Summary
Her blir en fremgangsmåte ved hjelp av en permeabel membran insert-baserte infeksjon system for å studere effektene av streptolysin S, en utskilt toksin som produseres av gruppe A streptokokker, på keratinocytter rives. Dette systemet kan lett brukes til studier av andre utskilte bakterielle proteiner på ulike vertscelletyper i løpet av infeksjon.
Abstract
Mange bakterielle patogener utskille potente toksiner for å hjelpe til ødeleggelse av vertens vev, for å initiere signale forandringer i vertsceller eller for å manipulere immunsystemresponser i løpet av infeksjonen. Selv om fremgangsmåter har blitt utviklet for å kunne rense og fremstille mange av disse viktige virulensfaktorer, er det fortsatt mange bakterietoksiner som har unike struktur eller omfattende post-translasjonelle modifikasjoner som gjør dem vanskelige å rense og studere in in vitro-systemer. Videre, selv når ren toksin kan erholdes, er det mange utfordringer knyttet til å studere de spesielle virkninger av et giftstoff i henhold til aktuelle fysiologiske betingelser. De fleste in vitro cellekultur modeller designet for å vurdere virkningene av utskilte toksiner på vertsceller involverer inkubasjon vertsceller med en engangsdose av toksin. Slike metoder dårlig omtrentlig hva vertsceller faktisk opplevelse under en infeksjon, hvor toksinet er kontinuerlig produseres avbakterieceller og får samle seg gradvis i løpet av infeksjonen. Denne protokollen beskriver konstruksjonen av en permeabel membran insert-baserte bakteriell infeksjon system for å studere effektene av streptolysin S, et potent toksin som produseres av gruppe A streptokokker, på humane epitelceller keratinocytter. Dette systemet etterligner nærmere den naturlige fysiologiske miljøet under en infeksjon enn metoder hvor ren gift eller bakteriell supernatanter er direkte brukt på vertsceller. Viktigere, denne fremgangsmåten eliminerer også forspenningen av verts responser som er på grunn av direkte kontakt mellom bakterier og vertsceller. Dette systemet har vært benyttet for effektivt å vurdere virkningene av streptolysin S (SLS) for vert membranintegritet, cellulær levedyktighet, og cellulære signalresponser. Denne teknikken kan lett anvendes i studiet av andre utskilte virulensfaktorer på en rekke forskjellige pattedyrvertscelletyper for å undersøke den spesifikke rollen som et utskilt bakterie faktor during løpet av infeksjonen.
Introduction
Å forstå funksjonen av bakterielle virulensfaktorer i forbindelse med vertscellen infeksjon er et stort fokus på bakteriell patogenesen forskning. Mange bakterielle patogener aktivt utskiller giftstoffer og andre oppløselige faktorer for å hjelpe til ødeleggelse av vertens vev, for å initiere signale forandringer i vertsceller eller for å manipulere immunsystemresponser i løpet av infeksjonen 1 - 10. Selv om fremgangsmåter har blitt utviklet for å kunne rense og fremstille mange av disse viktige virulensfaktorer for studier, bakterielle produkter har unike strukturer eller omfattende post-translasjonelle modifikasjoner som gjør dem gjenstridige kandidater for rensemetoder, og således ikke kan studeres isolert ved hjelp av in vitro-systemene . For eksempel, gruppe A streptokokker, bakteriell patogen ansvarlig for en myriade av infeksjoner som spenner fra faryngitt til nekrotiserende fasciitt og toksisk sjokksyndrom, produserer en utskiltbakteriell toxin kjent som streptolysin S (SLS) 11-17. Dette ribosomally produsert peptidet blir kodet for av den streptolysin S forbundet gen (SAG) klynge, og det modne produkt er anslått til å være 2,7 kDa i størrelse 14-17. Den protoxin, kodet av Saga, er endret etter translatorisk av flere enzymer (SagB, SagC, og SAGD) å produsere modne, funksjonelle skjema 15-17. Kompleksiteten i disse posttranslasjonelle modifikasjoner kombinert med gift uvanlige aminosyresekvens har gjort toksinet uforenlig med alle rensing og strukturoppklaring innsatsen som er forsøkt å date 15,17. Disse utfordringene har kompliserte arbeidet med å fastslå den spesifikke rollen dette toksinet i verts patogenesen.
I de tilfeller hvor fremstillingen av rensede giftstoffer eller andre faktorer utskilles enten er kompliserte eller ikke er mulig, mekanismer for åklargjøre funksjonen av disse produktene har vært undersøkt ved fremstillingen av filtrerte bakterielle supernatanter, som deretter brukes til vertsceller 18 - 20. Det er flere utfordringer knyttet til denne teknikken. For det første er det mange av disse utskilte faktorer, blant annet SLS, ikke opprettholde maksimal eller konsistent aktivitet når de lagres og anvendes på vertsceller på et senere tidspunkt. I tillegg, når supernatanter er samlet ved et enkelt tidspunkt og deretter brukt til vertsceller, er det vanskelig å bestemme fysiologiske relevans og til å trekke direkte slutninger om den naturlige infeksjonsprosessen, hvor utskilte faktorer får lov til å hope seg opp i løpet av infeksjonen til en fysiologisk relevant konsentrasjon. Dette andre mål kan anvendes ikke bare bruken av bakterielle supernatanter, men også til bruk av rensede giftstoffer i vertscellestudier 1 - 3,8. For å løse disse problemene, en gjennomtrengelig membran insert-baserte system-infeksjon har blitt utviklet for å vurdere virkningene av SLS på vertsceller på en måte som opprettholder optimal toxin-aktivitet og også eliminerer den variable av direkte kontakt mellom bakterier og vertsceller. I dette systemet blir humane epitelceller dyrket i et monolag på den nederste kammer i en to-kammer brønn, og bakterier innføres i det øvre kammer i den samme brønnen. En porøs membran (0,4 pm porer) separerer øvre og nedre kammere, slik at utskilling av faktorer som skal utveksles mellom de to kamre, men hindrer passering av bakterier. Dette systemet har tillatt for effektiv evaluering av vertsresponser som er utelukkende på grunn av vedvarende utskilles bakterielle komponenter samtidig eliminere eventuelle svar som kan oppstå ved direkte kontakt i løpet av gruppe A-streptokokker infeksjon. Selv om andre utskilte bakterielle faktorer enn SLS kan også passere gjennom den porøse membranen, bruk av en isogen mutant panel inkluderer villtype (WT), en SLS-knockout (ΔsagA) og en Saga suppleres stamme (ΔsagA + Saga) gir presis evaluering av vertsresponser som er strengt SLS avhengige 21.
Selv om lignende permeable membran innleggs systemer har blitt ansatt for studiet av utskilt faktorer involvert i virale infeksjoner, kreft biologi, og immuncellemigrasjon 22-26, noen få studier med bakterielle interaksjoner med vertsceller har benyttet denne tilnærmingen 6,27,28. Selv studier som har benyttet slike systemer for å utforske samspillet mellom bakterier og vertsceller har primært fokusert på migrasjon av betennelsesceller eller bakterier gjennom en epitelial eller endothelial mono belagt på gjennomtrengelig membran innsatsen. Den gjennomtrengelige membran insert-baserte infeksjon systemet beskrevet heri er en enkel og effektiv metode som baserer seg på separasjon av bakterier og vertsceller ved hjelp av en porøs membran for å vurdere effeCTS av det utskilte toksin, SLS, på verten membran integritet, cellular levedyktighet, signaloverføring, og utskilling av vertscelle faktorer. Denne teknikk kan tilpasses til studiet av andre utskilte virulensfaktorer på en rekke forskjellige pattedyrvertscelletyper for å undersøke rollen til en spesifikk bakterie faktor i løpet av en infeksjon.
Protocol
1. bakteriekultur
- Generer isogene mutantstammer som skal anvendes for studium av den spesifikke utskilte faktor av interesse 21.
Merk: GASM1T1 5448 stammer benyttes for disse forsøkene er inkludert WT GAS ", en saga Δ katt SLS-mangel mutant (forkortet i teksten som Δ Saga), og en Saga suppleres belastning (forkortet i teksten som Δ saga + Saga) 21. - Forbered natten flytende kulturer av bakteriestammer av interesse. Vokse GAS M1T1 5448-stammer i -10 ml Todd-Hewitt-buljong ved 37 ° C i 16-20 timer før infisere humane celler.
- Sentrifuger over natten bakteriekulturer (2400 RCF i 10 minutter) og resuspendert i frisk bakteriemedium.
Merk: resuspensjon i samme volum som de over natten kulturer ble dyrket i (5-10 ml) produserer generelt en ønskelig innledende optisk tetthet. - Normalbakteriekulturer tillike utgangskonsentrasjonen ved fortynning av re-suspendert kulturer i ytterligere bakteriemedium til det samme optiske tetthet ved 600 nm (OD 600) blir oppnådd for alle stammer som skal testes (OD 600 på omtrent 1,0 er anbefalt for enkelhets skyld).
Merk: I disse studiene, ble stasjonær fase bakteriekulturer som brukes til å infisere vertscellene umiddelbart etter normalisering. Men som noen bakteriestammer exit stasjonær fase nonsynchronously det kan være mer hensiktsmessig å starte verts infeksjoner med log fase kulturer dersom dette viser seg å være tilfelle for de stammer av interesse. - Før ytterligere analyse, utføre en koloni telle analyse for å bestemme de kolonidannende enheter (CFU) per milliliter til stede i utgangs kulturene slik at multiplisiteten av infeksjonen (MOI), eller forholdet av bakterier per vertscelle, kan bestemmes.
- Forbered 1 ml serielle fortynninger av bakteriekulturer som har blitt normalisert til den optiske tetthty i fosfatbufret saltvann (PBS) eller passende bakterievekstmedium (Todd-Hewitt-buljong ble anvendt i disse studiene). Forbered fortynninger fra 10 -1 til 10 -6 å frembringe i det minste ett sett av agarplater med tellbar kolonier (30-300 kolonier). Utføre alle fortynninger i tre eksemplarer.
- Overfør 100 ul av hver seriefortynning på en agarplate inneholdende passende medium for bakteriearter blir analysert.
Merk: Todd-Hewitt-agar ble brukt i disse studiene. - Bruke et glass eller plast bakteriell spreder for jevn fordeling av 100 ul alikvot over hele overflaten av agar plate, og fortsette å spre inntil væsken er absorbert inn i agaren. Opptre under flamme hjelp steril teknikk.
- Inkuber agarplater ved 37 ° C over natten eller inntil tellbar kolonier til syne.
- Telle koloniene som vokser på hver plate, og beregning av CFU / ml i den opprinnelige kulturen ved den følgende formula: antall kolonier x inverse av seriefortynning / kultur volum belagt i milliliter.
f.eks (200 kolonier x 1/10 -5 fortynning) / 0,1 ml belagt = 2,0 x 10 8 CFU / ml
2. Host Cell Culture
- Skaff en passende vert cellelinje for de ønskede analysene.
Merk: HaCaT menneskelige epiteliale keratinocytter 29, en slags gave fra V. NIZET, ble brukt for disse studiene.- Opprettholde HaCaT-celler i 100 mm kulturskåler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS). Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2.
3. Host Cell Infeksjon med gjennomtrengelig membran Sett System
- Plate celler i passende vevdyrkningsskåler og tillate dem å vokse til de når 90% konfluens.
Merk: HaCaT cellene som brukes i disse studiene typisk nå konfluens innen 2-3 days etter plating.- For lysat samling (f.eks signaleringsanalyse og adenosintrifosfat (ATP) bestemmelses analyser), plate HaCaT-celler i 6-brønners skåler i en seeding tetthet på ca. 3 x 10 5 celler / brønn.
- For immunfluorescens bildebehandling eksperimenter, plateceller på sterile dekkglass i 6-brønners skåler i en seeding tetthet på ca. 3 x 10 5 celler / brønn.
- For ethidium homodimer membran permeabilization og laktat dehydrogenase (LDH) slipper analyser, plate HaCaT celler i 24 brønners retter på en seeding tetthet på ca 5 x 10 4 celler / brønn.
- Umiddelbart før behandling, vaske cellene med 1x steril PBS.
- Anvende friskt vekstmedium til cellene. For de vilkårene som er beskrevet her, gjelder 2 ml medium per brønn i 6 brønners plater eller 0,5 ml medium per brønn i 24 brønners plater. Hvis farmakologisk behandling blir testet, bland med friskt medium og gjelder i dette stes.
Merk: Noen analyser kan kreve alternative medier. For eksempel, som fenol-rødt og høye serumkonsentrasjoner interferere med LDH-frigivelse analysen, fenolrødt-fritt DMEM supplementert med 1% bovint serumalbumin (BSA) (w / v), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat var anvendt for disse forsøk. - Etter friskt medium har blitt påført, plasserer nøye en steril 0,4 mikrometer gjennomtrengelig membran innsats i hver brønn. Utfør dette trinnet i en laminær hette, og bruke steril tang til å overføre gjennomtrengelig membran innsatsen i hver brønn.
- Bruk frisk cellekulturmedium til det øvre kammer for hver brønn i henhold til produsentens instruksjoner. For de vilkårene som er beskrevet her, gjelder en ml medium per brønn i 6 brønners plater eller 0,1 ml medium per brønn i 24 brønners plater.
- Påfør en passende mengde av et normalisert bakteriekulturer (se kapittel 1) til det øvre kammeret i gjennomtrengelig membran insert system. Bruk bakteriell medium for infisert kontrol behandlinger. For resultatene som er beskrevet her, tilsett 25 ul av de normaliserte kulturer pr kammer i 24 brønners plater og tilsett 100 pl av kulturene pr kammer for 6-brønners plater.
Merk: I disse studiene ble villtype eller mutant GAS søkt vertsceller ved en MOI på 10. MOI ble beregnet på grunnlag av de endelige eukaryot celle tall (f.eks 2 x 10 6 celler / brønn), slik at 10 ganger så mange bakterier ble tilsatt per vertscelle ved begynnelsen av infeksjonen perioden (for eksempel 2 x 10 7 CFU per brønn). Passende MOI vil variere med ulike bakteriearter og med de ønskede oppfølgings analyser.
Merk: I tillegg til å bruke bakterie medium for uinfiserte kontroller, andre nyttige kontroller for visse anvendelser av denne teknikken kan omfatte varmedrepte bakterier eller brukt bakteriell medium for sammenligning. - Inkubere infiserte celler ved 37 ° C med 5% CO2.
4. Prøvetaking
<ol>- Samle mediet fra det nedre kammer inn i 1,5 ml rør. Unngå å forstyrre monolayer under samlingen.
- Sentrifuger prøvene ved 14 000 RCF i 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne cellerester.
- Fjern alle men 50 pl av supernatanten til et nytt 1,5 ml rør og oppbevares ved -20 ° C eller brukes umiddelbart.
- Forsiktig aspireres mediet ovenfor monolag av vertsceller. Unngå å forstyrre monolayer, da dette kan føre til prøven tap.
- Skyll celler gang med 1x PBS.
- Forsiktig aspirer PBS. anvende straks et passende volum av iskald lyseringsbuffer for å oppnå den ønskede proteinkonsentrasjon og inkuberprøvene på is i 15 min. Anvende mellom 200 pl og 350 pl av lyseringsbuffer per brønn av hver 6-brønn plate for å oppnå proteinkonsentrasjoner mellom 0,5 og 1,5 mg / ml.
Merk: lyseringsbuffer ble anvendt i disse studiene var sammensatt av avionisert vann, 1% (v / v) Nonidet P40 Substitute, et fosfatase-inhibitor cocktail, og en protease inhibitor cocktail. Spesifikke reagenser er oppført i materialer og utstyr delen. - Bruke en celleskrape for å løsne cellene fra platen overflaten av hver brønn og pipettere hele innholdet av hver brønn inn i et 1,5 ml rør.
- Sentrifuger prøver ved 14 000 RCF i 20 min ved 4 ˚C.
- For å vurdere løselige lysat komponenter, fjern supernatanten til et nytt rør og oppbevares ved -20 ˚C eller bruk umiddelbart.
- For å vurdere kjernefysiske eller andre uoppløselige lysat komponenter, forbeholder pellet og oppbevares ved -20 ˚C eller bruk umiddelbart.
- Sompirat medium og vaske cellene i 1x kald PBS.
- Feste cellene over natten i 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning i PBS (w / v).
Merk: I disse studiene, ble 1 ml av PFA tilsatt per brønn av hver 6-brønn plate.
5. Foreslåtte Applications
- Host signaltransduksjon Analyse av SDS-PAGE og Western blotting
- Samle vertscellelysatene som beskrevet i kapittel 4.3.
- Bestem proteinkonsentrasjonen av hver prøve lysat av bicinchoninic syre (BCA) analyse, eller ved hjelp av tilsvarende proteinstandarder 30.
- Normalproteinkonsentrasjoner mellom prøvene før lasting og kjører prøvene på en 4-15% polyakrylamid gel eller hensiktsmessig alternativ 31.
- Normalisere prøvekonsentrasjoner ved pipettering den samme mengde protein fra hver prøve (for eksempel 20 pg) inn i et nytt 1,5 ml rør og tilsetning av variable volumer av lyseringsbuffer (buffervolum = totalt volum - prøvevolumtilsatt) til hvert rør for å gjøre det totale volum (for eksempel 50 ul) og endelig proteinkonsentrasjon tilsvarende på tvers av prøver.
- Overføre prøvene til et polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (eller tilsvarende). For resultatene som er beskrevet her, overføre prøver ved 25 volt i 2 timer før øke spenningen til 70 volt i ytterligere 45 min. Bruk overføring buffer bestående av 200 mM Tris-base, 1,5 M glycin og 20% metanol (volum / volum) i avionisert vann.
- Blokk-membraner i 5% BSA + 0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltvann (TBS). Justeres tilsvarende basert på produsentens anbefalinger for antistoffet som skal brukes.
- Inkuber membraner med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Bruk på produsentens anbefalte fortynning.
- Vask membraner i 1,5 timer i TBS + 0,1% Tween 20; oppdatere buffer hvert 10-15 min.
- Inkuber med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoff ved en fortynning på 1: 5000 i 1,5 timer ved værelses Temperature.
- Vask membraner i 1,5 timer i TBS + 0,1% Tween 20; oppdatere buffer hvert 10-15 min.
- Inkuber membraner med chemiluminescence deteksjonsreagensen før utvikling på film i henhold til produsentens instruksjoner. Andre deteksjonsmetoder kan anvendes som ønsket.
- Host Cell Immunofluorescensanalyse Farging og bildebehandling
- Fix Dekk inneholder vertsceller som beskrevet i kapittel 4.4.
- Fjern PFA løsning og vask Dekkglass inneholdende behandlede cellene to ganger i PBS, aspirere mellom hver vask.
Merk: PFA er svært giftig og må kastes på riktig måte. - Blokkere glassene i 2 timer ved værelsestemperatur i PBS med 1% (vekt / volum) normalt geiteserum, 2% (v / v) Triton X-100, og 0,5% (v / v) Tween 20.
- Vask Dekk med PBS i 30 min, forfriskende buffer hvert 10 min.
- Inkuber Dekk med primær antistoff i en 1:50 ratio (eller som anbefalt av produsenten) i blokkering solution natten ved 4 ° C.
- Vask Dekk i 1,5 timer i PBS, forfriskende buffer hvert 30 min.
- Inkuber objektglassene i 2 timer ved romtemperatur i sekundært antistoff (geit-anti-kanin-IgG AlexaFluor488 ble anvendt for disse studiene) under anvendelse av en 1: forholdet mellom antistoff 200 til blokkeringsløsning.
- Vask Dekk for en time, forfriskende buffer hvert 20 min.
- Påfør ønsket flekker.
Merk: Disse studiene benyttet DAPI (atom flekken) og rhodamine-phalloidin (aktin flekken) i forhold på 1: 1000 i blokkering løsning. - Inkuber Dekkglass med atom og aktin flekker i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask objektglassene i PBS i 30 minutter ved romtemperatur, forfriskende buffer hvert 10 min.
- Monter Dekk på glassplater ved hjelp av monteringsmedium.
- Tillat Dekk å sette på skinnene over natten før tetting og bildebehandling. For resultatene som er beskrevet her, samle bilder på et fluorescens mikroskop using en standard 20X objektiv. Bruk ImageJ og mikroskop bildebehandling programvare for å behandle bildene.
- Ethidium homodimer celledød analysen
- Aspirer mediet fra hver brønn og vaske cellene to ganger med sterilt PBS.
- Påfør 4 mikrometer ethidium homodimer-1 i PBS.
- Inkuber cellene ved værelsestemperatur i 30 min i mørket.
- Bestemme nivået av fluorescens ved anvendelse av en plateavleser innstilt til 528 nm eksitasjon og 617 nm emisjon med en grenseverdi på 590 nm.
- Tilsett 0,1% (w / v) Saponin til hver brønn etter den første avlesning og tillate platen å inkubere i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur (med vugging) før leser av platen en andre gang på samme innstillinger.
- Bestemme prosent membran permeabilization individuelt for hver brønn ved å dividere den første fluorescens lesing (etter behandling) av den andre fluorescens-leser (post-Saponin).
- ATP Fastsettelse analyse
- Normal protein nivåer i lysatene via BCA assay eller lignende 30.
- Bestem cellulære ATP nivåer ved hjelp av en luminescens basert ATP bestemmelse kit eller tilsvarende i henhold til produsentens instruksjoner.
- Normaliser behandlede verdier til de tilsvarende ikke-infiserte kontrollprøver.
- LDH Slipp analyse
- Etter infeksjon, samle supernatanter som beskrevet i kapittel 4.3.
- Evaluer LDH utgivelsen bruker en cytotoksisitet deteksjon kit for LDH utgivelse i henhold til produsentens instruksjoner.
Representative Results
Den gjennomtrengelige membran insert-baserte infeksjon system protokoll utviklet for å studere utskilte bakterielle faktorer er detaljert i Figur 1. Dette systemet baserer seg på separasjon av bakterier og vertsceller ved hjelp av en porøs membran for å vurdere virkningene av utskilte bakterielle faktorer, i dette tilfellet streptolysin S (SLS), på verts responser som vert membranintegritet, cellulær levedyktighet, cellulær signaltransduksjon, og utskilling av vertscelle faktorer. Figur 2 gir representative Western Blot data som viser at dette systemet kan brukes til å vurdere endringer i aktiveringen av kontakt -Uavhengig verts signaliserer proteiner. Spesielt viser representative data betydelig forbedret p38 MAPK-aktivering i nærvær av SLS-produserende GAS-stammer. Dette systemet kan også anvendes for å visualisere effekten av utskilte bakterielle faktorer på vert protein lokalisering ved immunofluorescens-mikroskopi (<strong> Figur 3). Dataene viser SLS-avhengig aktivering av tasten inflammatoriske mediator nukleær faktor kappa B (NFKB) som translocates fra cytoplasma til kjernen 21 ved aktivering. Resultatene i figur 2 og 3 indikerer at både SLS-avhengige inflammatoriske signalresponser ikke krever direkte kontakt mellom bakterier og vertsceller. Som tidligere forsøk har allerede vist SLS-avhengige p38 og NFKB aktivering i direkte infeksjonsmodeller 21 og tilsvarende nivåer av p38 eller NFKB aktivering av de tre gass spenninger i den permeable membran innsatsen basert system ville ha indikert at reaksjonen nødvendige direkte kontakt mellom bakterier og vertsceller. Figur 4 viser at denne infeksjonen system kan anvendes for å vurdere toksin avhengige endringer i verts cytotoksisitet via etidium homodimer og LDH-frigivelse analyser. Dette er dokumentert av den betydelige økningen in er begge membran permeabilization og i frigjøring av LDH fra vertsceller eksponert for GASS stammer inneholdende SLS sammenlignet med ikke-infiserte celler eller celler eksponert for SLS-manglende belastning. Disse endringene i cytotoksisitet ikke er umiddelbar, som signifikante effekter er ikke tydelig før 12 timer etter infeksjon i tilfelle av membranen permeabilization og 16 timer i tilfelle av LDH-frigjøring. De representative data illustrerer betydningen av å velge hensiktsmessige tidspunkter og infeksjonsbetingelser for evaluering av disse verts responser. I tillegg til at for vurdering av vertsignale endringer og cytotoksisitet, er den gjennomtrengelige membran innsatsen basert infeksjon systemet er egnet for studiet av metabolske forandringer, som nøyaktig bestemmelse av vert ATP-nivåer ved å forhindre bakteriell forurensning av vertscellelysatene (figur 5) . Disse dataene viser et betydelig tap av keratinocytt-ATP som reaksjon på GAS-infeksjon 16 timer etter infeksjon, med forbedret ATP tap in nærvær av SLS. Disse resultatene er i overensstemmelse med de observerte Toxin-avhengige økninger i vertsstressrespons signalering og cytotoksisitet.
Figur 1: Skisse av gjennomtrengelig membran Insert-basert infeksjon System Protocol å vurdere virkningene av utskilt Bakterielle Faktorer på vertsceller menneske keratinocytter belagt i bunnen kupé og vokst til 90% samløpet.. En kollagen belagt membran med 0,4 um porer som skiller de øvre og nedre kammer, og bakterier tilsettes til det øvre kammer av den permeable membran innsatsen system for den ønskede infeksjonsperioden. Cellekultursupernatanter og vertsceller kan samles etter infeksjon perioden og benyttes for en rekke analyser. Klikk her for å se en større versjonav denne figur.
Fig. 2: Den permeabel membran inn Basert Infeksjon Systemet kan benyttes for vertscellen Lysate Analyse ved SDS-PAGE og Western blotting De representative data viser at SLS forbedrer aktivering av p38 MAPK-reaksjonsveien i infiserte keratinocytter. (A) HaCaTs ble infisert med GAS for 7 timer via gjennomtrengelig membran innsatsen infeksjon system (på MOI = 10) og lysatene ble vurdert for aktivering av p38. (B) Densitometry fra tre uavhengige Western blots ble utført for å kvantifisere den relative aktivering av p38 som respons på GAS'infection. Gjennomsnitt fra tre biologiske replikater vises, med feilfelt representerer standardavvik. Relativ aktivering av p38 er representert som fosforylert / totalt proteinnivå. Statistisk signifikans ble bestemt sammenlignetinfiserte celler. Den samlede p-verdi ble bestemt ved ANOVA (p = 0,0063). Dunnetts testene ble utført post hoc for å sammenligne hver tilstand til tilsvarende infisert kontroll mener. *, P = 0,01 til 0,05; **, P = 0,001 til 0,01; ***, P = 0,0001 til 0,001; ****, P <0,0001. Dette tallet har blitt forandret fra Flaherty et al. 2015 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fig. 3: Den permeabel membran inn-basert infeksjon systemet tillater visualisering av vertsMelde endringer ved immunofluorescens Mikros De representative data viser at streptolysin S forbedrer pro-inflammatorisk signalering gjennom aktivering av NFkB. HaCaT humane keratinocytter ble infisert med GAS på en M OI 10 i 8 timer ved bruk av den gjennomtrengelige membran innsatsen basert system infeksjon. (A og B) Nuclear lokalisering av NFkB ble vurdert ved immunofluorescens avbildning. Prosentandelen av atom lokaliserte celler ble beregnet ved å telle antallet celler som hadde NFkB translokerte fra cytoplasma til kjernen for et gitt felt, og dividere dette tallet på det totale antall celler for samme felt. Skala barer indikerer 100 mikrometer. (A) Et gjennomsnitt på tre biologiske replikater er representert for hver tilstand med Feilstolpene representerer standardavvik. Den samlede p-verdi ble bestemt ved ANOVA; p <0,0001. Dunnetts tester ble utført for å sammenligne hver tilstand til den tilsvarende uinfisert kontroll tilstand. *, P = 0,01 til 0,05; **, P = 0,001 til 0,01; ***, P = 0,0001 til 0,001; ****, P <0,0001. Dette tallet har blitt forandret fra Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. The gjennomtrengelig membran Insert-basert infeksjon System Tillater for bestemmelse av bakteriell-mediert Membran Permeabilization og Cytotoksisitet i fravær av direkte kontakt mellom Bakterier og vertsceller De representative data viser at keratinocyte levedyktighet avtar i nærvær av aktiv SLS toksin . GASS - indusert celledød ble undersøkt i HaCaT-celler i nærvær av WT, SLS-manglende eller Saga supplert GAS Keratinocytter ble utsatt for gass ved hjelp av den gjennomtrengelige membran innsatsen basert system for infeksjon av 8-16 timer ved en MOI på 10. (. A) Levedyktigheten ble vurdert ved ethidium homodimer assay eller (B) LDH-frigivelse assay. I begge paneler, 3 replicates er gjennomsnitt og feilfelt representerer standardavvik. Betydning for hvert tidspunkt ble bestemt ved ANOVA (A) til 8 timer, p = 0,0241; 12 timer, p <0,0001 (B) 8 timer, p = 0,0287; 12 timer, p = 0,1977; 16 timer, p = 0,0031. Dunnetts tester ble utført for å sammenligne middel fra hver tilstand til villtype-infeksjon for det tilsvarende tidspunkt. *, P = 0,01 til 0,05; **, P = 0,001 til 0,01; ***, P = 0,0001 til 0,001; ****, P <0,0001. Dette tallet har blitt forandret fra Flaherty et al. 2015 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: gjennomtrengelig membran Insert-basert infeksjon systemet tillater nøyaktig bestemmelse av Host ATP nivåer av Forhindrer Bacterial Forurensning av Host cellelysater. De representative data viser SLS avhengige tap av ATP under gruppe A streptokokker infeksjon. HaCaT-celler ble infisert med GAS for 8-16 hr ved hjelp av den permeable membran innsatsen basert system infeksjon. Tekniske replikater (n = 3) fra en representant biologisk replikere (2 x 10 6 celler per prøve) ble midlet for hver tilstand, med Feilstolpene representerer standardavvik. De samlede p-verdier ble bestemt ved ANOVA (12 t, p <0,0001; 16 t, p <0,0001). Dunnetts tester ble utført for å sammenligne hver tilstand med vill-type infeksjon for det tilsvarende tidspunkt. *, P = 0,01 til 0,05; **, P = 0,001 til 0,01; ***, P = 0,0001 til 0,001; ****, P <0,0001. Dette tallet har blitt forandret fra Flaherty et al. 2015 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Heri beskrives en fremgangsmåte ved hjelp av en permeabel membran insert-baserte infeksjon system for å undersøke effekten av det bakterielle toksin streptolysin S på humane epitelceller keratinocytter i et in vitro system. Denne protokollen kan tilpasses for å studere andre utskilte bakterie virulensfaktorer, så vel som alternative vertscelletyper. Dette nylig utviklet system gir flere fordeler i forhold til eksperimentelle metoder som benytter rensede toksiner eller filtrerte bakterielle supernatanter 1 - 3,8,18 - 20. Den gjennomtrengelige membran insert-basert system gir en kontinuerlig opprettholdt dose av den relevante bakterielle toksin vertsceller som det produseres, noe som gir maksimal toksin aktivitet opprettholdes og øker også konsistens mellom eksperimenter. I tillegg er dette systemet etterligner nærmere fysiologiske tilstander ved å la det utskilte faktor for å hope seg opp over tid som infeksjonen utvikler seg og ved å eliminator for behovet for å vilkårlig velge bestemte giftkonsentrasjoner skal gjelde for vertsceller. Videre vil dette systemet også tilveiebringe midler for å undersøkere å vurdere hvorvidt en bakteriell faktor av interesse blir levert til vertsceller i en kontakt-avhengig måte. Kontakt-avhengighet er ofte testet ved generering av isogene bakterielle mutanter som mangler i tilslutning eller ved bruk av reagenser som hindrer tilslutning. Systemet som er beskrevet her ville gi en enkelt alternativ for å komplettere eller erstatte disse tradisjonelle tilnærminger.
I tillegg til de testede programmene som er beskrevet i kapittel 5 i protokollen, andre programmer som denne infeksjonen systemet kan enkelt tilpasses omfatter innsamling av prøver for cytokin arrays og ELISA-analyser. I begge disse tilfeller kan en lignende protokoll som den beskrevet for LDH-frigivelse analyser følges. Selv om det ikke er vist her, har dette systemet er benyttet for effektivt å samle vertscelleprøver for å være ennalyzed ved strømningscytometri. I denne anvendelse blir permeabel membran innsatsen fjernes etter infeksjonen perioden blir cellene vasket for å fjerne cellekulturmedium, og trypsin er påført for å tillate samling av cellene for analyse. Den fysiske separasjon av bakterier fra vertsceller som er spesielt nyttig for denne anvendelse fordi det bidrar til å hindre dannelsen av store aggregater som består av adherert bakterier og vertsceller som ellers kunne forstyrre riktig celletelling etter den flowcytometer.
Selv om svært konsistente vertsresponser er observert når man sammenligner resultatene av permeable membran innsatsbasert infeksjonsstudier med tradisjonelle direkte infeksjonsstudier, har noen bemerkelsesverdige forskjeller i kinetikk av disse vertsresponser observert 21. For eksempel, endringer i signalisering vert og membran-baserte cytotoksisitet tar 30-50% lengre tid til å oppstå i den permeable membran innsatsen basert infeksjonsmodell enn corsvarer direkte smittemodeller. Fordi den permeable membran innsatsen basert system krever at mediet som skal anvendes på de øvre og nedre kammere i hver brønn, systemet er utviklet for de som er beskrevet her studiene kreves en 30% økning i den totale medium volum per brønn sammenlignet med tilsvarende direkte infeksjonsmodeller anvendes tidligere 21. Denne forskjellen i total volum medium, kombinert med den økte avstanden mellom bakterier og vertsceller ved direkte kontakt er forbudt, øker sannsynligvis den tid det tar for SLS til å diffundere gjennom mediet for å nå vertsceller og fremkalle de observerte effekter. Dessuten fjerner den permeable membran innsatsen basert system mange GAS virulensfaktorer som sannsynligvis vil bidra til å være vert for celleskade; fravær av disse ytterligere faktorer i dette systemet er også sannsynlig å bidra til forsinkelsen i verts celledød og initiering av vertsignaleringshendelser sammenlignet med direkte infeksjon 21. Disse faktorene bør tas i betraktningved utforming eksperimenter for å vurdere andre utskilte bakterielle komponenter.
For å identifisere de mest meningsfulle forhold for å teste effekten av utskilt bakterielle faktorer på vertsceller, teste en rekke tidspunkter for hvert program av gjennomtrengelig membran insert-basert infeksjon system anbefales. Det er viktig å vurdere under hvilke forhold den spesifikke virulens faktor av interesse blir optimalt stilles (for eksempel log fase, stasjonær fase, som reaksjon på visse miljøsignaler, etc.) for å kunne observere dens virkninger. I forsøk fokusert på å vurdere endringer i verts signaliserer proteiner, var det nødvendig å velge tidspunkter som tillatt tilstrekkelig tid for SLS å nå vertsceller og skal produseres i tilstrekkelige mengder til å indusere signale endringer 21. På samme tid, vurdering av forandringer i vertssignalering som trengs for å bli utført før SLS-indusert membran permeabilization, da denne effekten complicates samling av vertscellelysatene for analyse. Celledød indusert av SLS kan bli optimalt observert i både direkte og permeabel membran innsatsbasert infeksjonsmodeller flere timer etter initiering av de rapporterte signaleringshendelser 21. Videre i å velge tids interessante, er det også viktig å sørge for at bakteriene blir undersøkt er ute av stand til å trenge gjennom den porøse innsatsen membranen under studietiden. Produksjonen av visse bakterielle komponenter over en lengre periode kan forstyrre integriteten av membranen og tillate passasje av bakterier til det nedre kammer. For å bestemme hvorvidt dette er et potensielt problem i systemet av interesse, kan de bakteriestammer som skal studeres påføres det øvre kammer av den permeable membran insert-basert system ved en rekke tidspunkter. Ved hvert tidspunkt, kan innsatsen være forsiktig fjernet og mediet fra bunnkammeret kan samles og brukes i en standard koloni cobokføring analysen (se avsnitt 1.5). Hvis ingen kolonier dannet fra cellekulturmediet i det nedre kammer, kan innsatsen membranen antas å bli effektivt hindre passering av bakterier på tidspunktet og bakteriemengden testet.
En annen eksperimentell design komponent som er egnet til å kreve optimalisering for effektiv analyse av utskilt bakterielle faktorer er den infeksjonsmultiplisitet (MOI). MOI henviser til forholdet av bakterieceller pr vertscelle, og påvirkes derfor av vertscellen konfluens på tidspunktet for infeksjon og med antall bakteriekolonidannende enheter (CFU) påført til cellene. I disse studiene, ble keratinocytt-celler dyrket til 90% konfluens, som tillater disse celler til å danne et sammenhengende monolag med intakte tett veikryss. Tenkt vurdering av den fysiologiske organiseringen av vertsceller som skal studeres er nødvendig å velge en passende konfluens for smitteforsøk. Når en approprIate antall vertsceller per brønn er bestemt, kan en passende bakteriell CFU beregnes basert utenfor ønsket MOI. I de beskrevne her studiene ble GAS påført på vertsceller ved en MOI på 10. Passende MOI vil variere med ulike bakterier og med de ønskede oppfølgingsanalyser. En lav MOI begynnelse er vanligvis mer fysiologisk relevant og gjør det mulig for den bakterielle faktor av interesse å akkumulere langsomt nok til å fange opp subtile endringer i vertscellesignalisering før dramatiske endringer i vertscellelevedyktigheten er åpenbare. Høyere mois er brukt i mange studier for vurdering av cytotoksisitet, men denne effekten kan også oppnås ved å begynne med en lav MOI, og at infeksjonen til fremgang for en lengre periode. Det er viktig å bestemme en nøyaktig CFU til tetthet konsekvens optisk for alle bakteriestammer som skal testes, som isogene mutanter kan ha en endret veksthastighet sammenlignet med villtype bakterier og kan derfor kreve at en høyere eller lavere CFU tilsettes per brønn tilsørge for en hensiktsmessig sammenligning av vertens respons mellom stammene. I de tilfeller hvor pattedyrvertsceller blir undersøkt er i stand til å drepe bakterier eller hemmer deres vekst eller dersom det er mistanke om nonsynchronous vekst mellom bakteriestammer, kan det også være nyttig å utføre studier for å vurdere den endelige bakteriemengden ved slutten av infeksjonen perioden. Dette kan oppnås ved å samle innholdet i den gjennomtrengelige innsatsen og utføre en kolonitelling analyse tilsvarende den som er beskrevet i avsnitt 1.5 av prosedyren.
Valg av passende størrelse brønner for den ønskede analysen er også viktig for å oppnå optimale resultater. Permeabel membran innsatser er tilgjengelige i en rekke størrelser, men de mest konsistente resultatene for de som er vist her studier ble observert ved bruk av innsatser er utformet for 24 brønn og 6 brønners vevskulturplater. Disse innleggs størrelsene er forholdsvis lett å håndtere med steril pinsett, og lett manipulering er kritisk i forebyggeing uønsket overføring av bakterier fra det øvre kammer til det nedre rom av brønnen. For forsøk med innsamling av vertscellelysatene, 6 vel retter gi en passende celle nummer per tilstand for de fleste analyser og er store nok til å romme celleskraper for prøvetaking. For cytotoksisitetsanalyser hvori vertscellene forblir adherent og er merket med en fluorescerende eller colorometric fargestoff som kan måles på en plateavleser (f.eks etidium homodimer assay trypan blå eksklusjon assay), er anvendelse av en 24 brønns plate med de tilsvarende innsatser anbefales. For eksperimenter hvor cellekulturmedium vil bli samlet og analysert (f.eks LDH-frigivelse, cytokin-studier), enten den 24 brønnen eller 6-brønners plater kan anvendes, selv om de mindre brønnene vanligvis gi tilstrekkelig prøvevolumer for disse analysene og minimalisere bruken av de nødvendige reagenser. Totalt sett er metoden svært allsidig og kan tilpasses etter behov for å forberede samples for mange oppfølgingsprogrammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
| Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
| HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
| 10 cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
| 6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| 24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
| Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
| Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
| Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
| Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
| Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
| Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
| Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ml | |
| Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
| LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
| Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
| DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
| Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
| Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |
References
- Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
- Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314 (2011).
- Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970 (2012).
- Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
- Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
- Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
- Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
- Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
- Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
- Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
- Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
- Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
- Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
- Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
- Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
- Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
- Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
- Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
- Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
- Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
- Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
- Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49 (2015).
- Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
- Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
