפים.

בפרוטוקול זה, אנו מספקים ה טכניקות דואר נדרשו לבצע ניתוח FISH RNA על TGCs משני סוגים שונים של הכנת מדגם (סעיפי cryostat ותרבויות עיקריות של explants העוברי). כזה ניתוח תא בודד מאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בשלבים שלאחר השתלה שונות יוערכו.

השיטות אנו מתארים ליצור TGCs משנית (ב E7-7.5 בשלבים שלאחר ההשתלה) שימשו במעבדה שלנו לחקור את דפוסי איון כרומוזום X של השושלת חוץ עובריים אשר היוו של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה. פיתוח חוץ עוברי במכרסמים תלוי הבידול של TGCs. ואכן, TGCs חיוני שליה ולכן התפתחות עוברית. פגמי בידול TGC לגרום הקטלניות עובריות (לסקירה ראה התייחסות 15). פעילות תעתיק של TGCs באמצעות RNA FISH מותר לנו להפגין מעמד איון חריג כרומוזום X של תאים מסוג כזה במהלך העכבר פיתוח 3.

ss = "jove_content"> השיטות שהוצגו כאן כדי לקבל וללמוד TGCs משנית ניתן להחיל ללמוד מסלולים מולקולריים בפיתוח של רקמות חוץ עובריים הם חשובים חלק, הן בעכברים נורמליים מוטציה. גישות אלה יכולים להיות מותאמים לחקור פיתוח TGC ביונקים אחרים. הניתוח שלנו מעורבים השימוש של עוברי עכברים סוג בר המאפשר לנו להעריך את פעילות תעתיק של גנים שונים in vivo TGCs וב TGCs במבחנה נגזר explant EPC. שיטה זו יכולה להתארך עד הניתוח של עכברים מהונדסים ו / או על ידי התוספת של מולקולות מעכבות במדיום התרבות. השתמשנו בהצלחה בשיטה זו של RNA FISH על סוג אחר של TGCs, כגון TGCs העיקרי אשר מופיע בשלב מוקדם יותר של התפתחות עכבר, blastocyts E3.0, אשר יכול להיות בנפרד בתרבית למשך 4-5 ימים במהלך שפתחו תולדה, את ICM להיות מוקף TGCs העיקרית הגדולה 16,17. תמלילי המתהווה עבור שונהגנים וכן Xist יכול להיות דמיינו לכמת באמצעות הגישה FISH אותו RNA 3.

Immunofluorescence משולב ו- RNA FISH יכול להתבצע גם על סעיפים cryostat וכן TGCs בתרבית במבחנה 3. מכך ניתן להסיק כי השיטה היא די חזקה, כמו תמלילי העיקריים הם רגישים מאוד שפל ויש דרישה מוחלטת של תרכובות חינם RNase. IF / RNA FISH מספק מידע נוסף על רמות שעתוק, לוקליזציה הסלולר ביטוי חלבון, בו זמנית בתא נתון. אמנם, קטעי רקמה פרפין מוטבע בעבר שימשו כדי לזהות RNA המתהווה בגידולים אנושיים תוך שמירה על מורפולוגיה רקמות 18, בידינו, סעיפים cryostat מתאימים כפולה ומכופלת לשמר הן את RNA המתהווה ואת אפיטופים נדרש לגילוי על ידי נוגדנים במהלך immunofluorescence .

בנוסף RNA FISH, בעקבות immunofluorescence, כרומוזומליות DNA FISH יכול להתבצע גם על TGCs משנית באמצעות בדיקות שכותרתו עם fluorochromes, בדומה לאלה המשמשים RNA FISH 3. בדיקות ניאון יכול להיות פלסמידים / fosmids או BACS, שכותרתו עם dUTPs פלורסנט כפי שמוצג כאן, ותיאר Chaumeil et al., 8. לחלופין, oligonucleotides שכותרתו fluorescently יכול לשמש 19. מאז DNA FISH אינו מחייב גדיל-סגולי, בדיקות oligonucleotide יכולה להיות מתוכננות למקד אחד משני הגדילים משלימים באזור היעד. בדיקות דנ"א מסועפים, שבו הגברת אות מושגת על ידי שני סיבובים רציפים של בדיקות ספציפיות ומגבר יכולות לשמש גם כדי לשפר את יחס אות לרעש של אותות FISH 20. לחלופין, בדיקות RNA כגון riboprobes יכולות לשמש אם כי בדיקות דנ"א שלנו להבטיח תחלופה טובה יותר בין איכות אות, סגולי וקל שימוש.

לבסוף, acquisiti תמונת 3Dעל חיונית על מנת להשיג את המידע המרחבי הנדרש תאים גדולים אלה, והוא יכול להתבצע באמצעות מגוון של מיקרוסקופים הקרינה, כגון המיקרוסקופ Apotome, או מיקרוסקופים epifluorescence עם deconvolution כגון DeltaVision (geh), או מיקרוסקופים אחרים מתאימים עבור סעיפי רקמות הדמיה, וגדולים (> 20 מיקרומטר) TGCs. יצוין כי עבור לוקוסים דנ"א עותק יחיד, האות punctate זוהה על ידי FISH RNA המתהווה או FISH DNA לא יזוהו בקלות על ידי מיקרוסקופיה confocal.

לסיכום, השיטות המתואר כאן צריכות להיות שימושיות הן עבור הניתוח המפורט של TGS בהקשר התפתחותי, אלא גם במצבי מחלה אחרים. גנים רבים שמעורבים בפיתוח TGC ותפקוד במכרסמים שמורים בין מכרסמים ובני האדם, כגון גורמי תעתוק, פרוטאזות ומולקולות הידבקות תא 21. עכבר TGCs הוא מודל תא עבור גנים לומדים מווסתי התפתחות שליהד ולכן לתת תובנה מחלות שליה אנושיות. יתר על כן, בשל העובדה כי תאים אלה הם endoreplicating ומאז כמה תאים סרטניים לעסוק תוכניות endocycle, בנוסף לתהליכי הגברת גן, השיטות אנו מתארים צריכות גם להיות מועילות בחקירות תא בודדות נדרשו לחקור מנגנונים מובילים הגנום חוסר יציבות בתאי סרטן .

Acknowledgments

אנו מודים סוף Gournet לעזרה עם איורים, גולות Chaumeil לקריאת כתב היד, מתקן דיור חיה ואת פלטפורמת ההדמיה של היחידה. עבודה זו קיבלה תמיכה במסגרת תוכנית «Investissements d'Avenir» שהושק על ידי ממשלת צרפת ויושמו על ידי ANR עם אזכור ANR-10-LABX-0044 ו PSL ANR-10-IDEX-0001-02, את לא EpiGeneSys FP7. 257,082 רשת של אקסלנס EH, חוקר מתקדם ERC הפרס לא. 250,367 והאיחוד האירופי FP7 SYBOSS להעניק אין. 242,129 ל EH המחברים מבקשים להודות פלטפורמת הדמיה תאים ורקמות של גנטיקה מהמחלקה לביולוגיה התפתחותית (UMR3215 / U934) של קירי Institut, חבר צרפת-bioimaging (ANR-10-InSb-04), עזרה עם אור מיקרוסקופיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon SMZ 1500
Stereomicroscope Zeiss Stemi SV6
Scissors Pascheff-Wolff Moria MC19
Dumont #5 forceps Roth PK78.1
4-well tissue culture dishes  Nunc 176740
60 mm Petri dishes Falcon Dutsher, France 353004
100 mm Petri dishes Falcon Dutsher, France 353003
Coverslips 18 mm x 18 mm  VWR 631-1331
Coverslips 22 mm x 22 mm VWR 631-0125
12 mm glass round coverslips  Harvard apparatus 64-0712
Slides Superfrost plus VWR 631-9483
4-slide Transport  box  Lockmailer Dutsher, France 40684
Cryotubes 1.8 ml Corning  Fisher Science 10418571
Glass Coplin staining jars Fischer Scientific W1561L
TissueTek O.C.T compound VWR 4583
RPMI 1640 medium Invitrogen 61870
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D1408 10x  is used
Water  Sigma-Aldrich W3500
Paraformaldehyde  Panreac Quimica, Spain 141451 3% in PBS
Triton-X-100   Euromedex  2000-A 0.5% final
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)  New England Biolabs, USA S1402S
Sodium dextran sulfate  Sigma-Aldrich D8906
Bovine serum albumin  (BSA) New England Biolabs, USA B9001S
Formamide Sigma-Aldrich 47671-1L-F  aliquots kept at -20 °C
Illustra TempliPhi  Kit Construct (Kit MDA) Dutsher, France 25-6400-80
Nick translation kit Abbott, USA 07J00-001
20x SSC buffer concentrate Sigma-Aldrich  S6639
Spectrum green dUTP  Abbott, USA 02N32-050
Spectrum red dUTP  Abbott, USA 02N34-050
Cy-5 dUTP  Dutsher, France PA55022
Mouse Cot-1 DNA  Invitrogen 18440016
DNA, MB grade Invitrogen Roche DNA from fish sperm
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride  Sigma-Aldrich D9564 DAPI
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
p-phenylenediamine Sigma-Aldrich 695106
Centrifuge 5417R Eppendorf, Germany molecular biology grade
Eppendorf concentrator plus Eppendorf
Eppendorf Thermomixer comfort Eppendorf
Liquiport Liquid pump KNF Neuberger, Trenton, USA
Shake'N'Bake Hybridization oven Boekel Scientific, USA
Cryostat  Leica CM3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
  2. Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
  3. Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
  4. Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
  5. El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
  6. Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
  7. Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
  8. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
  9. Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
  10. Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
  11. Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
  12. Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
  13. Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  15. Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
  16. Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
  17. Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
  18. Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
  19. Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
  20. Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
  21. Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 114 חרוט Ectoplacental תמליל ינוקא קרינת RNA פיתוח עכבר תאים ענקים Trophoblast סעיף עוברי cryostat
ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corbel, C., Heard, E.… More

Corbel, C., Heard, E. Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants. J. Vis. Exp. (114), e54386, doi:10.3791/54386 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter