Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Imitera funktionen av signalproteiner: Toward Artificial Signaltransduktion Therapy

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organic Chemistry, Weizmann Institute of Science

Introduction

Signaltransduktionsvägar spelar en viktig roll i praktiskt taget varje cellulär process och göra det möjligt för cellen att snabbt reagera på signaler från omgivningen. 1 Dessa vägar är ofta utlöses av bindningen av en signalmolekyl till ett extracellulärt receptor, vilket resulterar i aktivering av intracellulära enzymer. Amplifiering och förökning av denna signal inom cellen förmedlas av funktionen av signalproteiner som bildar ett nätverk av protein-proteininteraktioner i vilka enzymer är reversibelt aktiveras med hög specificitet. Eftersom dysreglering av dessa nät leder ofta till cancerutveckling, har det varit mycket intresse för att etablera "signaltransduktion terapi av cancer", 2, varigenom läkemedel är utformade för att störa maligna signaleringsvägar. Vi har nyligen föreslagit ett alternativ till signaltransduktion terapi som bygger på förmågan hos läkemedel att generera onaturliga signaltransduktionsvägar.

För att demonstrera genomförbarheten av detta tillvägagångssätt har vi nyligen skapat en syntetisk kemikalie givarens 4 som möjliggör blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF) att trigga klyvning av en cancer prodrug genom att aktivera glutation-s-transferas (GST), som är inte dess naturliga bindningspartner. Strukturen för denna "transduktor" består av en anti-PDGF-DNA aptamer som är modifierad med ett bivalent hämmare för GST. Hence, tillhör denna syntetiska medel till en familj av molekyler med bindningsställen förolika proteiner, 5-7 såsom kemiska inducerare av dimerisering (CID) 8-10 och även den grupp av protein bindemedel baserade på oligonukleotid-syntetisk molekyl-konjugat. 11-21

De allmänna principerna för utformning av sådana system beskrivs häri och detaljerade protokoll för att syntetisera och testa funktionen hos denna "givare" med konventionella enzymatiska analyser tillhandahålls. Detta arbete är avsett att underlätta utveckling av ytterligare "givare" av denna klass, som kan användas för att medla intracellulär protein-protein kommunikation och följaktligen för att inducera artificiell cell signalvägar.

Figur 1 beskriver schematiskt verksamhetsprinciper syntetiska "kemiska givare" som kan förmedla onaturliga protein-proteinkommunikation. I denna illustration, en "kemisk givare", som integrerar syntetiska bindemedel för proteins I och II (bindemedel I och II), gör det möjligt för protein II för att utlösa den katalytiska aktiviteten av protein I, vilket inte är dess naturliga bindningspartner. I frånvaro av protein II, binder omvandlaren det katalytiska stället i enzymet (protein I) och hämmar dess aktivitet (figur 1, state ii). Bindningen av den "transduktor" till protein II emellertid gynnsam för växelverkan mellan bindemedels I och ytan av protein II (figur 1, tillståndet iii), vilket minskar dess affinitet mot protein I. Som ett resultat av den effektiva koncentrationen av den " fri "transduktor i lösningen minskar, vilket leder till dissociation av omvandlaren-protein i-komplexet och reaktivering av protein i (fig 1, state iv). Sammantaget ger dessa steg belysa tre grundläggande principer för utformningen av effektiva "givare": (1) en "givare" bör ha en särskild pärm för varje proteinmål, (2) interaktionen betwesv bindemedel II och protein II bör vara starkare än interaktionen mellan bindemedlet I och protein I, och (3) bindemedel Jag måste kunna interagera med ytan av protein II. Den sistnämnda principen inte nödvändigtvis att bindemedel jag ensam skulle ha en hög affinitet och selektivitet mot protein II. I stället är det baserat på våra senaste studierna som visade att föra en syntetisk molekyl i närhet till ett protein är troligt att främja växelverkan mellan denna molekyl och ytan av proteinet. 19,22,23

Figur 1

Figur 1:. Drifts principer för "kemiska givare" När "kemisk givare" sätts till ett aktivt protein I (stat i) binder till sin aktiva plats genom bindemedel I och hämmar dess aktivitet (tillstånd ii). I närvaro av protein II, men den obundna "kemisk transducer 'interagerar med protein II genom bindemedel II, som främjar interaktion mellan bindemedels I och ytan av protein II. Detta inducerade bindemedel I-protein II interaktion minskar den effektiva koncentrationen av bindemedel I, vilket leder till dissociation av "transducer'-protein I-komplexet och protein jag reaktivering (tillstånd iv). Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntes av "Chemical Transducer"

  1. preliminära Beredningar
    1. Förbereda 2 M trietylammoniumacetat (TEAA) buffert genom att blanda 278 ml av trietylamin med 114 ml ättiksyra och 400 ml ultrarent vatten. Justera pH till 7 och tillsätt vatten till en slutlig volym på 1 L. Förvara den i en mörk flaska.
      Obs: Denna lösning är stabil i flera år.
    2. Bered en 5 mM askorbinsyralösning genom upplösning av 18 mg askorbinsyra i 20 ml ultrarent vatten. Använd en färsk lösning; lösningen är stabil under en dag.
    3. Bered en 10 mM Cu (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) lösning genom upplösning av 25 mg koppar (II) sulfat-pentahydrat i 10 ml ultrarent vatten och 58 mg TBTA i 11 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Blanda de två lösningarna. Förvara det i rumstemperatur och skydda den mot ljus.
  2. konjugering ordningen
    1. Lös upp 100 nmol av den modifierade oligonukleotiden (ODN-1) i 80 ^ ilav färskt ultrarent vatten. Tillsätt 20 | il 2 M TEAA, pH = 7. Tillsätt 80 | il av en nyligen framställd lösning av askorbinsyra (5 mM i vatten).
    2. Lös 1,5 fimol (574,5 mikrogram) av azido-modifierad etakrynsyra i 180 pl DMSO och lägga till lösningen. Avlufta den med hjälp av argon i 60 sek och snabbt lägga till 40 pl från Cu (II) / TBTA-lösning (10 mM i 55% (volym / volym) DMSO / vatten).
    3. Rensa igen med argon, sluter tätt, och rör om över natt.
    4. Övervaka framskridandet av reaktionen och rena konjugatet genom RP-HPLC (mobil fas: A) 5% acetonitril, 5% TEAA, 90% ultrarent vatten; B) 65% acetonitril, 5% TEAA, 30% ultrarent vatten). 24

2. Styra GST aktivitet av PDGF

  1. preliminära Beredningar
    1. Förbered 50 ml av analysbufferten genom att blanda 33,9 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBSx1) med 16,1 ml av ultrarent vatten för att uppnå en 8 mM slutlig fosfatkoncentration och add 23,8 mg MgCl2 för att uppnå en 5 mM slutlig koncentration.
    2. Bered en förrådslösning av GST M1-1 genom upplösning av proteinet i en buffert innehållande 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), och 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till en slutlig koncentration av 30 ^ M. Dela denna lösning i små portioner och förvara vid -80 C. Späd nytt, enligt avsnitt 2.1.5.1, i analysbufferten och hålla på is.
      Anmärkning: Lösningen kommer att vara stabil under ca 5 h, eller tills det finns en minskning av enzymaktiviteten.
    3. Förbered underlaget enligt följande instruktioner:
      1. Lös upp 10 mg av reducerat glutation (GSH) i 325 | il av ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 100 mM förrådslösning. Späd 21 pl från denna stamlösning i 979 pl analysbuffert för en slutlig koncentration av 2,1 mM arbetslösning.
      2. Lös 10 mg 2,4-dinitroklorbensen (CDNB) i 492 pl ethanol till en slutlig koncentration av 100 mM förrådslösning. Späd 43,2 | il från stamlösning i 956.8 il av en analysbuffert för en slutlig koncentration av 4,32 mM arbetslösning.
    4. I en 96-brunnar, sätta varje substrat i en separat rad (12 brunnar). Sätt åtminstone 60 ^ till varje brunn för att möjliggöra snabb och enkel tillbakadragande av lösningen. Täck plattan med en aluminiumplåt för ljusskydd.
    5. Bered följande stamlösningar i analysbufferten:
      1. Späd GST M1-1 med 50 till en slutkoncentration av 0,6 | iM av dimeren.
      2. Späd "kemisk givare" till en 30 ^ M förrådslösning.
      3. Späd PDGF till en slutlig koncentration av 40 ^ M.
      4. Späd PDGF aptamer till en slutlig koncentration av 250 ^ M.
  2. Mät GST-aktivitet i närvaro av "kemisk givare" och PDGF.
    1. Inrätta ett experimentellt förfarande In plattläsaren för kinetisk mätning.
      1. Skapa ett nytt experiment som en "standardprotokoll".
      2. Tryck på "förfarande" för att öppna upp förfarandet inställningsfönstret.
      3. I popup listan på den övre sidan av fönstret, välj "384 platta" typ enligt tallriks tillverkaren.
      4. Tryck på 'Läs' i menyn till vänster.
      5. Beträffande detekteringsmetod välja "Absorbans".
      6. Beträffande typen läs välja "Slutpunkt".
      7. Skriv 340 nm på våglängdsfönster.
      8. Tryck på "Full plattan" botten på den övre högra sidan och välj brunnen som ska mätas.
      9. Tryck på "OK" för att stänga "Läs" fönstret.
      10. Välj "start kinetisk" i menyn till vänster.
      11. Gör körtid 10 min.
      12. Välj alternativet minimiintervall.
      13. Tryck på "OK" för att stänga den kinetiska fönstret.
      14. Dra "Läs" linje into den kinetiska mätningen.
      15. Tryck på "validera" -knappen och sedan på "OK" -knappen.
      16. Spara experimentet.
      17. Tryck på "spela" -knappen. En dialogruta visas - Tryck bara på "OK" knappen när mätningen ska startas.
    2. För att utföra tre exemplar experiment förbereda fyra prover vardera innehållande 3,25 mikroliter av "kemisk givare" och 3,25 pl GST M1-1. Lägg till varje prov 0, 1,2, 2,4 eller 4,9 | il PDGF och 123,5, 122,3, 121,1, eller 118,6 il av analysbuffert, respektive.
    3. Inkubera lösningen vid rumstemperatur under 10 min.
    4. I en 384-transparent brunnars platta, sätt 40 | il av prov i varje brunn. Sätt proverna endast i de udda brunnar eller endast i de jämna brunnar i samma linje att tillåta användning av en multi-pipett för substrattillsats.
    5. Med hjälp av en 12-kanalers multi-pipett, snabbt lägga till 10 l från varje than substrat som pre-prepared i 96-brunnar (avsnitt 2.1.4). Blanda försiktigt och snabbt för att undvika bubblor. För in plattan i läsaren och starta den kinetiska mätningen. Eftersom GST kinetik är ganska snabb, försöker att minimera tiden mellan substrattillsats och början av den kinetiska mätningen.
  3. GST Aktivering / Hämnings Cycles förmedlas av "kemisk givare".
    1. För att utföra tre exemplar experiment, förbereda 5 prover vardera innehållande 84,5 pl analysbuffert, 3,25 pl "kemisk givare", och 3,25 pl GST M1-1. Inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
    2. Lägg 3,65 pl analysbuffert till prov 1 och 3,65 pl PDGF prover 2-5. Inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
    3. Lägg 3.12 il analysbuffert till proverna 1-2 och 3,12 pl PDGF aptamer prover 3-5. Inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
    4. Lägg 24,4 pl analysbuffert till prover1-3 och 24,4 | il av PDGF till prover 4-5. Inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
    5. Lägga 7,8 pl av analysbuffert till proverna 1-4 och 7,8 | il av PDGF aptamer till prov 5. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
    6. I en 384-transparent brunnars platta, sätt 40 pl prov i varje brunn. Sätt prover endast i den udda eller bara i de jämna brunnar i samma linje.
    7. Med hjälp av en 12-kanalers multi-pipett, snabbt lägga till 10 l från varje substrat (färdiga i 96-brunnar). Blanda försiktigt och snabbt för att undvika bubblor. För in plattan i läsaren och starta den kinetiska mätningen.
    8. Beräkna V 0 [mOD / min] under varje tillstånd genom att subtrahera OD mättes vid 340 nm vid t = 0,5 min från OD mättes vid 340 nm vid t = 1,5 min för att bedöma aktivering / inhibering återvinning. 25
  4. Utvärdera realtid svar av "kemisk givare" till förändringar i miljön.
      <li> realtid effekten av PDGF tillägg
      1. Inrätta ett försöksförfarande i plattläsaren för kinetisk mätning.
      2. Upprepa steg 2.2.1.1-2.2.1.10.
      3. Gör körtiden 3,5 min.
      4. Välj alternativet minimiintervall.
      5. Tryck på "OK" för att stänga den kinetiska fönstret.
      6. Dra "Läs" linje i den kinetiska mätningen.
      7. Välj Plate Out / In på menyn till vänster.
      8. Välj alternativet "platta ut (ingen dialog).
      9. Välj "Delay" alternativ på menyn till vänster och anger 30 sek.
      10. Välj Plate Out / In på menyn till vänster.
      11. Välj alternativet "plattan i (ingen dialog).
      12. Skapa en andra kinetisk mätning av steg 2.2.1.4 upprepa - 2.2.1.14 men i avsnitt 2.2.1.11 ställa den kinetiska att vara 25 minuter i stället för 10 minuter.
      13. Tryck på "validera" -knappen och sedan på "OK" -knappen.
      14. Spara experimentet.
      15. Tryck på "play "-knappen. En dialogruta visas - Tryck bara på "OK" knappen när mätningen ska startas.
      16. Bered två prover genom att blanda 1 pl GST M1-1 och 1 pl av "kemisk givare" i 38 pl analysbuffert. Sätt proverna i två brunnar i en 384-transparent brunnar, lämnar en tom bra mellan dessa två brunnar.
      17. Med hjälp av en 12-kanalers multi-pipett, snabbt lägga till 10 l från varje substrat, blanda försiktigt och snabbt för att undvika bubblor sätter plattan i läsaren och starta den kinetiska mätningen.
      18. När plattan öppnar upp (efter 3,5 min), snabbt lägga 1,125 pl av PDGF till en av brunnarna, blanda försiktigt och låt plattan för att stänga upp för de återstående kinetiska mätningar.
    1. Realtid effekten av tillsats av PDGF aptamer
      1. Upprepa steg 2.4.1.1-2.4.1.15.
      2. Bered två prover genom att blanda 1 pl GST M1-1, 1 pl av "kemisk givare ", och 1,125 il PDGF i 36,9 pl analysbuffert. Sätt proverna i två brunnar i en 384-transparent brunnar, lämnar en tom bra mellan dessa två brunnar.
      3. Med hjälp av en 12-kanalers multi-pipett, snabbt lägga till 10 l från varje substrat, blanda försiktigt och snabbt för att undvika bubblor sätter plattan i läsaren, och starta den kinetiska mätningen.
      4. När plattan öppnar upp (efter 1,5 min), snabbt lägga 1,2 pl av PDGF aptamer till ett av brunnarna, blanda försiktigt och låt plattan för att stänga upp för de återstående kinetiska mätningar.
  5. Mät JS-K prodrugaktivering av GST i närvaro av "kemisk givare" och PDGF.
    1. Inrätta ett försöksförfarande i plattläsaren för kinetisk mätning.
      1. Skapa ett nytt experiment som en "standardprotokoll".
      2. Tryck på "förfarande" för att öppna upp förfarandet inställningsfönstret.
      3. I pop up-lista på ovansidan av fönstret väljer du "384 platta" typ enligt tallriks tillverkaren.
      4. Tryck på 'Läs' i menyn till vänster.
      5. När det gäller detektionsmetoden valde "Absorbans".
      6. Beträffande typen läs välja "Slutpunkt".
      7. Skriv 305 nm på våglängdsfönster.
      8. Tryck på "Full plattan" -knappen på övre högra sidan och välj brunnen som ska mätas.
      9. Tryck på "OK" för att stänga "Läs" fönstret.
      10. Välj "start kinetisk" i menyn till vänster.
      11. Gör körtid 10 min.
      12. Välj alternativet minimiintervall.
      13. Tryck på "OK" för att stänga den kinetiska fönstret.
      14. Dra "Läs" linje i den kinetiska mätningen.
      15. Tryck på "validera" -knappen och sedan på "OK" -knappen.
      16. Spara experimentet.
      17. Tryck på "spela" -knappen. En dialog box visas - Tryck bara på "OK" knappen när mätningen ska startas.
    2. För NO-produktion mätningar använder en nitrit / nitrat kalorimetrisk kit. I en 96-brunnsplatta för in 50 | il analysbuffert i en rad, 70 pl av Griess I reagens i en andra rad, och 70 | il av Griess II reagens i en tredje rad.
    3. För att utföra tre exemplar experiment förbereda fyra prover som vardera innehåller 4,8 mikroliter av "kemisk givare". Att prova en, tillsätt 155,2 pl analysbuffert; att prova två, tillsätt 3,2 pl GST-M1-1 och 152 pl analysbuffert; att prova 3, tillsätt 9,6 pl PDGF och 145.6 il analysbuffert; och att prov 4, tillsätt 3,2 pl GST-M1-1, 9,6 pl PDGF och 142,4 pl analysbuffert.
    4. Inkubera lösningen vid rumstemperatur under 10 min.
    5. I en 384-transparent brunnars platta, sätt 50 | il prov i varje brunn. Sätt prover endast i udda eller endast iens brunnar i samma rad för att tillåta användning av en multi-pipett för substrattillsats.
    6. Lägg 0,54 pl JS-K (5 mm i DMSO) till varje brunn.
    7. Med hjälp av en 12-kanalers multi-pipett, snabbt lägga 10 l från GSH lösning (färdiga i 96-brunnar), blanda försiktigt och snabbt för att undvika bubblor. För in plattan i läsaren och starta den kinetiska mätningen.
    8. Omedelbart efter den kinetiska mätningen, med en 12-kanalers multi-pipett, ta 50 ul från varje prov i analysbufferten rad i den färdiga 96-brunnar och snabbt lägga till den 50 pl Griess I reagens och 50 ul Griess II reagens. Inkubera samtidigt skydda från ljus under 10 min vid RT och mät absorbansen vid 550 nm.
      Obs: analysbuffert och reagenser volymerna är beroende av kit "protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utformning, syntes och verkningsmekanismen för en "kemisk omvandlare" som kan inducera artificiell kommunikation mellan PDGF och GST presenteras i figur 2. Strukturen för den "transduktor" integrerar en PDGF-DNA aptamer och en bis-ethacrynic amid (BEA ), som är en känd GST inhibitor (Figur 2a). 19 Dessa bindemedel gör det möjligt för "transduktor" för att binda både PDGF och GST med olika affinitet, nämligen, med dissociationskonstanter (Kd: s) av 26 nM och 144 nM, respektive . 4 Dessutom, enligt denna utformning, bindningen till PDGF bör inducera icke-specifika interaktioner mellan BEA enheten och ytan av PDGF, vilket markant skulle minska potensen hos den BEA-inhibitor. 19,22,23 figur 2b illustrerar den manövermekanism som ligger bakom detta system. Vid tillsats av "givaren" till en aktiv GST, dentvå EA-enheter samtidigt binda både aktiva platser i denna dimera enzymet och hämmar dess aktivitet. I närvaro av PDGF, emellertid en PDGF-'transducer "komplex bildas, vilket förhindrar BEA enheten från att inhibera GST. Detta leder följaktligen till en dissociation av GST-'transducer "komplex och till GST reaktive. GST kan sedan åter inhiberas genom att tillsätta en omodifierad PDGF aptamer som förskjuter "kemisk givare" och gör det möjligt att inhibera GST igen.

Förmågan hos PDGF att styra GST-aktivitet visades först genom att mäta GST (10 nM) aktivitet med och utan "kemiska givare (500 nM) och mäta aktiviteten hos GST-'chemical givare" komplex i närvaro av olika koncentrationer av PDGF (250, 500, och 1000 nM) (figur 3a). Efter att ha konstaterat att "kemisk givarens inducerar artificiell PDGF-GST kommunikation, vinästa fastställts att denna konstgjorda kommunikation, liknande signaltransduktionsstegen, är också reversibel och snabbt anpassar sig till förändringar i miljön. Reversibel aktivering / inhibering av GST utfördes genom sekventiella tillsatser av PDGF och omodifierad PDGF aptamer till GST-'chemical transduktor "komplex (figur 3b). Svaret från systemet till ändringar i realtid i sin omgivning utvärderades genom att mäta GST-aktivitet samtidigt lägga de olika ingångarna. En snabb ökning av GST-aktivitet observerades vid tillsats av PDGF (750 nM) till GST-'transducer "komplex (10 nM och 500 nM, respektive) 3,5 minuter efter tillsats av substrat (figur 4a). På liknande sätt observerades en minskning i GST-aktivitet som observeras vid tillsatsen av PDGF aptamer (5 | iM) till en blandning av GST (10 nM), PDGF (750 nM), och den "kemiska omvandlaren '(500 nM) (figur 4b).

Finally visade vi förmågan hos ett sådant system för att styra prodrugaktivering som svar på förändringar i miljön. JS-K är ett cancerläkemedel prodrug som aktiveras av GST att frigöra giftiga NO (figur 5a). Mängden NO frisätts vid tillsats av JS-K (45 | iM) till den "kemiska omvandlaren '(750 nM) och olika kombinationer av GST (10 nM) och PDGF (2 ^ M) mättes (figur 5b), vilket bekräftar att endast närvaron av både GST och PDGF kommer att resultera i prodrugaktivering.

figur 2
Figur 2. Kemisk givare "-. Syntes och rörelsemekanismen (a)" kemisk givare "består av en PDGF aptamer, en bivalent ethacrynic amid (EA) GST-hämmare, en fluorofor (FAM), och en utsläckande (Dabcyl) . Denna aptamer-inhibitor-konjugatsyntetiseras genom att fästa en azid-modifierad ethacrynic amid (EA) derivatet till en dialkyne-modifierade och fluorescensmärkt DNA-aptamer (ODN-1). Re-tryckt med tillstånd från referens 4. (B) Den enzymatiska aktiviteten av GST inhiberas av den "kemiska omvandlaren", på grund av att bindningen av de EA grupperna vid enzymets aktiva ställen. Tillsats av PDGF leder till bildandet av den PDGF-'chemical transduktor "komplex, vilket stör den" transducer'-GST-interaktion, därför att återställa den enzymatiska aktiviteten. Följande tillägg av en omodifierad PDGF aptamer släpper "kemisk givare" och gör det möjligt att åter hämma enzymet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
fi. gur 3: PDGF-kontrollerade GST-aktivitet (a) GST (10 nM) enzymaktivitet i närvaro (-) och frånvaro (-) av "kemisk givare (500 nM), och i närvaro av" kemisk givare '(500 nM) med ökande koncentrationer (250, 500, eller 1000 nM) av PDGF (---). (B) Hämning-aktiveringscykler av GST enzymatisk aktivitet manifesteras av förändringar i den initiala hastigheten (V 0) som svar på sekventiella tillsatser (IIV) av PDGF och omodifierad PDGF aptamer till GST-'chemical givare "komplex: (I) ingen, (II) PDGF (750 nM), (III) PDGF aptamer (4 M), (IV ) PDGF (5 | iM), och (V) PDGF aptamer (10 | iM). Diagrammet visar medelvärdet ± stdav av tripletter. Åter tryckt med tillstånd från referens 4. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
. Figur 4: Real-time kontroll av GST-aktivitet (a) Förbättring av GST enzymatisk aktivitet upptäcks omedelbart efter tillsats av 750 nM PDGF (-) till en lösning innehållande GST (10 nM) och "kemiska givare (500 nM) ( -) vid t = 3,5 min. (B) Tillsats av en omodifierad PDGF aptamer (5 M) (-) till en lösning innehållande GST (10 nM), PDGF (750 nM), och "kemiska givare (500 nM) (-) vid t = 1,5 min leder till en omedelbar minskning i den enzymatiska reaktionshastigheten. Åter tryckt med tillstånd från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5 "src =" / filer / ftp_upload / 54.396 / 54396fig5.jpg "/>
Figur 5:. Kontrollerad prodrugaktivering (a) GST aktivering av JS-K prodrug att frigöra giftiga NO. (B) NO-frisättning i närvaro av "kemisk givare" och olika kombinationer av GST (10 nM) och PDGF (2 M). Diagrammet visar medelvärdet ± stdav av tripletter. Ändrad med tillstånd från referens 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av Stiftelsen Minerva, HSFP Organization, och ett europeiskt forskningsråd Grant (Starting Grant 338.265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-chloro-2,4-dinitrobenzene Sigma-Aldrich 237329
Acetic acid Bio Lab 01070521
Acetnitrile J.T.Baker 9017-03
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
Copper(II) Sulfate pentahydrate Merck-Millipore 102790
Dimethyl sulfoxide Merck-Millipore 802912
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological Industries 02-023-5A
Ethacrynic acid Tokyo Chemical Industry Co. Ltd E0526
Glutathione-s-transferase M1-1 Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
JS-K Sigma-Aldrich J4137
L-glutathione reduced Sigma-Aldrich G4251
Magnesium Chloride J.T.Baker 0162
nitrate/nitrite colorimetric assay kit Cayman Chemical 780001
Oligonucleotides W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University custom order
PDGF-BB Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)
TBTA Sigma-Aldrich 678937
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886
Desalting column GE Healthcare illustra MicroSpin G-25 Columns
HPLC Waters  2695 separation module
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm)
HPLC column Waters XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 10 mm × 50 mm)
Plate reader BioTek synergy H4 hybrid

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
  2. Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
  3. Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
  4. Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
  5. Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
  6. Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
  7. Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
  8. Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
  9. DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
  10. Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
  11. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
  12. Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
  13. Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
  14. Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
  15. Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
  16. Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
  17. Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
  18. Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
  19. Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
  20. Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
  21. Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
  22. Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
  23. Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
  24. Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
  25. Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
  26. Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).

Tags

Biokemi Artificiell signaltransduktion riktad frisättning av läkemedel biomimetisk kemi syntetiska proteinreceptorer kemisk biologi DNA-baserade proteinreceptorer omkopplingsproteinbindemedel
Imitera funktionen av signalproteiner: Toward Artificial Signaltransduktion Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peri-Naor, R., Motiei, L.,… More

Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54396, doi:10.3791/54396 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter