Abstract
Ætiologien og virkningerne af menneskers eksponering for miljømæssige patogener er af stor bekymring i hele verden og dermed vil evnen til at vurdere eksponering og infektioner ved hjælp omkostningseffektive, high-throughput tilgange være uundværlig. Dette håndskrift beskriver udviklingen og analyse af en perle-baserede multiplex immunoassay stand til at måle tilstedeværelsen af antistoffer i humant spyt til flere patogener samtidigt. Spyt er særligt attraktivt i denne ansøgning, fordi det er noninvasiv, billigere og lettere at samle end serum. Antigener fra miljømæssige patogener blev koblet til carboxylerede mikrosfærer (perler) og anvendt til at måle antistoffer i meget små volumener af humane spytprøver bruger bead-baseret, opløsning-fase-assay. Perler blev koblet med antigener fra Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovira (G I.1 og G II.4) og hepatitis A-virus. At sikre, at antigenerne tilstrækkeligt koblet for atperlerne, kobling blev bekræftet ved anvendelse artsspecifikke, animalsk afledte primære fangantistoffer, efterfulgt af inkubation med biotinylerede anti-species sekundære afsløring antistoffer og streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). Som en kontrol for at måle ikke-specifik binding, blev en kanttråd sæt behandlet identisk til de andre undtagen det ikke blev koblet til nogen antigen. De antigen-koblet og kontrol Perlerne blev derefter inkuberet med prospektivt-indsamlede humane spytprøver, målt på et højt gennemløb analysator baseret på principperne om flowcytometri, og tilstedeværelsen af antistoffer mod hvert antigen blev målt i gennemsnitlig fluorescensintensitet enheder (MFI) . Denne multiplex immunoassay har en række fordele, herunder flere data med mindre prøve; reducerede omkostninger og arbejdskraft; og evnen til at tilpasse assayet til mange mål af interesse. Resultaterne viser, at spyt multiplex immunoassay kan være i stand til at identificere tidligere eksponeringer og infektioner, som kan være especially nyttigt i overvågning undersøgelser med store befolkningsgrupper.
Introduction
Firs-otte procent af diarré-sygdom på verdensplan er forbundet med menneskers eksponering for forurenet vand, farlige fødevarer og dårlig sanitet / hygiejne, der forårsager ca. 1,5 millioner dødsfald, hvoraf de fleste er børn 1. Dette er en væsentlig årsag til bekymring for den offentlige sundhed embedsmænd og politikere. I et forsøg på at undersøge eksponeringer og sygdomme forbundet med vandbaseret og andre miljømæssige patogener, udviklede vi en multiplex immunoassay til måling af antistoffer i humane prøver 2-4. Denne metode kan anvendes på epidemiologiske undersøgelser for at bestemme menneskers udsættelse for disse patogener og for bedre at definere immunoprevalence og hændelser infektioner.
Spyt besidder betydelig lovende som et alternativ til serum til human biomarkør forskning. Blandt fordelene ved at anvende spyt er de ikke-invasivitet og let prøveindsamling, lave omkostninger, og prøver kan let indsamles fra børn 5-7 </ Sup>. Serum- og spytprøver er blevet omfattende undersøgt for antistoffer mod H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatitisvira A og C 13-14, norovira 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue virus 16, humant immundefektvirus (HIV) 17, og Escherichia coli O157: H7 18.
En multiplex immunoassay tillader analyse af flere analytter samtidigt i en enkelt prøve volumen og inden for en enkelt cyklus eller løbe. Multipleksede antigener fra C. jejuni, T. gondii, H. pylori, blev hepatitis A virus og to norovira anvendes til måling humant spyt IgG 2-4 og IgA 3,4 og plasma IgG 2,3 antistofreaktioner til disse patogener under anvendelse af enperle-baserede multiplexing immunoassay. Når det bruges sammen med epidemiologiske undersøgelser af eksponering for mikrober i vand, jord og fødevarer, kan type assay er beskrevet i denne undersøgelse give værdifuld information til at øge forståelsen af infektioner forårsaget af miljømæssige patogener. Desuden kan spyt antistof data fra sådanne undersøgelser anvendes til at forbedre risikovurderingsmodeller 19-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkendelse blev opnået fra Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) til indsamling af stimulerede creviculære spytprøver fra beachgoers på Boquerón Beach, Puerto Rico, som en del af USA Environmental Protection Agency (USEPA) National epidemiologiske og miljøvurdering af Fritids (neear) Vand Study 23 for at vurdere svømning forbundet eksponeringer og sygdomme. Undersøgelse emner forudsat informeret samtykke og blev instrueret om brugen af spyt indsamlingen enhed af uddannede USEPA entreprenører. De spytprøver blev afsendt på is og ved modtagelsen, blev de centrifugeret og opbevaret ved -80 ° C som beskrevet 4.
1. Bead Aktivering
- Resuspender perle sæt lagre ved hvirvelblanding og sonikering i 20 sek og overførsel ca. 5,0 x 10 6 bestanden perler (400 pi) til mikrocentrifugerør.
Bemærk: Than Kuglerne forsynes ved en koncentration på 12,5 x 10 6 perler / ml. - Bundfælde lager perler ved centrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleterede perler i 100 pi destilleret vand (dH 2 O) ved vortex og lydbehandling i 20 sek. Gentag trin 1.2.
- Fjern supernatanten og resuspender de vaskede perler i 80 pi 100 mM natriumphosphat monobasisk, pH 6,2 ved vortex og lydbehandling i 20 sek.
- Umiddelbart før brug, lave en 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) opløsning ved tilsætning af 200 pi dH2O til 10 mg sulfo-NHS alikvot. Bland ved vortex.
- Tilsæt 10 pi af 50 mg / ml sulfo-NHS til perlerne. Bland ved vortex.
- Umiddelbart før brug, lave en 50 mg / ml 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC) opløsning ved tilsætning af 200 pi destilleret vand (dH 2 O) til 10 mg EDC portion. Bland ved vortex.
- Tilsæt 10 pi 50mg / ml EDC opløsning til perlerne. Bland ved vortex. Inkuber perlerne i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke, under blanding ved vortex med 10 minutters intervaller. Pelletere aktiverede perler ved mikrocentrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender perlerne i 250 pi 50 mM 2- [N -Morpholino] ethansulfonsyre (MES), pH 5,0 ved vortex og lydbehandling i 20 sek.
- Pelletere aktiverede perler ved mikrocentrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Gentag trin 1.9 og 1.10.
Bemærk: Dette giver i alt to vaske med 50 mM MES, pH 5,0. - Resuspendere perlerne i 100 pi 50 mM MES, pH 5,0 ved vortex og sonikering i 20 sek.
2. Bead Kobling
- Par antigenerne til perlen sæt med de viste koncentrationer i tabel 1.
- Tilføj hvert antigen til de aktiverede perler og bringe det totale volumen til 500 pi i 50 mM MES, pH 5,0. Bland antigenerne end beads af vortex.
- Inkubér antigener og perlerne i 2 timer med blanding ved rotation (~ 15 rpm) ved stuetemperatur i mørke. Pelletere koblede perler ved mikrocentrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender perlerne i 500 pi phosphatpufret saltvand (PBS) -bovine serumalbumin (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolaurat (Tween-20) -natrium azid (PBS-TBN) pH 7,4 ved vortex og lydbehandling. Pelletere beads af mikrocentrifugering ved 10.000 xg i 2 min og fjern supernatanten.
Forsigtig: Natriumazid er en akut giftige kemikalie. Det er livsfarligt at sluge eller kommer i kontakt med huden. Undgå indånding af pulver / røg / gas / tåge / dampe eller spray. Bær egnede personlige værnemidler (PPE s) ved håndtering og bortskaffes i overensstemmelse med relevante love. - Resuspendere perlerne i 1 ml PBS-TBN efter vortex og sonikering i 20 sek.
- Pelletere beads af mikrocentrifugering ved 10.000 xg i 2 min.
- Gentag trin 2.5 og 2.6.
Bemærk: Dette giver i alt to gange vask med PBS-TBN. - Resuspendere koblede og vaskede perler i 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% azid, pH 7,4. Opbevar koblede perler i 2-8 ° C køleskab i mørke.
3. Bead Count
- Der fremstilles en 1:10 fortynding af de koblede perler i vand eller PBS-buffer.
- Load 10 pi af vulsten fortynding onto et hæmocytometer ved prøveintroduktion punkt.
- Tæl perlerne set i en af de 4 x 4 hjørne gitre. Beregn det samlede antal af koblede perler ved hjælp af følgende formel: Count (1 hjørne af 4 x 4 gitter) x (1 x 10 4) x (fortyndingsfaktor) x resuspension volumen i ml.
4. Bekræftelse af Antigen Kobling
- Resuspender bestanden blanding af perler koblet til antigener af interesse ved vortex og lydbehandling i 20 sek.
- Forbered en arbejdsgruppe perle blanding ved at fortynde de koblede perle lagre til en endeligkoncentration på 100 kugler / pl af hver unik perle sat i PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).
- Fremstilles mindst 7 to-gange serielle fortyndinger af anti-arter IgG primære antistof ifølge producentens anbefalinger i 96-brønds rundbundet plade med PBS-1% BSA buffer.
- Pre-våde en separat 8 brønde søjle (8 rækker) af en 96-brønds filter bundplade for hvert antigen kobling bekræftelse test med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Der tilsættes 50 pi arbejder perleblanding (antigen-koblede perler) til de præ-våde brønde.
- Der tilsættes 50 pi antistoffortyndinger til rækker 1-7 af hver kolonne i 96-brønds filterplade og 50 pi PBS-1% BSA-puffer til række 8 i stedet for fortyndet antistof til at tjene som baggrund brønde. Bland med en multi-kanal pipette ved pipettering op og ned 5 gange. Udfør den samme procedure for hver antigen-koblede perle indstillet til at blive bekræftet.
- Dæk og lad det inkubere i mørke ved stue tempperatur i 1 time på en mikroplade ryster ved 500 rpm. Fjern supernatanten ved vakuum.
- Vask brøndene med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Gentag 1x. Resuspendere perlerne i 50 pi PBS-1% BSA med en multi-kanal pipette.
- Fortynd biotinyleret anti-arter specifikt IgG sekundært detektionsantistof til 16 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Der tilsættes 50 pi fortyndet sekundært antistof til hver brønd ved pipettering op og ned 5 gange.
- Dæk filterplade og tillade at inkubere i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter på en pladeryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brøndene med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Gentag vask 1x.
- Resuspendere perlerne i 50 pi PBS-1% BSA med en multi-kanal pipette.
- Fortynd streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE) til 24 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Der tilsættes 50 pi reporter til hver brønd og bland ved pipettering op og ned 5 gange.
- Cløbet filterplade og tillade at inkubere i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter på en pladeryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brøndene med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Gentag vask 1x.
- Resuspender perler i 100 pi PBS-1% BSA og analysere 50 pi under anvendelse analysatoren 29.
Bemærk: Resultater af perle-baserede multiplex immunoassay måles i Median Fluorescence Intensity (MFI). Se altid den nyeste version af softwaren manual, hvis den er tilgængelig for at undgå fejl.
5. Spyt Multiplex Immunoassay
- Fjern spyt fra -80 ° C fryser og lad den tø op ved stuetemperatur.
- Resuspender antigen koblede perle lagre af vortex og lydbehandling i 20 sek.
- Forbered en arbejder perleblanding ved at fortynde de koblede perle lagre til en slutkoncentration på 100 kugler / pl af hver unik perle sæt i PBS-1% BSA buffer.
- Forbered en 1: 4 fortynding af spyt wi'te PBS-1% BSA-puffer i en 96 brønd, dyb brøndplade.
- Pre-wet filter plade med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum.
- Der tilsættes 50 ul af en arbejder perleblanding og et lige volumen af fortyndet spyt til 95 brønde af brønden filterplader 96 for en 1: 8 endelig fortynding. Bland reaktioner med en multi-kanal pipette. Til den ene kontrol godt, tilsættes 50 pi antigen-koblede perler plus 50 pi PBS-1% BSA-puffer (som erstatning for spyt).
- Låget, og der inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 1 time på en mikroplade ryster ved 500 rpm. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brøndene med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Gentag vask 1x.
