एक बेहतर पोलीमरेज़ चेन तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुफेरफिश प्रजातियों जीनोटाइपिंग के लिए प्रतिक्रिया प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता विधि वर्णित है। एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ पचा amplicons को अलग करने के लिए कार्यरत है। इस विधि oligonucleotides के monoisotopic जनता है, जो आधार संरचना की पहचान करने के लिए उपयोगी है स्पष्ट कर सकते हैं।
एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) -restriction टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) तरल क्रोमैटोग्राफी / electrospray आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस) द्वारा विषाक्त पुफेरफिश प्रजातियों जीनोटाइपिंग के लिए विधि के एक उन्नत संस्करण में वर्णित है। डीएनए निष्कर्षण एक सिलिका झिल्ली आधारित डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग किया जाता है। पीसीआर प्रवर्धन एक डिटर्जेंट मुक्त पीसीआर बफर का उपयोग करने के बाद, प्रतिबंध एंजाइमों प्रतिक्रिया समाधान सफ़ाई के बिना समाधान के लिए जोड़ रहे हैं। एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ और एक फूरियर उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर एक संशोधित Kingdon जाल विश्लेषक होने स्पेक्ट्रोमीटर, क्रमशः जुदाई और पता लगाने के लिए कार्यरत हैं। मोबाइल चरण, 400 मिमी 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol से मिलकर, 15 मिमी triethylamine (7.9 पीएच) और मेथनॉल, 0.4 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर दिया जाता है। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस विश्लेषण के लिए समय चक्र स्तंभ का संतुलन सहित 8 मिनट है। Deconvolution सॉफ्टवेयर एक आइसोटोप वितरण मॉडल ओ होनेoligonucleotide च जन स्पेक्ट्रम से इसी monoisotopic द्रव्यमान की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (रेंज 26-79 न्यूक्लियोटाइड) के विश्लेषण के लिए, जन सटीकता था 0.62 ± 0.74 पीपीएम (एन = 280) और उत्कृष्ट सटीकता और परिशुद्धता एक ताला बड़े पैमाने पर मानक के उपयोग के बिना 180 घंटे के लिए निरंतर थे।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) न्यूक्लिक एसिड, मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) और electrospray आयनीकरण (ईएसआई) के तेजी से और विश्वसनीय पहचान के लिए एक स्वीकृत प्रौद्योगिकी आयनीकरण 1,2 के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। MALDI तकनीक को आम तौर पर एक समय की उड़ान (TOF) विश्लेषक के साथ संयुक्त है; हालांकि, MALDI-TOF एमएस के आवेदन कम ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स तक सीमित है (~ 25 न्यूक्लियोटाइड (एनटी)) बाद के विखंडन, अभिवर्तन गठन और कम आयनीकरण दक्षता 1,2 के कारण। इसके विपरीत, ईएसआई अब ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (> 100 NT) के लिए लागू है, लेकिन कई के कई राज्यों के प्रभारी आयनों का आरोप ([एम-राष्ट्रीय राजमार्ग] एन) Biomacromolecules से एक साथ उत्पादन कर रहे हैं और इसलिए, analyte की बड़े पैमाने पर ऊपरी पार कर सकते हैं स्पेक्ट्रोमीटर की मी / z रेंज की सीमा। इस जटिल स्पेक्ट्रा की व्याख्या, यानी, एक आरोप राज्य श्रृंखला के परिवर्तन के लिए इसी मास में की आवश्यकता हैdeconvolution के माध्यम से।
एक छोटा सा अणु की बड़े पैमाने पर माप, monoisotopic जन की चोटी, यानी के मामले में, प्रत्येक तत्व का एकमात्र सबसे आम आइसोटोप युक्त अणु की बड़े पैमाने पर सबसे प्रचुर मात्रा में है और स्वाभाविक रूप से मनाया 3। आणविक वजन बढ़ता है, उच्च मी / z और monoisotopic पीक करने के लिए समस्थानिक वितरण पारियों आधारभूत शोर 3-5 से छिप जाता है। एक बार जब monoisotopic चोटी अब कोई 10 से अधिक केडीए 3 आम जनता के लिए detectable है, औसत आणविक जन monoisotopic बड़े पैमाने पर 5 के बजाय माप के लिए प्रयोग किया जाता है। ऐसे मामलों में, समस्थानिक वितरण में जो व्यक्ति चोटियों में से प्रत्येक 1 दा से अलग है ही देखा जा सकता है जब एक उच्च संकल्प जन विश्लेषक एक TOF, एक फूरियर संशोधित बदलने Kingdon जाल विश्लेषक 6, या एक फूरियर आयन साइक्लोट्रॉन प्रतिध्वनि के रूप में इस तरह के विश्लेषक के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, सबसे प्रचुर मात्रा में चोटी s हैometimes औसत आणविक जन 5 के साथ संगत नहीं। इन समस्याओं को सही analytes का निर्धारण करने के लिए कठिनाई पैदा कर सकते हैं।
स्थिर आइसोटोप की प्राकृतिक बहुतायत में भिन्नता और करने में कठिनाइयों का औसत आणविक जन के निर्धारण को देखते हुए, monoisotopic द्रव्यमान का माप biomolecules 3,4 की बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए आदर्श है। अभ्यास में, चाहे एक monoisotopic चोटी या मनाया जा सकता है नहीं, monoisotopic बड़े पैमाने पर सैद्धांतिक एक गणना की एक मॉडल analyte 4,7-10 से करने के लिए मनाया समस्थानिक वितरण के पैटर्न की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। फिटिंग एल्गोरिथ्म 8 अब मालिकाना सॉफ्टवेयर में शामिल किया है।
ईएसआई एमएस के संदर्भ में, एक डीएनए द्वैध, शुद्धि और desalting की हदबंदी आयन दमन और अभिवर्तन गठन 2,10-14 के कारण आयनीकरण की विफलता से बचने के लिए प्रत्यक्ष माप के लिए आवश्यक हैं। इन प्रक्रियाओं troubl हैंesome, तथापि, पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियों विश्लेषणात्मक व्यावसायिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), नमूना तैयार करने और ईएसआई एमएस रोगजनकों 15-20 का पता लगाने के लिए शामिल करने के लिए विकसित किया गया है। एक और दृष्टिकोण अलग होने के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) पेश कर रहा है। नियंत्रण रेखा coexisting पदार्थों से analytes की एक ऑन लाइन जुदाई प्रदान करता है और 21,22 आयनीकरण करने के लिए एक श्रमसाध्य नमूना तैयार करने से पहले की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, एक एमएस-संगत मोबाइल चरण का उपयोग कर न्यूक्लिक एसिड की जुदाई ऐसी दवाओं, पेप्टाइड्स और प्रोटीन न्यूक्लियोटाइड की polyanionic प्रकृति के कारण के रूप में सबसे अन्य यौगिकों के लिए अधिक से अधिक कठिन है। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस के सबसे सफल उदाहरण आयन-जोड़ी के इस्तेमाल को शामिल रिवर्स चरण नियंत्रण रेखा। 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol के एक मोबाइल चरण (HFIP) -triethylamine (चाय) -methanol शुरू में Apffel एट अल द्वारा। अलग करने और कम ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 23 का पता लगाने के लिए प्रस्तावित किया गया था। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस differentiatio के लिए जीनोटाइपिंग के आवेदनरोगज़नक़ प्रजातियों, एकल nucleotide बहुरूपताओं और कम मिलकर दोहराता की n एक केशिका बहुलक केवल पत्थर का खंभा स्तंभ अब ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 1,21,24-33 अलग नहीं कर सकता है कि का उपयोग कर सूचना दी गई है।
जापान और संयुक्त राज्य अमेरिका में, गंभीर विषाक्त भोजन गलत पहचान और पुफेरफिश के अनुचित तैयारी के कारण हुई है, और इस तथ्य यह है कि वितरण और पुफेरफिश की तैयारी सख्ती से खाद्य सुरक्षा कानून 34,35 द्वारा नियंत्रित किया जाता है के बावजूद है। इसके अलावा, एक जानबूझकर पुफेरफिश निकालने का उपयोग हत्या जापान 36 में होती थी। इसलिए, पुफेरफिश प्रजातियों के भेदभाव दोनों सार्वजनिक स्वास्थ्य और फॉरेंसिक जांच पहलुओं से आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि Takifugu rubripes पुफेरफिश के अन्य प्रकार की तुलना में कहीं अधिक महंगा है, एक भेदभाव क्षमता भी भोजन धोखाधड़ी जांच के संदर्भ में की जरूरत है।
इधर, मीटर का निर्धारण करने के लिए एक विस्तृत विधिनियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस द्वारा एक पीसीआर उत्पाद एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ और एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने का onoisotopic बड़े पैमाने पर वर्णित है। विशेष रूप से, दृष्टिकोण विषाक्त पुफेरफिश पीसीआर प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) विधि 37, जो एमएस का उपयोग कर जानवरों की प्रजातियों में भेदभाव के लिए पहला उदाहरण है के उपयोग पर आधारित प्रजातियों के भेदभाव की अनुमति के लिए विकसित किया गया है।
डीएनए निकालने के लिए, रक्त और ऊतकों से डीएनए निकालने के लिए एक वाणिज्यिक किट मामूली संशोधन (proteinase कश्मीर की राशि और सेल समाधान की centrifugation) के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है। हालांकि, किसी भी निकासी किट के रूप में लंबे समय के रूप में सेलुलर डीएनए उचित वसूली और पीसीआर के लिए पवित्रता के साथ निकाला जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि मांसपेशियों, पंख, लीवर, अंडाशय, और त्वचा 37 का उपयोग कर परीक्षण किया गया है। फिन जो proteinase लालकृष्ण ताजा, जमे हुए, सूखे उबला हुआ और पके हुए पुफेरफिश नमूने सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया 37 के साथ तेजी से सेल में सक्षम बनाता है बड़े सतह क्षेत्र, की वजह से विशेष रूप से उपयुक्त है।
पीसीआर प्राइमर सेट (तालिका 1) पुफेरफिश के लिए बनाया गया है और mitochondrial -16 पुफेरफिश की ribosomal शाही सेना जीन बढ़ाता है। बढ़ाना लक्ष्य डीएनए 114-115 बीपी (जीनस Takifugu) और 86 बी पी (जीनस Lagocephalus) (5 तालिका) है। विधि विकास की सुविधा के लिएNT, संश्लेषित लक्ष्य दृश्यों होने ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स बजाय प्रामाणिक पुफेरफिश नमूनों को एकत्रित करने की संदर्भ के लिए इस्तेमाल किया गया। प्राइमर सेट एक और प्राइमर उद्देश्य के जवाब में सेट द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, तथापि, enzymatic पाचन के बाद अंतिम डीएनए लंबाई NT कम से कम 100 जन स्पेक्ट्रम सफल deconvolution के लिए आवश्यक की गुणवत्ता को बनाए रखने के संदर्भ में किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, सी-जाल में नाइट्रोजन दबाव कम किया जाना चाहिए जब लक्ष्य oligonucleotide के बारे में 75 NT से अधिक लंबी है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम की गुणवत्ता में सफल deconvolution के लिए अपर्याप्त है। ऐसी सीमाओं साधन सॉफ्टवेयर में हाल की घटनाओं के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है, प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में अन्यथा चेसिस के अंदर सी-जाल के लिए वाल्व देखते जाना चाहिए। नमूना तैयार करने के लिए के रूप में, डिटर्जेंट मुक्त अभिकर्मकों के उपयोग के उचित शिखर आकार, पर्याप्त शिखर तीव्रता और स्थिर अवधारण समय 31 के मामले में बाद में नियंत्रण रेखा के लिए महत्वपूर्ण है।
<p cलड़की = "jove_content"> एक PS-डीवीबी केशिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ 21,24-33, एक सी 18 रिवर्स चरण कण सिलिका स्तंभ 23,40,41 और एक हाइड्रोफोबिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HILIC) स्तंभ 42 नियंत्रण रेखा के लिए इस्तेमाल किया गया है / oligonucleotides के ईएसआई एमएस विश्लेषण। उनमें से, केशिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ जुदाई क्षमता के मामले में दूसरों से बेहतर है, हालांकि, केशिका केवल पत्थर का खंभा पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल स्तंभ घर में बना है और एक कम प्रवाह दर (2 μl / मिनट) है, जो इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता पर संचालित किया गया था माइक्रो नियंत्रण रेखा को समर्पित किया। आसान आपरेशन की सुविधा के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम उच्च प्रवाह दर (100-400 μl / मिनट) पर लंबी ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स की जुदाई के लिए मूल्यांकन किया गया। डीएनए duplexes (26, 37 और 53 बीपी) के तीन जोड़े कॉलम उपर्युक्त का उपयोग कर अलग हो गए थे, हालांकि, सी 18 -bonded कण सिलिका स्तंभ और पी एस-डीवीबी केवल पत्थर का खंभा स्तंभ के चक्र बार 65 और 70 मिनट थे, क्रमशः है, जबकि सी की है कि <sub> 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ 8 मिनट (चित्रा 1) था। ध्यान में तेजी से विश्लेषण ले रहा है, सी 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ सीमित जुदाई क्षमता के बावजूद हमारे उद्देश्यों के लिए चुना गया था; हालांकि शेष दो कॉलम जब बेहतर जुदाई की आवश्यकता है नियोजित किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, एक केवल पत्थर का खंभा स्तंभ के मामले में, वहाँ कोई मध्य मात्रा है और मोबाइल चरण ठोस चरण के छिद्रों के माध्यम से प्रवाह करने के लिए, जबकि एक सुसंगत पथ की लंबाई को बनाए रखने के लिए, इस प्रकार एक कुशल जुदाई 27 को सक्षम करने के लिए मजबूर हो जाएगा। ऐसी प्रक्रियाओं बड़े अणुओं की धीमी गति से प्रसार के रूप में इस तरह के एक oligonucleotide के रूप में प्रकट होता है, विशेष रूप से Biomacromolecules के विश्लेषण में। एक केवल पत्थर का खंभा स्तंभ के व्यावहारिक गुण का एक यह है कि वापस दबाव एक कण सिलिका स्तंभ 27 की तुलना में कम है। उच्च प्रवाह दर (400 μl / मिनट) और कम स्तंभ तापमान (20 डिग्री सेल्सियस), की अधिकतम वापस दबाव के बावजूदप्रणाली 12.5 एमपीए 37 था। यह एक लंबी oligonucleotide के तेजी से विश्लेषण के लिए एक सी 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ का लाभ का पहला प्रदर्शन है। उच्च प्रवाह की दर के कारण, इंटरफेस में सूक्ष्म नियंत्रण रेखा और सटीक संरेखण के लिए एक समर्पित साधन की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, एक गर्म ईएसआई जांच डीएनए द्वैध अलग कर देना और के रूप में बाद में वर्णित डीएनए के आयनीकरण की सहायता के लिए आवश्यक है।आयन जोड़ी क्रोमैटोग्राफी सामान्यतः oligonucleotides के एमएस-संगत अलग होने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, एक आयन-जोड़ी अभिकर्मक आम तौर पर ईएसआई प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप और ईएसआई-एमएस की संवेदनशीलता कम हो जाती है। इसलिए, HFIP अक्सर oligonucleotide की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए मोबाइल चरण के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, HFIP (क्वथनांक 59 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल (क्वथनांक 65 डिग्री सेल्सियस) और इसलिए, विलायक के इस नुकसान पीएच बढ़ जाती है और आयन जोड़ी अभिकर्मक की हदबंदी को बढ़ावा देता है (यानी, चाय) से पहले इंटरफेस में तेजी से वाष्पीकृतoligonucleotide से। क्योंकि वर्तमान पद्धति एक गर्म ईएसआई जांच, जो 350 डिग्री सेल्सियस पर गर्म नाइट्रोजन गैस के साथ eluate nebulizes कार्यरत हैं, इस आशय पर बल दिया हो सकता है। क्योंकि धातु का पता लगाने के आयनों 33 के साथ अभिवर्तन गठन में कमी की जीनोटाइपिंग विश्लेषण के लिए; HFIP-चाय बफर के बजाय, Erb और Oberacher cyclohexyldimethylammonium एसीटेट (पीएच 8.4 CycHDMAA) की सिफारिश की। लेखकों deduced है कि CycHDMAA खुद धातु अभिवर्तन के गठन को दबा दिया। साहित्य के बावजूद, महत्वपूर्ण अभिवर्तन गठन वर्तमान पद्धति में नहीं रखा गया है। इसके अतिरिक्त, HFIP-चाय-मेथनॉल प्रणाली की उल्लेखनीय लाभ यह है कि शिखर क्षेत्र HFIP-चाय-मेथनॉल प्रणाली के साथ प्राप्त 17 बार जब टी के एक 86 बीपी amplicon का विश्लेषण CycHDMAA-acetonitrile प्रणाली से प्राप्त है कि अधिक से अधिक से अधिक किया गया है poecilonotus (डेटा) नहीं दिखाया। HFIP-चाय-मेथनॉल प्रणाली का एक नुकसान यह है, तथापि, CycHDMAA-acetonitrile व्यवस्था करने के लिए लागत में वृद्धि हुई रिश्तेदार है।
monoisotopic द्रव्यमान की गणना गुणा आयनों का आरोप लगाया समस्थानिक चोटियों की जुदाई की आवश्यकता है। इसलिए, संकल्प उपस्थित विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि अपेक्षित संकल्प शक्ति analyte की आधार जोड़ी लंबाई पर निर्भर है, पारंपरिक TOF एनालाइजर, जो हजारों के कई दसियों के एक संकल्प की शक्ति है, लघु ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के विश्लेषण के लिए सीमित किया जा सकता है।
तालिका 4 में दिखाया गया है सैद्धांतिक monoisotopic जनता analytes की इसी आधार रचनाओं से गणना की गई। वैकल्पिक रूप से, Muddiman एट अल। एक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग सटीक जन 43 से आधार संरचना गणना करने के लिए विकसित की है। ऐसा ही एक कार्यक्रम स्वचालित ईएसआई एमएस प्रणाली 16-18 में एकीकृत किया गया था। क्योंकि एक मापा monoisotopic बड़े पैमाने पर हमेशा के लिए एक अनूठा आधार संरचना ओ के अनुरूप नहीं है इन एल्गोरिदम का उपयोग वर्तमान पद्धति की मजबूती सुधार हो सकता है3 पीपीएम अपरिहार्य माप त्रुटि से उत्पन्न की बड़े पैमाने पर सहिष्णुता के पंख। दुर्भाग्य से, हम वर्तमान अध्ययन के लिए इन सॉफ्टवेयर उत्पादों को प्राप्त नहीं कर सका।
क्योंकि वर्तमान पद्धति के आधार संरचना का विश्लेषण पर आधारित है और एक प्रक्रिया विशेष रूप से पुफेरफिश के लिए डिजाइन को शामिल नहीं करता उपस्थित monoisotopic बड़े पैमाने पर आधारित प्रजातियों दृढ़ संकल्प न केवल पुफेरफिश के भेदभाव के लिए बल्कि अन्य डीएनए बहुरूपताओं का पता लगाने के लिए उपयुक्त हो सकता है। डीएनए बहुरूपता का पता लगाने के लिए के रूप में, समर्पित ईएसआई एमएस प्रणाली पूरी तरह से स्वचालित और आसान काम है, इस तरह के रोगजनकों 15,17,18,20,30 का पता लगाने के रूप में नैदानिक इस्तेमाल के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसके विपरीत, वर्तमान पद्धति आम अनुसंधान यंत्र और उपकरण और इसलिए, अनुसंधान उपयोगों के लिए उपयुक्त के साथ संभव है। ईएसआई एमएस पहले से ही इस तरह के एकल nucleotide बहुरूपता 13,28,32, लघु मिलकर पुनरावृत्ति 26 के रूप में मानव डीएनए बहुरूपता करने के लिए लागू किया गया हैऔर mitochondrial डीएनए 16,19 analsis। माइक्रो आरएनए भी केशिका नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस 44 के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। ये प्रकाशित आवेदन भी वर्तमान विधि द्वारा महसूस किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि जैसे एंटीबायोटिक्स की बातचीत और ribosomal शाही सेना 45 कम तापमान जुदाई के कारण के रूप में oligonucleotide और कम आणविक भार यौगिकों, के बीच बातचीत की निगरानी के लिए उपयुक्त हो सकता है। ऐसे मामलों में, ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स और कम आणविक वजन यौगिकों में एक साथ पता लगाया जाना चाहिए, नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस का उपयोग करने का एक फायदा है।
वहाँ एक सीमा है कि इस तरह के इंस्ट्रूमेंटेशन सेंगर अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर के रूप में पारंपरिक तकनीक में के रूप में समानांतर विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान पद्धति को पहचानती ही आधार संरचना और एक ही अणु के भीतर किसी भी आधार प्रतिस्थापन प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, एमएस आधारित डीएनए यहाँ वर्णित विश्लेषण अभी भी अवधि में योग्यता हो सकता हैडीएनए बाध्यकारी ऐसी जेल वैद्युतकणसंचलन और वास्तविक समय पीसीआर के रूप में डाई आधारित तकनीकों के साथ तुलना में सटीकता की है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |