Introduction
Transkripsiyon sonrası gen tam olarak çekirdeğin DNA transkripsiyonu ile başlayan, düzenlenir. RNA proteinleri (RBPS) bağlayıcı tarafından kontrol mRNA biogenesis ve metabolizma RNA metabolizması 1-3 ilerlemesi sırasında bir alt tabaka öncüsü mRNA ile ayırmak doçent ve son derece dinamik Ribonükleoprotein parçacıklar (RNP), ortaya çıkar. RNP bileşenleri dinamik değişiklikler mRNA transkripsiyon sonrası kaderini etkileyen ve primer transkript, nükleer kaçakçılığı ve lokalizasyonu, çeviri için mRNA şablon olarak kendi faaliyet ve olgun mRNA nihai ciro işlenmesi sırasında kalite güvence sağlamak.
Çok sayıda protein RNA tanıma motifinin (RRM) dahil olmak üzere korunmuş amino asit etki, sayesinde RBPS olarak tanımlanır, çift kollu bir RNA bağlama alanı (RDB) ve temel artıklarının kısımlarının (örneğin, arginin, lizin, glisin) 4. RBPS rutin vardırimmünopresipitasyon stratejileri ile izole ve soydaş RNA'lar belirlemek için taranmaktadır. Bazı RBPS RNA regulonlarının 5-8 olarak tanımlanan fonksiyonel ilişkili olan önceden mRNA eş düzenler. Bu RBPS kendi aynı kökenli mRNA'lar, ve bazen de kodlayıcı olmayan RNA bileşim içinde değişebilir katalitik RNP oluşturur; kendi benzersiz bağlı ilişkili faktörler, çeşitli kombinasyonları, aynı zamanda bunların etkileşimleri 9 zamansal dizisi, yer ve süresi için.
RNA immünopresipitasyon (RIP) hücrelerden RNP izole etmek ve sekans analizi 10-13 kullanarak ilişkili transkript tanımlamak için güçlü bir tekniktir. Aday hareketle genom çapında için tarama bir mikro-dizi analizi 14 ya da yüksek verimlilik sıralaması (RNAseq) 15 ile kombine RIP ile mümkündür. Bunlar, birlikte-çökeltme antikor 16 yeterince zengindirler ve ayrılabilir Aynı şekilde, birlikte-çökeltme proteinler, kütle spektrometresi ile tespit edilebilir,17. yaklaşım, bitki hücreleri, mantar, virüs ve bakteri çözünebilir lizatları olarak değişebilir, ancak Burada, kültürlenmiş insan hücrelerinden belirli bir aynı kökenli RNA RNP bileşenlerini izole etmek için bir yöntem arayabilir. Şekil 1 'de özetlendiği gibi, malzemenin aşağı akış analiz, aday belirlenmesi ve kabul immunoblotting, kütle spektrometrisi, biyokimyasal enzimatik tahlil, RT-qPCR, mikrodizi ve RNAseq bulunmaktadır.
Transkripsiyon sonrası seviyede gene ekspresyonunu kontrol etmede RNP temel rolü göz önüne alındığında, bileşen RBPS veya erişilebilirlik ekspresyonunda değişiklikler RNA'lar hücre için zararlı olabilir ve nörolojik hastalıkları 18 de dahil olmak üzere hastalıkların çeşitli türleri ile ilişkilidir, aynı soydan gelen. DHX9 / RNA helikaz A (RHA), hücresel ve retroviral kökenli 6 seçilmiş mRNA'ların çevrilmesinin için gereklidir. Bu aynı kökenli RNA'lar olan yapısal olarak ilgili, cis etkili elemanlar sergileyen kendiTranskripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 19 olarak belirlenmiş 5 'UTR,. RHA-PCE aktivitesi, HIV-1 de dahil olmak üzere pek çok retrovirüsler, etkin kap bağımlı çeviri için gerekli olan ve JUND 6,20,21, büyüme düzenleyici genlerin. Önemli bir gen (dhx9) tarafından kodlanır, RHA hücre çoğalması ve düşük-regülasyona karşı gerekli hücre canlılığı 22 ortadan kaldırır. RHA-PCE RNP moleküler analiz RHA-PCE etkinliği hücre çoğalmasını kontrol etmek için neden gerekli olduğunu anlamak için önemli bir adımdır.
Kararlı durumda ya da hücrenin fizyolojik pertürbasyon üzerine RHA-PCE RNP bileşenlerinin hassas karakterizasyonu aşağı analiz için yeterli bolluk içinde RHA-PCE RNP seçici zenginleştirme ve yakalama gerektirir. Burada, retroviral PCEgag RNA açık okuma çerçevesinde MS2 kaplama proteininin (CP) için sis etkili RNA bağlanma sitenin 6 kopya ile etiketlenmiş. MS2 kılıf proteini ekzo edildigenously birlikte ifade plazmid transfeksiyon ile PCEgag RNA ile büyüyen hücrelerde RNP Montajı kolaylaştırmak için. Aynı kökenli MS2-etiketli PCEgag RNA MS2 kaplama proteini içeren RNP hücre özütü immunoprecipitatesi manyetik boncuk (Şekil 2a) üzerinde alınmıştır. seçici PCE bağlı RNP bileşenleri elde etmek için, immobilize RNP RNase H aktivitesi için alt-tabaka olan bir RNA-DNA melezi oluşturan PCE distal dizilerine tamamlayıcı olan bir oligonükleotid ile inkübe edildi. PCE çevrilmemiş bölge 5 '5' ucu 'konumlandırılmış olduğundan, oligonükleotid retroviral başlangıç sitesine (gag start kodonu) bitişik RNA dizilerine tamamlayıcı. yıkama sıvısı olarak toplandı immobilize RNP, serbest 5 'UTR kompleksi kodon gag başlangıcına yakın RNaz H bölünme. Daha sonra, örnek captu onaylamak için PCEgag ve SDS PAGE ve immunoblot yakalamayı teyit etmek için RT-PCR ile değerlendirildiHedef MS2 kılıf proteini yeniden. PCE ilişkili RNA bağlayıcı proteinin doğrulama DHX9 / RNA helikaz A, sonra gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| tampon kompozisyonlar |
| Yıkama Tamponu: |
| 50 mM Tris-HCI, pH 7.4 |
| 150 mM NaCI |
| 3 mM MgCI2 |
| Düşük tuz tamponu: |
| 20 mM Tris-HCI, pH 7.5 |
| 10 mM NaCI |
| 3 mM MgCI2 |
| 2 mM DTT |
| 1x proteaz inhibitör kokteyli EDTA'sız |
| RNaz dışarı 5 ul / ml (RNaz inhibitörü) |
| Sitoplazmik Lizis Tampon: |
| 0.2 M sukroz |
| % 1.2 Triton X-100 |
| NETn-150 Yıkama Tamponu: |
| 20 mM Tris-HCI, pH 7.4 |
| 150 mMNaCI |
| % 0.5 NP-40 |
| 3 mM MgCI2 |
| % 10 Gliserol |
| Bağlama Tamponu: |
| 10 mM HEPES pH 7.6 |
| 40 mM KCI |
| 3 mM MgCI2 |
| 2 mM DTT |
| % 5 gliserol |
Tablo 2: Tampon kompozisyonlar.
Hücreler ve bağlanma matrisinin hazırlanması 1.
- Kültür, 10 cm'lik tabak alt izdiham (% 80) ile ilgi konusu bir hücre çizgisi. bir FLAG-etiketli NLS-MS2 kaplama proteininin bağımsız İmmüno için (PPI) 10 cm tabak kullanın. FLAG-epitop etiketi antiserumlar kullanılarak IP gerçekleştirin. FLAG-etiketli MS2 kılıf proteini plazmid ifade edilirken, hasat 20 peşin hücreler 24-48 saat transferinde.
NOT: Belirli bir RNP nükleer veya sitoplazmadan zenginleştirilmiş olabilirBöyle bir sukroz degrade kesirleri olarak ic lizatları veya biyokimyasal-fraksiyone hazırlık. Ek bir negatif kontrol tesis paralel olmayan transfekte edilmiş hücrelerin lizatı hasat önerilir. - Transfer 1.7 ml mikrosantrifüj tüp protein G manyetik boncuk çamurunun IP başına 60 ul.
- mikrosantrifüj tüpleri depolama çözümünden boncuk ayırmak için bir mıknatıs rafa yerleştirilir.
- dikkatli bir mikropipet ile o kadar çizerek depolama çözümü çıkarın.
- mıknatıs raftan borusunu sökün.
- Yıkama ve 1 x yıkama tamponu 600 ul boncuk (boncuk 10 kez kullanılan hacim) dengelenmesi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 3 mM MgCl2 ve 150 mM NaCI) ile 3 ve uç üzerinde uç döndürme Oda sıcaklığında dak.
- mıknatıs rafa yerleştirilir ve yıkama tamponu çıkarın.
- dengelenmiş pr 1x yıkama tamponu ve imüno FLAG antikoru 10 hacimleri (600 ul) ekleyinimmüno-çökeltilmesinin antikor konjügatı için en az 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında ve döndürme ucu-üzerinde-uç (bir immünopresipitasyon üreticiler tarafından miktarına göre) otein G manyetik boncukları. Uygun bir antikor negatif kontrol olarak, ilgili izotip IgG kullanın.
- boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için mıknatıs rafa yerleştirilir.
- Mıknatıs raf tüpü alınır ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1 x yıkama tamponu ve dönme, 10 hacim (600 ul) ile antikor-eşlenik boncuklar yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin.
- mıknatıs rafa yerleştirilir ve yıkama tamponu çıkarın.
2. Hasat RNP
NOT: Aşama 1.8 sonrasında inkübasyon süresi boyunca RNP hazırlayın.
- Aspirasyon ile hücrelerin kültür ortamı çıkarın ve buz soğukluğunda 1 x fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1-5 ml (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri. Islak çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın,4 ° C'de 4 dakika boyunca 226 x g'de santrifüj ile toplanmadan önce yapışmayan hücreler.
- 3 mM MgCI2, 10 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 x proteaz inhibitör kokteyli, EDTA-içermeyen ve 5 ul / ml buz gibi soğuk, düşük tuzlu tampon (20 mM Tris-HCI, pH 7.5 içinde 375 ul ekle RNaz hücre pelletine inhibitörü) ve 5 dakika buz üzerine yerleştirerek şişme sağlar.
NOT: Hücre pelet büyüklüğüne göre düşük tuz tamponu hacmi Terzi. 10 cm plaka 1,2 x 10 6 hücre için tampon 375 ul yeterlidir. - Sitoplazmik hücre lizatı toplama, buz sıcaklığında lizis tamponu 125 ul (0.2 M sukroz /% 1.2 Triton X-100), ve daha sonra bir buz kovası önceden soğutulmuş bir Dounce homojenleştirici ile 10 vuruş yapar.
NOT: Toplam hücre özü toplamak için, standart RIPA liziz tamponu nükleoplazmanın / kromatin çözündürülmesi için tavsiye edilir. - 1 dakika boyunca en yüksek hız (16.000 xg) bir mikrofüj Spin; Bu enkaz a süpernatant silecektirnd çekirdekler.
- buz üzerinde olmuştur, yeni bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın. Böyle Bradford Tahlil 23 olarak standart laboratuvar tercih edilen metot ile toplam protein konsantrasyonunu belirlemek. Bir Western blot analizi için, en azından% 10 bir kısım rezerve bir giriş kontrol olarak kullanılır. immüno-çökeltme için hemen hasat hücre lizatı kullanarak veya gelecekteki analiz için -80 ° C'de saklayın.
NOT: Bizim tecrübelerimize göre, bu örnekler saklanabilir ve bütünlüğü ödün vermeden immünopresipitasyon analizi için birkaç ay sonra kullanılır.
3. Immunoprecipitation
- Hedef antikor eşlenik boncuklar adım 2.5 belirlenen protein konsantrasyonu dayalı Hasat edilen hücre lizatının istenen hacmi, ekleyin. 1x yıkama tamponu kullanılarak, 600 ul kadar toplam hacmi getirmek ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca son aşırı ucunu döndürün.
NOT: Bu süre oluşturmak için yeterlidirSpesifik-olmayan bağlanma en aza indirirken, yüksek afiniteli RNP kompleksleri sağlam bir izolasyon. Yukarıda da belirtildiği gibi, daha önce hazırlanmış boncuk-antikor kompleksleri ile inkübe ardından 1 x yıkama tamponu ile 1 ve: bir sükroz gradyanı kesirleri, en az 1 gibi alternatif RNP kaynaklarını seyreltilir. - inkübasyon 90 dakika sonra, boncuklar toplamak için mıknatıs raf IP tüp yerleştirin. flow-through olarak süpernatant saklıdır.
NOT: Bu ilk akış yoluyla IP etkinliğini ölçmek için önemli bir kontrol örneğidir. Bir bağışıklık deneyi, bir IP verimliliğinin bir göstergesi, aynı zamanda incelenen etkileşimlerin spesifitesi sağlayacaktır. Aşağı analiz için bu süpernatant tutmak için tavsiye edilir. - 150 mM NaCI,, 3 mM MgCl2,% 0.5 NP40, buzla soğutulmuş NETn-150, yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 hacim (600 ul) ile RNP bağlı antikor-eşlenik boncuklar yıkayın Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca dönme altında,% 10 gliserol). adımı 3 kez tekrarlayın.
NOT: Bu tampon lizis tamponu farklıdır ve etkili zayıf ya da spesifik olmayan dernekler azaltır. - Ve yedek% 10 Nihai yıkamayı takiben, buz soğukluğunda 1 x bağlayıcı tampon (40 mM KCI, 3 mM MgCl2,% 5 gliserol, 2 mM DTT, 10 mM HEPES, pH 7.6), 60 ul immobilize RNP kompleksleri tekrar süspansiyon Western blot ve RNA izolasyonu için% 20 immobilize karmaşık boncuk.
4. Elüsyon
- buz soğukluğunda 1 x bağlayıcı tampon ile 100 ul'ye geri kalan hacim ayarlama ve 3 dakika boyunca 70 ° C'de tüp ısıtın.
- aynı kökenli RNA-protein kompleksleri ayırmak için, ilgi konusu RNA'nın 3 'sekansı, sınır tamamlayıcı olan bir ~ 30 nt DNA oligonükleotid ekleyebilir ve hafif sallanan, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir (oligonükleotidin 100 nM yeterlidir).
Not: oligonükleotid çalıştırma sitesi, bir exampl olarak kullanılan PCE yapının çeviri bitişik nükleotit kalıntısı elde etmek, anti-duyarlı olanBu protokol e. Uygun sekansı tamamlayıcı ~% 40 GC içeriğine tarafından sağlanır. hedef RNA'nın asgari tamamlayıcı bölgeye verimli hibridizasyon için antisens oligonükleotidi tasarlayın. - tüpe RNaz H 5-10 adet ekleyin ve RNA RNA'ya yapışacak şekilde 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe: DNA hibritidir. steril 1.7 ml mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın; Bu örnek ilgi yakalanan RNP kompleksleri içerir.
Not: aynı kökenli RNA erişilebilirlik bağlı olarak, Rnaz H tedavi iki veya daha fazla devre alt analizler için örnek zenginliğini artırmak için yararlı olabilir. - bilinen ilişkili proteinler ve RT qPCR ardından RNA izolasyonu için eluat% 20 bir Western blotta eluat% 20 kullanın. Geri kalan% 60 kütle spektrometresi için kullanılabilir ya da protein bileşenlerini tanımlamak için.
- Buna paralel olarak, RNA izolasyonu ve RT-PCR analizi ile ayrılmış hücre lizatının bir kısım tabi. bu assessment bir RNP kompleksi içinde RNA zenginleşme bir gösterge sağlar.
Not: RNase H ile bölünmesini immunuoprecipitated karmaşık RNP serbest etkili olduğunu tespit etmek için bir kontrol Western blot izole edilmiş bir protein preparatı kullanılması.
5. Protein elektroforezi ve Western Blot Analizi
- Standart laboratuar protokolüne göre SDS-PAGE ve bağışıklık beneklenme analizi, toplam numune konusu yaklaşık% 10-20.
Not: Bu adım aşağı RNA analizinden önce, IP verimlilik ve özgüllüğü doğrulamak için hizmet vermektedir. Aynı zamanda, izole edilmiş RNP kompleksinin protein bileşiminin değerlendirilmesi için de kullanılabilir.
Immünopresipitasyon RNA 6. Koleksiyonu
Not: RNA izolasyonu tarif edilen protokol izlenerek Trizol yöntemi veya yapılabilir.
- oda t yeniden süspanse asit guanidinyum tiyosiyanat reaktif 750 ul toplam örnek yarısı ve inkübe5 dakika boyunca önceden yakalanan PCE-RNP komplekslerinden RNA ayıklanması için emperature.
- tüpe kloroform 200 ul ekle, 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve 3 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjden sonra, yeniden bir tüp içine, sulu fazı toplayın ve izopropanol eşit hacimde ekleyin. İyice karıştırın ve en azından 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. örnek glikol mavi 1 ul ekleyin ve gelecekteki bir tarihte etkili yağış veya işlenmek üzere dondurucuda -20 ° C'de saklayın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle toplamak ve RNA pelet rahatsız etmeyecek şekilde süpernatant atın; Bir P-200 mikro pipet kullanımı, bu işlemi kolaylaştırmak için tavsiye edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16,000 x g'de, her tüp, girdap ve santrifüj tüpleri% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Dikkatle toplamak ve adım 6.4 olarak süpernatant atın. Hava-RNaz içermeyen su, 100 ul 2-3 dakika ve tekrar süspansiyon pelet kurutulur.
NOT: tabanda bir sorunu önlemek için zamanı pelet hava kurur uzatmak etmeyin. - bir RNA temizleme kolona RNA örnek 100 ul uygulayın. Üreticinin protokolü kullanarak işleyin. 3 aya kadar -80 ° C 'de RNaz içermeyen su ve mağaza 30 ul RNA Zehir.
Not: Bu izole edilmiş RNA, RT-PCR, gerçek zamanlı (qPCR), mikrodizi ve RNA sıralaması ile alt baş analizi için de uygundur. RNP ve ilgi RNP izole edildiği verim bolluğu bağlı olarak, aynı lizat alt analizler için uygun yeterli bir RNA üretmek için IP iki veya daha fazla devre tabi tutulabilir.
PCR ile cDNA 7. RNA ters transkripsiyon ve amplifikasyon
- manufa göre, yüksek kaliteli, ters transkriptaz (RT) ile rastgele bir primer tarafından ters transkripsiyon için, izole RNA Konucturer talimatları.
- ilgi RNA yükseltmek için, RNase H ile bölünmesini dizisi içinde bir gen-spesifik antisens primer tasarımı. Antisens oligonükleotit, rasgele bir primer veya bir oligo-dT primeri benzer miktarlarda kullanarak (Malzeme tabloya bakınız).
Not: Oligo-dT primeri ve poli-adenylated mRNA'nın RT-PCR reaksiyonları için pozitif kontrol reaksiyonları sağlar. - Yedek cutoff tanımlar ve standart bir eğri oluşturmak için negatif kontrol lizat IP ve pozitif kontrol DNA numuneleri ile paralel olarak yapılan hazırlayıcı qPCR RT reaksiyonu (1 ul),% 5. hazırlayıcı qPCR BT değeri standart eğri aralığının dışında ise, üst üste 1 RT reaksiyonu sulandırmak: 5 dilüsyon ve adım 7.2 tekrarlayın.
NOT: Bir RNA sıralanması ve kütle spektrometresi tekniği için, Ek Yöntem dosyasına bakın. T tıklayınızo Bu Ek Yöntem dosyasını görüntülemek. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki RIP sonuçları retroviral gag RNA'lar tespit ve co-çökelti hücresel RNA'lar DHX9 / RHA ile, HIV-1 6, JUND 6 ve Hur (Fritz ve Boris-Lawrie, yayınlanmamış) de dahil olmak üzere seçildi. Retroviral 5 'UTR çekirdekte DHX9 / RHA ile birlikte çökeltmek için ve poliribozomların ilgili sitoplazmada bir arada izole etmek için ortaya konmuştur. Bu benzersiz BDT -Oyunculuk transkripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 6 olarak tanımlanır. çoğalan hücrelerde oluşan PCEgag RNA RHA ribonükleoprotein kompleksleri (RNP) izole etmek için, transfekte edilmiş HEK293 hücre lizatlarında FLAG-MS2 RNP imüno gerçekleştirilir. Sonuçlar FLAG MS2 proteinin etkin bir şekilde çökelmesini gösterir. Özellikle, DHX9 / RHA Bu RNP kompleksi içinde olup IgG izotip kontrolü içinde tespit edilir, veya negatif kontrol HEK293 hücre lizatı içinde (Şekil 2A). RNP içeren matris 30 tamamlayıcı inkübe edildi-ve NT oligonükleotid ve RNA-DNA melezi bir RNase H ile bölünmesini uygulandı. RNase H sindirimi üzerine, sıvı kısımlar Western blot ile analiz edilmiştir. RNA-DNA hibrit pozisyonunda PCEgag RNA gösterdi RNaz H bölünme özellikle 5 'UTR bağlı RNP kompleksi yayınladı. DHX9 / RHA ilişkili RNP yıkama sıvıları olarak zenginleştirilmiş olduğu tespit edilmiştir. Önemli olarak, FLAG-MS2 bağlı RNP antikor eşlenik boncuklar (Şekil 2B) ile devam etti. Hücreler ve yıkama sıvıları retroviral PCEgag RNA ihtiva eden MS2 sap-halka ko-immünopresipitasyon RT-PCR ve qRTPCR (Şekil 2C) ile doğrulandı. Sonuçlar DHX9 / RHA ve hedeflenen çeviri kontrolü 6 önemli benzersiz bir RNP olarak vurgulanır olmuştur retroviral 5 'UTR arasında seçkin bir ilişki doğruladı.
Şekil 1: RNP izolasyonu ve RNase H ile bölünmesini göre PCEgag 5 'UTR ile ilişkili özel bir RNP zenginleştirilmesi. Aşamalarını gösteren iş akışı de novo hücrelerinde oluşan seçilen bir ribonükleoprotein izole etmek için, onun oligonükleotit yönlendirmeli RNaseH bölünme ile toplanması ve RNA ve protein bileşenlerinin alt analizi. MS2 RNA kök halkası ve FLAG boncuk PCE RNA yakalamak için MS2 kılıflı protein-FLAG füzyon proteini için multimerler ile yüksek afiniteli bir etkileşim kullanılarak afinite kromatografisi özeti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Bir PCEgag RNA 6 MS2 RNA bağlama bölgelerini ihtiva eden bir hareketsizleştirilmiş FLAG-etiketli MS2 kaplama proteini tarafından yakalanan ve 5 'UTR ile ilişkili belirli RNP idiOligonükleotide yönelik RNase H ile bölünmesini ile açığa çıkarılır. HEK293 hücreleri pAR200 (PCEgag 6x MS2 içeren bir plazmid, HIV intron döngüleri) ve çekirdek yeri belirleme dizisi (NLS) işaretleyin epitop etiketli MS2 proteinini eksprese eden bir plazmid ile ko-transfekte edilmiştir. Hücreler toplandı ve sitoplazma 48 saat sonra transfeksiyon izole edildi. sitoplazmik lizatları FLAG antikor veya bir IgG kontrol ile ya immünopresipitasyona tabi tutuldu. (A), bir IP etkinliği bir anti-FLAG antikor kullanılarak bağışıklık beneklenme ile belirlenmiştir. DHX9 / RHA bir PCE bağlama proteini, bir pozitif kontrol olarak görev yapmıştır; MS2 protein ile imüno-PCE içeren RNA. Yol 1-3: IP için kullanılan giriş proteinleri. Şerit 4-5: BAYRAK MS2 FLAG IP lisat ve HEK293 sitoplazmik hücre lizat aşırı. Şerit 6: BAYRAK MS2 IgG IP lizatı aşırı. Şerit 7-9: IP'ler Flow-through. (B) 5 'UTR bağlı RNP RNase H ile bölünmesini ile zenginleştirilmiştir. şerit 1-3: RNaz H Kulvarlar 4-6 5 'UTR bağlı protein Eluatlar: antikor eşlenik boncuklar bağlanmış proteinler. RNP farklı kısımlara bağlı spesifik RNA (C), ters transkriptaz PCR ve gerçek zamanlı kantitatif PCR. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan RNP izolasyon ve aynı kökenli RNA tespiti stratejisi belirli bir RNA-protein etkileşimini inceleyen ve eş düzenleyen aday proteinleri keşfetmek hücreler belirli bir RNP seçici bir araçtır.
RNP izole yapmak için oligonükleotid yönlendirilmiş RNase H ile bölünmesini kullanmanın avantajı yakalamak ve özellikle ilgi cis-hareket eden RNA elemanına aşağı bağlanmış heterojen RNP fazla RNP cis-hareket eden RNA eleman analizi yeteneğidir. Belirli bir RNP bir soydaş RNA bolluğu RNaz H ayrılma olmadan izole toplanan RNP çok küçük bir kısmıdır, çünkü bu iş akışı önemli dezavantajı soydaş RNP kıtlığı olduğunu. Bizim tecrübelerimize göre, bu sınırlama duyarlı immunoblotting ve analizler Proteomikte tespiti için geleneksel RNA IP den 10 kat daha fazla başlangıç materyaline 5- gerektirmiştir. RNP immobilize tarafından sağlanan başka bir avantaj RNaz H tre yinelenen kolaylıkolgunun yaşı ve ek eluatın toplanması. Bizim tecrübelerimize göre, RNaz H tedavisinin 2-4 mermi ek eluat toplamak için tavsiye edildi.
Bu protokol, anahtar teknik kaygılar optimum sıcaklık korunarak ve reaktiflerin steril işlenmesini sağlayan vardır. Bütün reaktifler RNase- ve proteaz-özgür olmalıdır. RNA örnek bütünlüğünü bir RNA-protein etkileşimleri saptanabilir değilse dikkate potansiyel bir çukur olduğunu.
Bu teknik, saptama için uygun bir miktarda RNP ulaşmak için hücrelere etkili bir şekilde parçalanması. önemli bir uyarı tam olmayan hücre parçalama iken, kuvvetlice tedaviler RNA ile spesifik olmayan etkileşimleri arttırabilir. Bu nedenle, deneysel koşullar spesifik protein-RNA etkileşimlerini zenginleştirmek için ölçülmelidir. Ancak, yüksek sertlik yıkar kullanımının önemli ama geçici etkileşimler ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, yıkama koşulları consid başka değişkendirBelirli bir denemenin belirli gereksinimleri er.
RIP verimliliği aynı kökenli RNA-protein ortakları izole edilmesi için güçlü bir tekniktir, fakat fizyolojik öneme sahip bir geçici ya da zayıf etkileşimler bağlayıcı ya da yıkama adımları sırasında kaybolur. mRNP kompleksinin çapraz bağlanması, bir analizde dikkate alınması gereken bir seçenektir. Ayrıca, düzenleyici RNP analiz ederken, fizyolojik büyüme koşulları aynı kökenli RNA ekspresyon seviyesi, göz önünde bulundurulması gereken veya RBP, belirli koşullar altında, fizyolojik dalgalanmalara tabi olabilir. Ayrıca, alt baş analiz tipi de, immüno-çökeltme sırasında liziz ve yıkama koşullarının seçilmesi bir rol oynayacaktır.
Buna ek olarak, başarılı bir immünopresipitasyon hücre lisatı önemli ölçüde seyreltilmesi gerektirir (en az 1: 1). 1x yıkama tamponu (20 mM Tris-HCI, pH 7.3, 3 mM MgCl2 ve 150 mM NaCI) bileşimine, seçilmiş seyrelticiRNP bütünlüğü, çözelti çözünürlüğe veya antikor-antijen etkileşimlerini etkilemez.
Ve Tris gibi bazı deterjanlar - alt kütle spektrometrisi için, numuneler, Na +, Cl dahil olmak üzere tuzları, ari olmalıdır. Gerekirse, tampon iyonik bileşenler diyaliz veya iyonik değişim süzme ile azaltılabilir Bileşikler olabilir, ve bazı durumlarda, uçucu tamponlar son aşamasında yararlıdır. Antiserum transfeksiyon ile temsil edilen bir epitop etiketli protein izole etmek için kullanıldığı durumlarda, ilk hücre lisatı kullanılarak yapılan yeniden birleştirici proteinin Western blot doğrulama başka analizler yapılmadan önce yürütülmelidir. Durumda bir epitop etiketi kullanılır (yani, FLAG, myc, GFP ve benzeri), etiketin maruz antikor bağlanma aşamasının başarısı için çok önemlidir. Numunelerin dondurma-çözme kaçınılmalıdır.
RIP tekniği yaygın olarak transkripsiyon sonrası gen kontrolünün farklı mekanizmaları aydınlatmak için istihdam edilmiştir10,25. Bu yeni protein mRNA, protein mıkroRNA, ve protein-protein etkileşimleri 10,25 tanımlanmasını içerir. Burada, bir hücre kültürü içinde RNP bileşimin belirlenmesi için kapsamlı bir protokol sağlar. Bizim yöntemi yanı sıra nadir ve / veya geçici RNP komplekslerinin yakalanması için, kritik protein-RNA etkileşimleri hedeflenmiş ve genom değerlendirmesi için olanak sağlar.
Bu tekniğin uygulanması DHX9 / RNA helikaz A bağlı RNA'ların bizim karakterizasyonu katkıda ve retrovirüslerin kritik transkripsiyon sonrası düzenleme ve hücresel proto-onkogenlerin junD 6,26 ve Hur (Fritz ve Boris-Lawrie tanımlamak için bize yardımcı oldu , yayınlanmamış veri). Uzun kodlamayan RNP kompleksleri tarafından bağdaştırılan da dahil olmak üzere gen kontrolü için kritik mekanizmalar, anlayışımızı ilerletmek için gelecekteki çalışmalarda bu tekniğin uygulanmasını bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle NIH P50GM103297, P30CA100730 ve Kapsamlı Kanser P01CA16058 tarafından destek için minnettarım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