- Resuspender perler i 50 pi PBS-1% BSA med en multi-kanal pipette.
- Fortynd biotinyleret gede-anti-humant IgG sekundært detektionsantistof til 16 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Tilsæt 50 pi fortyndet sekundært antistof til hver brønd, og bland indholdet meden multi-kanal pipette.
- Dæk filterplade og tillade at inkubere i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter på en pladeryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brøndene med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Gentag vask 1x.
- Resuspender perler i 50 pi PBS-1% BSA med en multi-kanal pipette.
- Fortynd streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE) til 24 ug / ml i PBS-1% BSA.
- Tilføj 50 pi reporter til hvert hul og blandes med en multi-kanal pipette.
- Dæk filterplade og tillade at inkubere i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter på en pladeryster. Fjern supernatanten ved vakuum. Vask brøndene med 100 pi vaskebuffer og fjern supernatanten ved vakuum. Gentag vask 1x.
- Resuspender perler i 100 pi PBS-1% BSA og analysere 50 pi under anvendelse analysatoren 29.
Bemærk: Resultaterne af den multiplex immunoassay måles i Median fluorescensintensitet (MFI) enheder. Altid henvise tilden nyeste version af softwaren manual, hvis den er tilgængelig for at undgå fejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En unik perle sæt blev anvendt som kontrol til måling af ikke-specifik binding og prøve til prøve variabilitet. Disse perler blev behandlet identisk til antigenet koblet perler med den undtagelse, at de ikke blev inkuberet med en hvilken som helst antigen i koblingstrinnet. MFI-værdier> 500 opnået fra kontrol-perler inkuberet med alle spytprøver blev fjernet fra yderligere analyser skyldes den påståede forurening fra serum, og de resterende responser blev log fordelt. Spyt kan være forurenet med serum, hvis tandkødet gnides for voldsomt med svampen fastgjort til opsamlingsindretningen eller hvis deltageren har paradentose. Loggen transformerede MFI data blev brugt til at beregne en immunpositive skæringspunkt på 505 MFI baseret på gennemsnitsværdien plus 3 standardafvigelser af de log MFI-værdier. Derudover blev antigen-koblede perler sættes til specifikke brønde, der blev behandlet som testbrønde på enhver måde, bortset dilFullrate spyt blev erstattet med PBS-1% BSA for at evaluere baggrundsfluorescens og krydsreaktivitet. MFI-værdier opnået ved disse baggrund brønde blev trukket fra MFI-værdier fra hvert antigen-koblet perle sæt for hver spytprøve.
Bead kobling blev bekræftet under anvendelse dyr afledt artsspecifikke primære påvisningsantistoffer specifikke for hvert antigen. At sikre, at antigenet koblet perler var i stand til at nærme sig dynamisk område for analysen definerede vi korrekt kobling som en MFI ≥18,000, observation af dosisrespons og krydsreaktivitet mellem primære antistoffer og ikke-mål af <10% som beskrevet 2 . Repræsentative kobling bekræftelser til C. jejuni og T. gondii af antigenerne i assayet er vist i figur 1.
Baseret på cut-off punkt etableret (505 MFI), den immunoprevalence satss for prøverne (n = 2.078) varierede fra ca. 2% (n = 41) til T. gondii til næsten 50% (n = 1009) for norovirus GI.1 (figur 2). Dataene indikerer, at immunoprevalence sats var højst for norovira efterfulgt af hepatitis A-virus og H. pylori.
Mens 32% (n = 672) af prøverne var immunonegative for alle patogener i assayet, 68% (n = 1.406) var immunpositive til en eller flere patogener. Figur 3 viser fordelingen af immunopositivitet til en eller flere af patogener.
Figur 1: Kobling bekræftelse analyser for to af organismer i multiplex immunoassay Kobling bekræftelse blev udført for alle de antigener og graferne for C.. jejuni og T. gondii i denne figur er repræsensentant af koblingen bekræftelser for antigenerne i multiplex immunoassay. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Immunoprevalence til specifikke patogener Immunoprevalence til specifikke patogener i multiplex immunoassay varierede fra omkring 2% for T. gondii til næsten 50% for norovirus GI.1. Antistoffer mod norovirus antigener blev mere almindeligt observeret efterfulgt af HAV (hepatitis A-virus) og H. pylori. T. gondii og C. jejuni antistoffer optrådte mindre hyppigt i spytprøver analyserede. Klik her for at se en større udgave af ther figur.
Figur 3:. Fordeling af immunopositivitet til flere patogener samtidigt multiplex immunoassay muliggør analysen af immunopositivitet til flere patogener samtidig i en 50 pi prøvevolumen. Næsten en tredjedel af spytprøver analyseret var immunonegative for antistoffer mod alle de antigener i multiplex. Ca. 31% af prøverne var immunpositive for et antigen, mens en fjerdedel var positiv til to antigener. 9,4% var immunpositive til tre antigener. 3% var positive for fire eller flere antigener samtidigt. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antigen | Bead Set | koblingspuffer | Ag Koncentration (ug) | # Af perler i en hjørne | # Af perler / pl | Vol. for 100 B / uL for 4 ml (pi) |
| C. jejuni | 8 | MES 5.0 | 50 | 64 | 6400 | 94 |
| H. pylori | 33 | MES 5.0 | 25 | 71 | 7100 | 85 |
| Hepatitis A | 42 | MES 5.0 | 100 | 91 | 9100 | 66 |
| T. gondii | 30 | MES 5.0 | 25 | 85 | 8500 | 71 |
| Norovirus GII.4 | 55 | MES 5.0 | 5 | 72 | 7200 | 83 |
| Norovirus GI.1 | 67 | MES 5.0 | 5 | 63 | 6300 | 95 |
| frakoblet | 80 | MES 5.0 | 60 | 6.000 | 100 | |
| Samlet volumen af perler (pi) | 594 | |||||
| Samlet volumen af puffer nødvendig (pi) | 3406 | |||||
Tabel 1:. Working perleblanding for multiplex immunoassay Efter kobling og bekræftelse blev afsluttet, en master mix bestående af hver perle sæt blev fremstillet som vist. Det store mix blev spredt på enll i brøndene i 96-brønds pladen. Alle brøndene blev inkuberet med spyt med undtagelse af én kontrol baggrund brønd, som indeholdt kun perler og PBS-1% BSA buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse resultater indikerer, at multiplex immunoassay metode er nyttig til at skelne mellem spytprøver, der er immunpositive eller immunonegative. For at bestemme immunopositivitet, blev en enkelt skæringspunkt udviklet ved at beregne gennemsnittet plus tre standardafvigelser af de log transformeret MFI svarene fra de testede med alle de spytprøver kontrol koblede perler. Den skæringspunkt gav mulighed for at vurdere eksponeringen og immunoprevalence til enten en enkelt eller flere patogener. Denne diskriminerende magt kan være nyttig i befolkningsundersøgelser for at undersøge sundhedsmæssige risici forbundet med udsættelse for miljømæssige og andre patogener.
Der er flere andre metoder, der kan anvendes til at bestemme en skæringspunkt afhængigt af fordelingen af MFI'er, afkoblede betjeningsgrebene og spørgsmål undersøgelsen er udformet til at svare. Nogle eksempler til bestemmelse cut-offs inkluderer finite blandet modellering 24-26, mener plus 3standardafvigelser af reaktioner på kontrol, betyder plus 2 standardafvigelser af reaktioner på kontrol, og tre gange gennemsnittet af svarene på kontrol 27,28. For simple screeninger, kan mindre strenge kriterier anvendes, men til epidemiologiske undersøgelser, kan det være mere hensigtsmæssigt at ansætte en strengere definition at reducere sandsynligheden for at rapportere falske positiver. Vores oprindelige ansøgning er at se på immunoconversion og immunoprevalence mellem svømmere og ikke-svømmere. I denne undersøgelse blev de afkoblede kontrol MFI'er ikke normalfordelte og resultaterne blev log transformeret.
Fordele ved at udføre en perle-baserede multiplex immunoassay indbefatter anvendelsen af prøvevolumener meget lave, reduktion i tid og arbejde og evnen til at måle responser i op til 500 analytter samtidigt og den kræver en minimal mængde af reagenser. Derimod traditionelle metoder til vurdering af antistofniveau indikerer eksponering og / eller infektion (f.eks
Begrænsninger af en multiplex immunoassay omfatter behovet for streng optimering for at bestemme de optimale koncentrationer af primære opsamling og sekundære afsløring antistoffer, antigener og reporter. Krydsreaktivitet er også et stort problem i immunoassays som antistoffer mod et bestemt antigen kan krydsreagere med antigener fra andre organismer og derved føre til falsk positive aflæsninger. Optimering, blev krydsreaktivitet og ikke-specifik binding rettet tidligere 2-4. Succesen af en sådan assay er meget afhængig af evnen til at opnå stærkt immunogene antigener samt specifikke Antibodør til disse antigener til brug i perle kobling og kobling bekræftelse. En anden begrænsning er den begrænsede tilgængelighed af karakteriseret (diagnostisk positive og negative) prøver at validere assays.
Der er en række kritiske skridt i protokollen. Disse omfatter: sikring af antigener, vil blive koblet til perlerne ikke indeholder fremmede proteiner, azid, glycin, Tris eller andre primære aminer. Hvis nogen af disse midler findes i antigenpræparationen, bør de fjernes ved dialyse eller kromatografi. Det anbefales, at man skal starte med 5 ug af antigen per 5 millioner perler og titreres for at finde den optimale koncentration. Vælge den optimale detektionsantistof koncentration, der giver den bedste følsomhed og dynamikområde. Husk på, at signaler tendens til at falde som antigen og påvisning antistofkoncentrationer stigning (hook-effekt). For eksempel, hvis signalet falder som antigen koncentrationen øges derefter detektereion antistof kan være begrænsende. Omvendt, hvis signaler falde som afsløring antistof stiger derefter reporter (SAPE) kan være begrænsende. Kontroller multiplex for krydsreaktivitet ved at kombinere den optimale kobling for hvert protein (5.000 af hver perle sæt per brønd). Test de multipleksede perlesæt ved kombination med den optimale detektionsantistof beløb. Optimere reporteren og gøre en standardkurve af antigenet ved at teste hvert antigen individuelt.
Fejlfinding en multiplex immunoassay for at forbedre følsomheden og øge median fluorescerende signal er kritisk vigtigt. For at forbedre følsomheden, falde enten mængden af antigen koblet til perlerne eller koncentration detektionsantistoffet. Anvendelsen af en højere affinitet antistof til indfangning og / eller detektion kan også forbedre følsomheden. Forøgelse af mængden af antigen koblet til perlerne kan øge medianen fluorescerende signal. En undersøgelse viste, at præ-inkubering serumprøver med polyvinylalsprit, plus polyvinylpyrrolidon (PVX) buffer er i stand til at undertrykke ikke-specifik binding i serologiske assays ved anvendelse vulsten-baserede multiplex assay 30 som den, vi beskriver her. Men en anden undersøgelse, som vores samarbejdspartnere fundet nogen signifikant effekt mellem PBS-BSA og PVX buffere. De konkluderede endvidere, at på grund af den højere viskositet af PVX buffer, det skabte problemer med perle opkøb i analysatoren og dannede skum i mikropladebrøndene 3.
Som konklusion har vi præsenteret en metode, der er i stand til at måle tilstedeværelsen af humane spyt IgG antistoffer mod multiple patogener samtidig i en meget lille prøvevolumen. I fremtiden vil dette assay anvendes til at påvise tilstedeværelsen af spyt antistoffer forbundet med swimming påvirkninger eller infektioner og hjælpe informere risikovurderingsmodeller. Derudover kan assayet anvendes til at måle antistoffer associeret med luftbårne og fødevarebårne exposures, fastlægge hændelsen infektioner eller immunoconversions og give vigtige immunologiske oplysninger til epidemiologer udfører spørgeskema-type befolkningsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De Environmental Protection Agency gennem Harmoniseringskontoret for forskning og udvikling finansieret og ledet forskningen beskrevet her. Det er blevet udsat for agenturets administrative gennemgang og godkendt til offentliggørelse. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter udgør ikke godkendelse eller anbefaling til brug.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori: lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni: heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Consumables | |||
| 1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µl pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
- Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
