Abstract
Этиология и последствия воздействия на человека экологических патогенов вызывают серьезную озабоченность во всем мире и, таким образом, способность оценивать воздействие и инфекции с использованием экономически эффективных, с высокой пропускной способностью подходов было бы обойтись. Эта рукопись описывает развитие и анализ бисерной на основе мультиплексной иммунологического анализа, способного измерять наличие антител в слюне человека к нескольким патогенам одновременно. Слюна является особенно привлекательным в этом приложении, поскольку она является неинвазивным, дешевле и легче собирать, чем сыворотки. Антигены окружающей среды патогенных микроорганизмов были соединены с карбоксилированные микросферы (бусинок) и используется для измерения антител в очень малых объемах образцов слюны человека, используя бусинки на основе раствора фазы анализа. Гранулы в сочетании с антигенами из Campylobacter jejuni, Helicobacter Pylori, токсоплазма, норовирусами (G I.1 и G II.4) и Вирус гепатита А. Для того, чтобы гарантировать, что антигены были в достаточной степени соединены сгранулы, муфта была подтверждена с использованием видоспецифические, животного происхождения антитела первичного захвата, с последующей инкубацией с биотинилированным анти-видовых вторичными антителами обнаружения и стрептавидин-R-фикоэритрин репортер (SAPE). В качестве контроля для измерения неспецифического связывания, один набор шарик обрабатывали идентично другим за исключением того, что не был связан с какой-либо антигена. Антиген связью и контрольные шарики затем инкубировали с перспективно-собранных образцах слюны человека, измеренный на анализаторе с высокой пропускной способностью на основе принципов проточной цитометрии, а наличие антител к каждому антигену измеряли интенсивность единицах Медиана флюоресценции (MFI) , Этот мультиплекс иммунологический имеет ряд преимуществ, в том числе больше данных с меньшим количеством образца; снижение затрат и труда; и возможность настройки анализа для многих целей, представляющих интерес. Результаты показывают, что слюнной мультиплексного иммуноанализа может быть способен идентифицировать предыдущих воздействий и инфекций, которые могут быть EspeciaLLY полезным при изучении наблюдения с участием крупных человеческих популяций.
Introduction
Восемьдесят восемь процентов диареи , связанных с болезнью во всем мире связаны с воздействием на человека загрязненной воды, небезопасных пищевых продуктов и плохой санитарии / гигиены, в результате чего около 1,5 миллиона случаев смерти, большинство из которых являются дети 1. Это является основной причиной беспокойства для должностных лиц общественного здравоохранения и лиц, определяющих политику. В целях изучения воздействия и болезней , связанных с водорастворимыми и другими экологическими патогенами, мы разработали мультиплекс иммуноферментного анализа для измерения антител в образцах человеческих тканей 2-4. Этот метод может быть применен к эпидемиологических исследований для определения воздействия на человека этих патогенов и для более четкого определения immunoprevalence и инцидентов инфекции.
Слюна имеет значительные перспективы в качестве альтернативы сыворотки для исследования биомаркеров человека. Среди преимуществ использования слюну являются не-инвазивности и легкость сбора проб, низкая стоимость, и образцы могут быть легко собраны из детей 5-7 </ SUP>. Образцы сыворотки и образцы слюны были изучены на наличие антител против H. пилори 2,3,8, малярийного плазмодия 9, дизентерийная амёба 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus пневмонии 12, вирусов гепатита А и С 13-14, Noroviruses 2-4,15, Т. гондий 2-4, вирус лихорадки денге 16, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) , 17, и кишечная палочка О157: Н7 18.
Многозальный иммунологический позволяет для анализа нескольких аналитов одновременно в пределах одного объема образца и в пределах одного цикла или бега. Мультиплексные антигены из C. jejuni, Т. гондий, H. Pylori, вирус гепатита А, и два Noroviruses были использованы для измерения человеческого IgG в слюне 2-4 и IgA 3,4 и плазмы IgG 2,3 ответ антител на этих патогенов с использованиембусинка мультиплексирование на базе иммунологического анализа. При использовании в сочетании с эпидемиологических исследований воздействия микробов в воде, почве и пищевых продуктов, тип анализа, описанного в данном исследовании, может дать ценную информацию для улучшения понимания инфекций, вызванных экологическими патогенами. Кроме того, слюнные данные , полученные из антител таких исследований могут быть использованы для улучшения моделей оценки риска 19-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Утверждение было получено из Совета по институциональному (IRB # 08-1844, Университет Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, США) для сбора стимулированных десневой борозды образцов слюны из пляжников в Boqueron Beach, Пуэрто-Рико, как часть Соединенных Штатов Агентство по охране окружающей среды (USEPA) Национальная эпидемиологическая и экологическая оценка рекреационной (NEEAR) Вода исследования 23 для оценки плавания связаны воздействия и болезней. Испытуемых при условии, информированное согласие и было дано указание об использовании устройства сбора слюны обученными подрядчиками USEPA. Образцы слюны были отправлены на льду и, после получения, их центрифугировали и хранили при температуре -80 ° С , как описано 4.
1. Шарик активации
- Ресуспендируют шарик набор акций путем встряхивания и обрабатывали ультразвуком в течение 20 сек и передачи приблизительно 5,0 × 10 6 фондовых шариков (400 мкл) в микропробирок.
Примечание: Tон бисер поставляются в концентрации 12,5 х 10 6 бусин / мл. - Гранул акции шарики центрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют Осажденный бусин в 100 мкл дистиллированной воды (дН 2 O) с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек. Повторите шаг 1.2.
- Удалить супернатант и ресуспендируют промытых бусин в 80 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия, рН 6,2 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
- Непосредственно перед использованием, чтобы раствор 50 мг / мл N -hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) путем добавления 200 мкл дН 2 O до 10 мг сульфо-NHS аликвоты. Смешать вихря.
- Добавляют 10 мкл 50 мг / мл сульфо-NHS к шарикам. Смешать вихря.
- Непосредственно перед использованием, чтобы 50 мг / мл 1-этил- [3 - диметиламинопропил] карбодиимида раствор (ДХЭ) путем добавления 200 мкл дистиллированной воды (дН 2 O) с 10 мг EDC аликвоты. Смешать вихря.
- Добавляют 10 мкл 50мг / мл EDC раствора к шарикам. Смешать вихря. Выдержите шариками в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте, при перемешивании с помощью вихря с интервалом 10 мин. Гранул активированные бусины микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют бусин в 250 мкл 50 мМ 2- [N -Morpholino] этансульфоновой кислоты (MES), рН 5,0 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
- Гранул активированные бусины микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
- Повторите шаги 1.9 и 1.10.
Примечание: Это обеспечивает в общей сложности двух промывок с помощью 50 мМ MES, рН 5,0. - Ресуспендируют бисером в 100 мкл 50 мМ MES, рН 5,0 с помощью вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
2. Сцепление из бисера
- Пара антигены к наборам бусинки с использованием показанных в таблице 1.
- Добавьте каждый антиген к активированным бусинок и довести общий объем до 500 мкл в 50 мМ MES, рН 5,0. Смешать антигеныг бисера вихря.
- Выдержите антигены и бусинки в течение 2 ч при перемешивании вращением (~ 15 оборотов в минуту) при комнатной температуре в темноте. Гранул соединенные шарики микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют бусин в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), -bovine сывороточного альбумина (БСА) -polyoxyethylenesorbitan монолаурат (Tween-20) -натрий азид (ПБС-ТБН) рН 7,4 с помощью вихря и обработки ультразвуком. Гранул бусинки микроцентрифугированием при 10000 х г в течение 2 мин и удалить супернатант.
Внимание: азид натрия является остро токсичным химическим веществом. Это приводит к летальному исходу при проглатывании или вступает в контакт с кожей. Не вдыхать пыль / дыма / газа / тумана / паров или аэрозолей. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), когда транспортная обработка и утилизировать в соответствии с соответствующими законами. - Ресуспендируют бисером в 1 мл PBS-ТБН от вихря и обработки ультразвуком в течение 20 сек.
- Гранул шарики микроцентрифугированием при 10000 мкг в течение 2 мин.
- Повторите шаги 2.5 и 2.6.
Примечание: Это обеспечивает в общей сложности два промывок PBS-ТБН. - Ресуспендируют спаренной и промытые бусин в 1 мл PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% азида, рН 7,4. Храните спаренных бусин в 2-8 ° C холодильнике в темноте.
3. Шарик граф
- Приготовьте разведение 1:10 спаренных бусин в воде или буфере PBS.
- Нагрузка 10 мкл кромочной разбавлении на гемоцитометра в точке ввода образца.
- Граф бусинки видели в одном из 4-х 4 угловых сеток. Подсчитайте общее количество связанных шариков , используя следующую формулу: Count (1 угол 4 х 4 сетки) х (1 х 10 4) х (коэффициент разбавления) х ресуспендирования объем в мл.
4. Подтверждение Antigen Муфта
- Ресуспендируют запаса смеси шариков, соединенных с антигенами интерес вихрем и ультразвуком в течение 20 сек.
- Подготовить рабочую смесь шарик путем разбавления спаренной запасов шарик до конечнойконцентрации 100 бусин / мкл каждого уникального шарика, установленного в PBS-1% BSA буфера (PBS-1% BSA, рН 7,4).
- Приготовьте по крайней мере, 7 двукратные серийные разведения анти-IgG видов первичного антитела в соответствии с рекомендациями производителя в 96-луночных круглодонных пластины с PBS-1% BSA буфера.
- Предварительное смачивание отдельный столбец 8-а (8 строк) 96-луночного фильтра нижней пластины для каждого испытания подтверждения сцепка антигена с помощью 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Добавьте 50 мкл рабочего шарика смеси (антиген-гранулы) в сочетании с предварительно водосборных колодцах.
- Добавляют 50 мкл разведений антител к строкам 1-7 каждого столбца фильтра 96-луночного планшета и 50 мкл PBS-1% BSA буфера к Ряд 8 вместо разведенного антитела , чтобы служить в качестве фоновых скважин. Смешать с многоканальным дозаторов с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз. Выполните ту же процедуру для каждого антигена в сочетании набора борта должны быть подтверждены.
- Накройте и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температурературе в течение 1 ч на микропланшет-шейкере при 500 оборотах в минуту. Удалить супернатант с помощью вакуума.
- Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторить 1 раз. Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
- Развести биотинилированного антитела против IgG к другому виду специфический вторичного антитела обнаружения до 16 мкг / мл в PBS-1% BSA.
- Добавляют 50 мкл разведенной вторичного антитела в каждую лунку с помощью пипетки вверх и вниз в 5 раз.
- Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
- Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
- Развести стрептавидин-R-фикоэритрин (репортер Sape) до 24 мкг / мл в PBS-1% BSA.
- Добавьте 50 мкл репортера в каждую лунку и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз.
- Снад фильтровальной пластине и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
- Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS-1% BSA и анализируют 50 мкл с использованием анализатора 29.
Примечание: Результаты борта на основе мультиплексного иммуноанализа измеряются в Срединной интенсивности флуоресценции (MFI). Всегда можно найти в последней версии программного обеспечения руководства, если таковые имеются, чтобы избежать ошибок.
5. слюнных Multiplex иммуноферментный
- Удалить слюну от -80 ° C морозильника и позволяют оттаивают при комнатной температуре.
- Ресуспендируют антиген в сочетании запасов бусинки вихрем и ультразвуком в течение 20 сек.
- Подготовьте рабочую шарик смеси путем разбавления спаренной запасов шарик до конечной концентрации 100 бусин / мкл каждого уникального набора шарик в PBS-1% BSA буфера.
- Подготовьте 1: 4 разведение слюны шIth PBS-1% BSA буфера в 96-луночный, глубокий луночный планшет.
- Предварительно влажной фильтровальной пластины с 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума.
- Добавляют 50 мкл рабочей смеси и бисерной равным объемом разбавленной слюны до 95 лунок 96-луночных фильтровальных пластин для 1: окончательного разведения, 8. Смешайте реакции с многоканальным дозаторов с. К одной контрольной лунки, добавляют 50 мкл с иммобилизованным антигеном бусин плюс 50 мкл PBS-1% BSA буфера (в качестве замены для слюне).
- Накройте и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч на микропланшет-шейкере со скоростью 500 оборотов в минуту. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
- Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
- Развести биотинилированным козьим IgG против человеческого антитела вторичного обнаружения до 16 мкг / мл в PBS-1% BSA.
- Добавляют 50 мкл разведенного вторичного антитела в каждую лунку и перемешать содержимое сМногоканальная пипетки а.
- Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
- Ресуспендируют бусины в 50 мкл PBS-1% BSA с многоканальным дозаторов с.
- Развести стрептавидин-R-фикоэритрин (репортер Sape) до 24 мкг / мл в PBS-1% BSA.
- Добавляют 50 мкл репортера в каждую лунку и смешайте с многоканальным дозаторов с.
- Крышка фильтра пластины и позволяют инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин на планшетном шейкере. Удалить супернатант с помощью вакуума. Промыть лунки со 100 мкл буфера для промывки и удаления надосадочной жидкости с помощью вакуума. Повторите промывку 1x.
- Ресуспендируют бисером в 100 мкл PBS-1% BSA и анализируют 50 мкл с использованием анализатора 29.
Примечание: Результаты мультиплексного иммуноанализа измеряются в Медиана единицах интенсивности флуоресценции (MFI). Всегда можно найти впоследняя версия программного обеспечения руководства, если таковые имеются, чтобы избежать ошибок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Один уникальный набор шарик был использован в качестве контроля для измерения неспецифического связывания и образца к образцу изменчивости. Эти шарики обрабатывали идентично с антигеном в сочетании бусинок, за исключением, что они не были инкубированы с любым антигеном, на стадии присоединения. Значения MFI> 500, полученные из шариков управления инкубированных со всеми образцами слюны были удалены из дальнейшего анализа в связи с подозрением на загрязнение из сыворотки, а остальные ответы были распределены лог. Слюна может быть загрязнена с сывороткой, если десны тереть слишком энергично с губкой, прикрепленной к устройству сбора или, если участник исследования имеет пародонтоз. Журнал преобразованные данные MFI были использованы для расчета иммунопозитивные точки отсечки 505 MFI, основанный на среднем плюс 3 стандартных отклонений значений MFI журнала. Кроме того, с иммобилизованным антигеном шарики были добавлены к конкретным скважинам, которые были обработаны в качестве тест-лунок в каждом образом, за исключением разбавленнымделены слюна был заменен PBS-1% BSA для оценки фоновой флуоресценции и перекрестной реактивности. Величины MFI, полученные в этих фоновых лунок вычитали из значений MFI от каждого антигена в сочетании набора армирующий для каждого образца слюны.
Бусина муфта была подтверждена с использованием животного происхождения видов специфических антител первичного обнаружения специфических для каждого антигена. Для того, чтобы гарантировать , что антиген в сочетании шарики были способны приблизиться динамический диапазон анализа, мы определили правильное соединение как MFI ≥18,000, наблюдение реакции дозы и перекрестной реактивности между первичными антителами и не-мишеней <10% , как описано 2 , Представительные сцепные Подтверждения для C. jejuni и T. гондий антигенов в анализе, показаны на рисунке 1.
На основе точки отсечения, установленной (505 MFI), скорость immunoprevalences для образцов (п = 2,078) в диапазоне от приблизительно 2% (n = 41) для Т. гондий до почти 50% (п = 1009) для норовирусной GI.1 (рисунок 2). Эти данные указывают на то, что скорость immunoprevalence был самым высоким за норовирусами с последующим вирусом гепатита А и H. пилори.
В то время как 32% (N = 672) из образцов были immunonegative для всех патогенных микроорганизмов в пробе, 68% (N = 1406) были иммунопозитивные к одному или нескольким патогенам. На рисунке 3 показана разбивка иммунопозитивность к одному или нескольким из патогенных микроорганизмов.
Рисунок 1: Муфта подтверждения анализа для двух организмов в мультиплексной иммунологического подтверждения сочетания проводили для всех антигенов и графики для C.. jejuni и T. гондий в этой фигуре представиставитель соединительными подтверждениями для антигенов в мультиплексной иммуноанализа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Immunoprevalence к определенным патогенам Immunoprevalence к определенным патогенам в мультиплексной иммуноанализа варьировались от примерно 2% для T. гондий до почти 50% для норовирусной GI.1. Антитела против норовируса антигенов чаще наблюдаемых с последующим HAV (вирус гепатита А) и H. пилори. Т. гондий и С. jejuni антитела появились реже в образцах слюны проанализированы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию гоэто цифра.
Рисунок 3:. Распределение иммунопозитивность к нескольким патогенам одновременно мультиплекса иммуноанализа позволяет для анализа иммунопозитивность к нескольким патогенам одновременно в мкл объеме 50 пробы. Почти треть из образцов слюны, проанализированных был immunonegative для антител против всех антигенов в мультиплексе. Приблизительно 31% образцов был иммунопозитивные для одного антигена в то время как четверть был положительным для двух антигенов. 9,4% был иммунопозитивные до трех антигенов. 3% был положительным для четырех или более антигенов одновременно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| антиген | Набор из бисера | Муфта буфера | Ag Концентрация (мкг) | # Бусин в 1 углу | # Бусин / мкл | Том для 100 В / мкл в течение 4 мл (мкл) |
| C. jejuni | 8 | MES 5.0 | 50 | 64 | +6400 | 94 |
| H. пилори | 33 | MES 5.0 | 25 | 71 | 7100 | 85 |
| Гепатит А | 42 | MES 5.0 | 100 | 91 | 9100 | 66 |
| Т. гондий | 30 | MES 5.0 | 25 | 85 | +8500 | 71 |
| Норовирусная GII.4 | 55 | MES 5.0 | 5 | 72 | +7200 | 83 |
| Норовирусная GI.1 | 67 | MES 5.0 | 5 | 63 | +6300 | 95 |
| несвязанных | 80 | MES 5.0 | 60 | 6000 | 100 | |
| Общий объем шариков (мкл) | 594 | |||||
| Общий объем буфера необходимо (мкл) | 3406 | |||||
Таблица 1:. Работа шарик смеси для мультиплексного иммуноанализа После связывания и подтверждения были завершены, мастер смесь , состоящую из каждого набора шарик был получен , как показано на рисунке. Мастер-микс был распространен средиЛ.Л. из скважин в 96-луночный планшет. Все лунки инкубировали со слюной, за исключением одного фона контрольной лунки, которая содержала только бусинки и ПБС-1% BSA буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эти результаты указывают на то, что мультиплекс метод иммуноанализа полезен для различения между образцами слюны, которые иммунопозитивные или immunonegative. Для определения иммунопозитивность, одна точка отсечения была разработана путем вычисления среднего значения плюс три стандартных отклонения логарифмических MFI откликов контрольных несвязанных шариков тестируемых со всеми образцами слюны. Точка отсечки дает возможность оценить степень воздействия и immunoprevalence либо к одному или нескольким патогенам. Эта дискриминационная власть может быть полезным при изучении населения для изучения рисков для здоровья, связанных с воздействием на окружающую среду и других патогенных микроорганизмов.
Есть несколько других методов, которые могут быть использованы для определения точки отсечения в зависимости от распределения МФО, несвязанных контроля и какой вопрос исследование предназначен для ответа. Некоторые примеры для определения отсекателей включают конечное смешанное моделирование 24-26, среднее плюс 3стандартные отклонения ответов управления, среднее плюс 2 стандартных отклонений ответов на контроль, и в три раза среднего значения ответов на вопросы управления 27,28. Для простых скринингов, менее строгие критерии могут быть использованы, но при проведении эпидемиологических исследований, она может быть более целесообразно применять более строгое определение, чтобы уменьшить вероятность представления ложных срабатываний. Наша первоначальная заявка смотреть на immunoconversion и immunoprevalence между пловцами и не умеющих плавать. В этом исследовании несвязанных УМФ контроля не были распределены нормально, и результаты были преобразованы журнал.
Преимущества для выполнения бусинки на основе мультиплексного иммуноанализа включают использование очень низких объемов образцов, сокращение времени и труда, а также возможность измерения ответов до 500 аналитов одновременно, при этом требует минимального количества реагентов. В отличие от этого , традиционные методы оценки уровней антител , указывающих на воздействия и / или инфекции (например ,
Ограничения мультиплексного иммуноанализа включают необходимость тщательной оптимизации для определения оптимальной концентрации первичного захвата и обнаружения вторичных антител, антигенов и репортер. Перекрестная реактивность также является серьезной проблемой в иммунологических, как получить антитела против конкретного антигена могут перекрестно реагировать с антигенами из других организмов, и, таким образом, приводить к ложноположительным показаний. Оптимизация, перекрестная реактивность и неспецифического связывания были рассмотрены ранее 2-4. Успех любого такого анализа в значительной степени зависит от способности получить высокую иммуногенность антигенов, а также специфической antiboумирает на эти антигены для использования в буртик муфты и подтверждения муфты шаги. Другим ограничением является ограниченная доступность характеризуется (диагностически положительных и отрицательных) образцов для проверки достоверности анализов.
Есть целый ряд важных шагов в рамках протокола. К ним относятся: обеспечение антигены, которые будут использоваться в сочетании с гранулами не содержат чужеродные белки, азид, глицин, Трис или какие-либо первичные амины. Если какой-либо из этих агентов существует в антигенного препарата, они должны быть удалены с помощью диализа или с помощью хроматографии. Рекомендуется, что следует начать с 5 мкг антигена на 5 миллионов шариков и титруют, чтобы найти оптимальную концентрацию. Выберите оптимальную концентрацию антител обнаружения, что дает лучшую чувствительность и динамический диапазон. Имейте в виду, что сигналы имеют тенденцию к снижению, как концентрации антигена и обнаружения антител увеличения (крюк эффект). Например, если сигнал уменьшается в качестве антигена возрастает концентрация затем обнаруживатьион антитело может быть ограничивающим. И наоборот, если сигналы уменьшаться по мере увеличения обнаруживающего антитела затем репортер (SAPE) может быть ограничивающим. Проверьте мультиплекса для перекрестной реактивности путем объединения оптимальной связи для каждого белка (5000 каждого шарика, установленного на лунку). Проверьте уплотненных наборы из бисера путем объединения с оптимальным количеством антитела обнаружения. Оптимизация репортер и сделать стандартную кривую антигена путем испытания каждого антигена по отдельности.
Устранение мультиплекс иммуноанализа для повышения чувствительности и увеличению медианы флуоресцентного сигнала являются критически важными. Для повышения чувствительности, уменьшить либо количество антигена в сочетании с гранулами или концентрации антител обнаружения. Использование более высокой аффинности антитела для захвата и / или обнаружения могут также повысить чувствительность. Увеличение количества антигена в сочетании с гранулами может увеличить медиану флуоресцентного сигнала. Одно исследование показало, что предварительно инкубирования образцы сыворотки с polyvinylalcohol плюс поливинилпирролидона (PVX) буфер способен подавлять неспецифическое связывание в серологических анализов с использованием бортовое на основе мультиплексного анализа 30 , таких как тот , который мы описываем здесь. Тем не менее, еще одно исследование наших сотрудников не выявил никакого существенного влияния между PBS-БСА и PVX буферов. Они пришли к выводу , что в дальнейшем , из - за более высокой вязкости буфера PVX, это создало проблемы , связанные с бисерной приобретения в анализаторе и образованной пены в микропланшет 3.
В заключение мы представили метод, который позволяет измерять присутствие человека слюнных IgG антител к нескольким патогенам одновременно в очень малом объеме образца. В будущем этот анализ будет использоваться для обнаружения присутствия слюнных антител, связанных с связанных с плавательными выдержках или инфекций, а также помочь информировать моделей оценки рисков. Кроме того, анализ может быть использован для измерения антител, связанных с бортовыми и пищевого происхождения exposurэс, определить случаев инфекции или immunoconversions и обеспечивают критически важную иммунологическую информацию эпидемиологов, проводящие исследования в области народонаселения вопросник типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Агентство США по охране окружающей среды через ее Управление по научным исследованиям и разработкам финансируется и управляется исследований, описанных здесь. Он был подвергнут административному пересмотру Агентства и одобрен для публикации. Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов не означает одобрения или рекомендации для использования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori: lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni: heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Consumables | |||
| 1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µl pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
- Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
