Abstract
Etiologi och konsekvenser av människors exponering för miljö patogener är ett stort bekymmer i världen och därmed skulle förmåga att bedöma exponering och infektioner med hjälp av kostnadseffektiva, hög genomströmning tillvägagångssätt vara nödvändigt. Detta manuskript beskriver utvecklingen och analys av en sträng-baserade multiplex immun kan mäta förekomsten av antikroppar i mänsklig saliv till flera patogener samtidigt. Saliv är särskilt attraktiv i denna tillämpning eftersom den är icke-invasiv, billigare och lättare att samla än serum. Antigener från miljömässiga patogener kopplades till karboxylerade mikrosfärer (pärlor) och användes för att mäta antikroppar i mycket små volymer av humana salivprover med användning av en pärla-baserade, assay lösningsfas. Pärlor kopplades med antigener från Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G I.1 och G II.4) och hepatit A-virus. För att säkerställa att antigenerna tillräckligt kopplades tillpärlorna var koppling bekräftas med artspecifika, animaliska primärinfångningsantikroppar, följt av inkubation med biotinylerade anti-arter sekundära antikroppar upptäckt och streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE). Som en kontroll för att mäta icke-specifik bindning, var en pärla uppsättning behandlades identiskt med de andra förutom att det inte kopplades till varje antigen. De antigenkopplade och kontrollpärlor inkuberades sedan med prospektivt-uppsamlade humana salivprover, mätt på en hög genomströmning analysator baserat på principerna för flödescytometri, och närvaron av antikroppar mot varje antigen mättes i Median Fluorescence Intensity heter (MFI) . Denna multiplex immun har ett antal fördelar, inklusive mer data med mindre prov; minskade kostnader och arbete; och förmågan att anpassa analysen till många mål av intresse. Resultaten tyder på att saliv multiplex immun kan vara i stånd att identifiera tidigare exponeringar och infektioner, som kan vara especially användbar i övervakningsstudier med stora befolkningsgrupper.
Introduction
Åttioåtta procent av diarré relaterad sjukdom i världen förknippas med exponering för förorenat vatten, osäkra mat och dåliga sanitära förhållanden / hygien, vilket cirka 1,5 miljoner dödsfall, varav de flesta är barn 1. Detta är en viktig orsak till oro för folkhälsan tjänstemän och beslutsfattare. I ett försök att undersöka exponeringar och sjukdomar som förknippas med vattenburna och andra miljö patogener, har vi utvecklat en multiplex immun att mäta antikroppar i humana prover 2-4. Denna metod kan tillämpas på epidemiologiska studier för att bestämma människors exponering för dessa patogener och för att bättre definiera immunoprevalence och incident infektioner.
Saliv innehåller mycket lovande som ett alternativ till serum för mänskliga biomarkör forskning. Bland fördelarna med att använda saliv är den icke-invasiv och enkel provuppsamling, låg kostnad, och prover kan enkelt samlas in från barn 5-7 </ Sup>. Serum- och salivprov har studerats ingående med avseende på antikroppar mot H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoni 12, hepatitvirus A och C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue-virus 16, humant immunbristvirus (HIV) 17, och Escherichia coli O157: H7 18.
En multiplex immunoanalys möjliggör analys av flera analyter samtidigt i en enda provvolym och inom en enda cykel eller springa. Multiplexade antigener från C. jejuni, T. gondii, H. pylori, var hepatit A-virus, och två norovirus används för att mäta mänsklig saliv IgG 2-4 och IgA 3,4 och plasma-IgG 2,3 antikroppssvar till dessa patogener med hjälp av enbead baserade multiplexering immunoanalys. När den används tillsammans med epidemiologiska studier av exponering för mikrober i vatten, jord och mat, kan typen av analys som beskrivs i denna studie ge värdefull information för att öka förståelsen av infektioner orsakade av miljömässiga patogener. Dessutom kan salivantikropps data som erhållits från sådana studier kan användas för att förbättra riskbedömningsmodeller 19-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande erhölls från Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) för insamling av stimulerade krevikulär salivprover från beachgoers på Boquerón Beach, Puerto Rico, som en del av USA Environmental Protection Agency (USEPA) nationella epidemiologiska och miljöbedömning av fritids (NEEAR) vatten Studie 23 för att bedöma simning associerade exponeringar och sjukdomar. Försökspersoner under förutsättning informerat samtycke och instruerades om användningen av saliv uppsamlingsanordningen av utbildad USEPA entreprenörer. De salivprover skeppades på is och, vid mottagning, de centrifugerades och lagrades vid -80 ° C såsom beskrivits 4.
1. Bead Aktivering
- Resuspendera pärla set lager genom skakning och sonikering under 20 sekunder och överföra ungefär 5,0 x 10 6 av aktie pärlor (400 l) för att mikrocentrifugrör.
Obs: Than pärlor är försörjda med en koncentration av 12,5 x 10 6 pärlor / ml. - Pellets stock pärlorna genom centrifugering vid 10.000 xg under 2 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pellet pärlor i 100 pl destillerat vatten (dH 2 O) genom vortex och sonikering under 20 sekunder. Upprepa steg 1,2.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera de tvättade pärlorna i 80 | il av 100 mM natriumfosfat, monobasiskt, pH 6,2 genom virvling och sonikering under 20 sek.
- Omedelbart före användning, göra en 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) lösning genom att tillsätta 200 pl dH 2 O till 10 mg Sulfo-NHS delmängd. Blanda genom virvel.
- Tillsätt 10 | il av 50 mg / ml Sulfo-NHS till pärlorna. Blanda genom virvel.
- Omedelbart före användning, göra en 50 mg / ml 1-etyl- [3dimethylaminopropyl] karbodiimidhydroklorid (EDC) lösning genom att tillsätta 200 pl destillerat vatten (dH 2 O) till 10 mg EDC delmängd. Blanda genom virvel.
- Tillsätt 10 | il av 50mg / ml EDC-lösning till pärlorna. Blanda genom virvel. Inkubera pärlorna under 20 min vid rumstemperatur, i mörker, med blandning genom vortex vid 10 minuters intervall. Pellet de aktiverade pärlorna genom mikrocentrifugering vid 10000 x g under 2 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 250 | il av 50 mM 2- [N morfolino] etansulfonsyra (MES), pH 5,0 genom virvling och sonikering under 20 sek.
- Pellet de aktiverade pärlorna genom mikrocentrifugering vid 10000 x g under 2 min.
- Upprepa steg 1,9 och 1,10.
Notera: Detta ger totalt två tvättar med 50 mM MES, pH 5,0. - Resuspendera kulorna i 100 pl av 50 mM MES, pH 5,0 genom vortex och sonikering under 20 sek.
2. Bead Koppling
- Par antigenerna till pärlan uppsättningar med hjälp av koncentrationerna som visas i tabell 1.
- Lägg varje antigen till de aktiverade pärlorna och bringa den totala volymen till 500 | il i 50 mM MES, pH 5,0. Blanda antigenerna end pärlor efter virvel.
- Inkubera antigener och pärlor för 2 h med blandning genom rotation (~ 15 rpm) vid rumstemperatur i mörker. Pellet de kopplade pärlorna genom mikrocentrifugering vid 10000 x g under 2 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 500 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -bovine serumalbumin (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolaurat (Tween-20) natrium-azid (PBS-TBN) pH 7,4 genom vortex och sonikering. Pellets pärlorna genom mikrocentrifugering vid 10000 x g under 2 min och avlägsna supernatanten.
Varning: Natriumazid är ett akut giftig kemikalie. Det är dödligt vid förtäring eller kommer i kontakt med huden. Undvik inandning av damm / rök / gas / dimma / ånga eller spray. Bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE s) vid hantering och kassera i enlighet med tillämpliga lagar. - Resuspendera kulorna i 1 ml PBS-TBN av virvel och sonikering under 20 sek.
- Pellets pärlorna genom mikrocentrifugering vid 10000 x g under 2 min.
- Upprepa steg 2,5 och 2,6.
Obs: Detta ger totalt två tvättar med PBS-TBN. - Resuspendera de kopplade och tvättade pärlorna i 1 ml PBS, 1% BSA, 0,05% azid, pH 7,4. Lagra de kopplade pärlorna i ett 2-8 ° C kylskåp i mörker.
3. Bead Count
- Bered en 1:10 spädning av de kopplade pärlorna i vatten eller PBS-buffert.
- Belastning 10 pl av pärlan utspädning till en hemocytometer vid provinföringspunkten.
- Räkna kulorna sett i ett av de 4 x 4 hörngaller. Beräkna det totala antalet kopplade pärlor med användning av följande formel: Count (1 hörnet av 4 x 4 rutnät) x (1 x 10 4) x (utspädningsfaktor) x resuspension volymen i ml.
4. Bekräftelse av antigen Coupling
- Resuspendera lager blandning av pärlor kopplade till antigener av intresse genom vortex och sonikering under 20 sek.
- Förbered en fungerande kornsblandningen genom att späda de kopplade pärla lager till en slutligkoncentration av 100 pärlor / il av varje unik pärla inställd i PBS-1% BSA-buffert (PBS-1% BSA, pH 7,4).
- Förbereda minst 7 två-faldiga seriespädningar av anti-species IgG primära antikroppen i enlighet med tillverkarens rekommendationer i 96-brunnars rundbottnad platta med PBS-1% BSA-buffert.
- Pre-våt en separat 8-brunnars-kolonn (8 rader) av en 96-brunnars filterbottenplatta för varje antigen bekräftelsekopplingstestet med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Tillsätt 50 pl av arbetskornsblandning (antigen-kopplade pärlor) till pre-våta brunnar.
- Tillsätt 50 pl av antikroppsspädningar till raderna 1-7 i varje kolumn i 96-brunnars filterplatta och 50 | il av PBS-1% BSA-buffert till rad 8 i stället för utspädda antikroppen för att tjäna som bakgrundsbrunnar. Blanda med en flerkanalig pipett genom att pipettera upp och ned 5 gånger. Utför samma procedur för varje antigen kopplade pärla set bekräftas.
- Täck och låt inkubera i mörker vid rumstemperaturratur under 1 h på en mikroplattskakanordning vid 500 rpm. Avlägsna supernatanten med vakuum.
- Tvätta brunnarna med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Upprepa 1x. Resuspendera kulorna i 50 fil PBS-1% BSA med en flerkanalig pipett.
- Späd biotinylerade anti-artspecifik IgG sekundär detektionsantikropp till 16 pg / ml i PBS-1% BSA.
- Tillsätt 50 pl av utspätt sekundär antikropp till varje brunn genom att pipettera upp och ned 5 gånger.
- Täcka filterplatta och låt inkubera i mörker vid rumstemperatur under 30 min på en plattskakanordning. Avlägsna supernatanten med vakuum. Tvätta brunnarna med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Upprepa tvätt 1x.
- Resuspendera kulorna i 50 fil PBS-1% BSA med en flerkanalig pipett.
- Späd streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE) till 24 pg / ml i PBS-1% BSA.
- Tillsätt 50 pl av reporter till varje brunn och blanda genom att pipettera upp och ned 5 gånger.
- Cöver filterplattan och låt inkubera i mörker vid rumstemperatur under 30 min på en plattskakanordning. Avlägsna supernatanten med vakuum. Tvätta brunnarna med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Upprepa tvätt 1x.
- Resuspendera pärlor i 100 pl PBS-1% BSA och analysera 50 ul med hjälp av analysatorn 29.
Notera: Resultat av vulsten baserade multiplex immunanalys mäts i Median Fluorescence Intensity (MFI). Se alltid till den senaste versionen av programvaran manuellt, om det finns för att undvika fel.
5. Spott Multiplex Immunoassay
- Ta bort saliv från -80 ° C frys och tillåta att tina vid rumstemperatur.
- Resuspendera antigen kopplat pärla lager av vortex och sonikering under 20 sekunder.
- Bered en arbetskornsblandningen genom att späda de kopplade däckfotslager till en slutlig koncentration av 100 pärlor / il av varje unik bead set i PBS-1% BSA-buffert.
- Förbered en 1: 4 utspädning av saliv wed PBS-1% BSA-buffert i en 96 brunnar, djupa brunnar.
- Pre-våta filterplattan med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum.
- Tillsätt 50 pl av en arbetskornsblandning och en lika stor volym av utspädd saliv till 95 brunnarna i 96-brunns filterplattor för en 1: 8 slutlig spädning. Blanda reaktioner med en flerkanalig pipett. Till ett kontrollbrunnen, tillsätt 50 | il antigen-kopplade pärlor plus 50 pl av PBS-1% BSA-buffert (som en ersättning för saliv).
- Täck och låt inkubera i mörker vid rumstemperatur under 1 h på en mikroplattskakanordning vid 500 rpm. Avlägsna supernatanten med vakuum. Tvätta brunnarna med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Upprepa tvätt 1x.
- Återsuspendera pärlorna i 50 | il av PBS-1% BSA med en flerkanalig pipett.
- Utspädd biotinylerad get anti-human IgG sekundär detektionsantikropp till 16 pg / ml i PBS-1% BSA.
- Tillsätt 50 | il utspädda sekundär antikropp till varje brunn och blanda innehållet meden flerkanalspipetterings.
- Täcka filterplatta och låt inkubera i mörker vid rumstemperatur under 30 min på en plattskakanordning. Avlägsna supernatanten med vakuum. Tvätta brunnarna med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Upprepa tvätt 1x.
- Återsuspendera pärlorna i 50 | il av PBS-1% BSA med en flerkanalig pipett.
- Späd streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE) till 24 pg / ml i PBS-1% BSA.
- Tillsätt 50 l reporter till varje brunn och blanda med en flerkanalig pipett.
- Täcka filterplatta och låt inkubera i mörker vid rumstemperatur under 30 min på en plattskakanordning. Avlägsna supernatanten med vakuum. Tvätta brunnarna med 100 pl av tvättbuffert och avlägsna supernatanten genom vakuum. Upprepa tvätt 1x.
- Resuspendera pärlor i 100 pl PBS-1% BSA och analysera 50 ul med hjälp av analysatorn 29.
Obs: Resultaten av multiplex immun mäts i Median fluorescensintensitet (MFI) enheter. Läs alltidden senaste versionen av programvaran manuellt, om det finns för att undvika fel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En unik pärla uppsättning användes som en kontroll för att mäta icke-specifik bindning och prov till prov variabilitet. Dessa pärlor behandlades identiskt med de antigen kopplade pärlor med det undantaget att de inte inkuberats med någon antigen i kopplingssteget. MFI-värden> 500 erhålls från kontroll pärlor inkuberade med alla salivprover togs bort från vidare analyser på grund av misstänkt förorening från serum och de återstående svar logga ut. Saliven kan vara kontaminerade med serum om tandköttet gnuggas alltför kraftigt med svamp fäst vid uppsamlingsanordningen eller om studiedeltagaren har tandlossning. Logg omvandlas MFI data användes för att beräkna en immunpositiva brytpunkt av 505 MFI baserat på medelvärdet plus 3 standardavvikelser i loggen MFI-värden. Dessutom var antigenkopplade pärlor läggs till specifika brunnar som behandlades som testbrunnar på alla sätt utom utspädderas saliv ersattes med PBS-1% BSA för att utvärdera bakgrundsfluorescens och korsreaktivitet. MFI värden som erhållits i dessa bakgrunds brunnar subtraheras från MFI-värden från varje antigen kopplade pärla set för varje salivprov.
Bead koppling bekräftades med hjälp av djur härrör artspecifika antikroppar primära detektions specifika för varje antigen. För att säkerställa att antigen kopplade pärlorna var i stånd att närma sig det dynamiska området för analysen definierade vi ordentlig koppling som ett MFI ≥18,000, observation av dosrespons och korsreaktivitet mellan primära antikroppar och icke-mål för <10% såsom beskrivits 2 . Representativa kopplingsbekräftelser för C. jejuni och T. gondii av antigenerna i analysen visas i Figur 1.
Baserat på brytpunkten fastställts (505 MFI), den immunoprevalence hastighetens för proven (n = 2078) varierade från ca 2% (n = 41) för T. gondii till nästan 50% (n = 1009) för norovirus GI.1 (Figur 2). Data indikerar att den immunoprevalence hastigheten var högst för de norovirus följt av hepatit A-virus och H. pylori.
Medan 32% (n = 672) av proverna var immunonegative för alla patogener i analysen, 68% (n = 1406) var immunpositiva för en eller flera patogener. Figur 3 visar fördelningen av immunopositivity till en eller flera av de patogener.
Figur 1: Kopplings bekräftelse analyser för två av organismerna i multiplex immun Koppling bekräftelse utfördes för alla antigenerna och diagram för C.. jejuni och T. gondii i denna figur är repreträdare för kopplingsbekräftelser för antigenerna i multiplex immun. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Immunoprevalence till specifika patogener Immunoprevalence till specifika patogener i multiplex immunvarierade från ca 2% för T. gondii till nästan 50% för norovirus GI.1. Antikroppar mot norovirus antigener sågs oftare följt av HAV (hepatit A-virus) och H. pylori. T. gondii och C. jejuni-antikroppar visades mindre ofta i salivprover analyseras. Klicka här för att se en större version av thär figur.
Figur 3:. Nedbrytning av immunopositivity till flera patogener samtidigt Multiplexsystem immunoanalys tillåter för analys av immunopositivity till flera patogener samtidigt i ett 50 | j, l provvolymen. Nästan en tredjedel av de salivprover analyserades var immunonegative för antikroppar mot alla antigenerna i multiplex. Ungefär var 31% av proverna immunpositiva för en antigen medan en fjärdedel var positiva till två antigener. 9,4% var immunpositiva till tre antigener. 3% var positiva till fyra eller flera antigener samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antigen | Bead Set | kopplingsbuffert | Ag koncentration (ng) | # Av pärlor i ett hörn | # Av pärlor / il | Vol. för 100 B / uL för 4 ml (^ il) |
| C. jejuni | 8 | MES 5,0 | 50 | 64 | 6400 | 94 |
| H. pylori | 33 | MES 5,0 | 25 | 71 | 7100 | 85 |
| Hepatit A | 42 | MES 5,0 | 100 | 91 | 9100 | 66 |
| T. gondii | 30 | MES 5,0 | 25 | 85 | 8500 | 71 |
| Norovirus GII.4 | 55 | MES 5,0 | 5 | 72 | 7200 | 83 |
| Norovirus GI.1 | 67 | MES 5,0 | 5 | 63 | 6300 | 95 |
| okopplad | 80 | MES 5,0 | 60 | 6000 | 100 | |
| Total volym av pärlor (pl) | 594 | |||||
| Total volym av buffert som behövs (l) | 3406 | |||||
Tabell 1:. Arbets pärla mix för multiplex immun Efter koppling och bekräftelse fördes, en huvudblandning bestående av varje pärla set framställdes som visas. Master Mix fördelades enll av brunnarna i plattan med 96 brunnar. Alla brunnarna inkuberades med saliv, med undantag för en bakgrundskontrollbrunnen, som innehöll endast pärlor och PBS-1% BSA-buffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dessa resultat indikerar att multiplex immunoassay metod är användbar för att skilja mellan salivprover som är immunpositiva eller immunonegative. För att bestämma immunopositivity var en enda brytpunkt utvecklats genom att beräkna medelvärdet plus tre standardavvikelser av log transformerade MFI svar kontroll okopplade pärlor testats med alla salivprov. Cut-off gav förmåga att bedöma exponering och immunoprevalence till antingen en enda eller flera patogener. Denna diskriminerande makt kan vara användbar i befolkningsstudier för att undersöka hälsorisker i samband med exponering för miljö och andra patogener.
Det finns flera andra metoder som kan användas för att bestämma en brytpunkt beroende på fördelningen av MFI, okopplade kontroller och vilken fråga undersökningen är utformad för att svara. Några exempel för att bestämma cut-off inkluderar ändlig blandad modellering 24-26, menar plus 3standardavvikelser för svar på kontroller, menar plus 2 standardavvikelser av svaren på kontroller och tre gånger medelvärdet av svaren på kontroller 27,28. För enkla visningar kan mindre stränga kriterier användas, men för epidemiologiska studier, kan det vara mer lämpligt att använda en strängare definition för att minska sannolikheten för att rapportera falsklarm. Vår ursprungliga ansökan är att titta på immunoconversion och immunoprevalence mellan simmare och icke-simmare. I denna studie var de okopplade kontroll MFI inte normalfördelade och resultaten logaritmerade.
Fördelar för att prestera en vulst baserad multiplex immunoassay innefattar användningen av mycket låga prowolymer, reduktion i tid och arbetskraft och möjligheten att mäta svaren för upp till 500 analyter samtidigt medan att kräva en minimal mängd reagens. Däremot traditionella metoder för att bedöma antikroppsnivåer indikerar exponering och / eller infektion (t.ex.
Begränsningar av en multiplex immun inkluderar behovet av strikt optimering för att bestämma de optimala koncentrationerna av primära avskiljning och sekundära antikroppar upptäckt, antigener och reporter. Korsreaktivitet är också ett stort problem i immun som antikroppar mot ett speciellt antigen kan korsreagera med antigener från andra organismer och därmed leda till falska positiva avläsningar. Optimering, var korsreaktivitet och ospecifik bindning behandlas tidigare 2-4. Framgången för en sådan analys är till stor del beroende av förmågan att erhålla mycket immunogena antigener liksom specifik Antibodör till dessa antigener för användning i pärla koppling och bekräftelse kopplingssteg. En annan begränsning är den begränsade tillgången på karakteriserats (diagnostiskt positiva och negativa) prover för att validera analyserna.
Det finns ett antal kritiska steg inom protokollet. Dessa inkluderar: att säkerställa de antigener som kommer att kopplas till pärlorna inte innehåller främmande proteiner, azid, glycin, Tris eller eventuella primära aminer. Om något av dessa medel finns i antigenberedningen, bör de avlägsnas genom dialys eller kromatografi. Det rekommenderas att en bör börja med 5 | j, g antigen per 5 miljoner pärlor och titrera för att hitta den optimala koncentrationen. Välja den optimala detektionsantikropp koncentration som ger den bästa känsligheten och dynamiskt område. Tänk på att signalerna tenderar att minska som koncentrationer antigen och påvisande av antikroppar ökar (krok effekt). Till exempel, om signalen minskar då koncentrationen ökar antigen sedan detekteraion-antikroppen kan vara begränsande. Omvänt, om signalerna minskar som ökar detektionsantikropp sedan reporter (SAPE) kan vara begränsande. Kontrollera multiplex för korsreaktivitet genom att kombinera den optimala kopplingen för varje protein (5000 av varje pärla set per brunn). Testa multiplexerade pärla uppsättningar genom att kombinera med den optimala detektionsantikropp belopp. Optimera reportern och göra en standardkurva av antigenet genom att testa varje antigen individuellt.
Felsökning en multiplex immunanalys för att förbättra känsligheten och öka medianfluorescenssignal är av avgörande betydelse. För att förbättra känsligheten, minska antingen mängden antigen kopplad till pärlorna eller koncentration detektionsantikropp. Användningen av en högre affinitet antikropp för infångning och / eller detektering kan också förbättra känsligheten. Ökning av mängden av antigen kopplad till pärlorna kan öka medianfluorescenssignalen. En studie visade att förinkubering serumprover med polyvinylalhol plus polyvinylpyrrolidon (PVX) buffert är i stånd att undertrycka icke-specifik bindning i serologiska analyser med användning av vulsten baserade multiplex assay 30 såsom det som vi beskriver här. Men en annan studie av våra medarbetare fann ingen signifikant effekt mellan PBS-BSA och PVX buffertar. De konstaterade vidare att på grund av högre viskositet av PVX buffert, skapade det problem med pärla förvärv i analysatorn och bildade skum i brunnarna 3.
Sammanfattningsvis har vi presenterat en metod som är i stånd att mäta närvaro av humana spott IgG-antikroppar mot flera patogener samtidigt i en mycket liten provvolym. I framtiden kommer denna analys användas för att påvisa förekomsten av spott antikroppar som är associerade med simning relaterade exponeringar eller infektioner och för att informera riskbedömningsmodeller. Dessutom kan analysen användas för att mäta antikroppar som är associerade med luftburna och livsmedelsburna exposures bestämma incident infektioner eller immunoconversions och ge kritisk immunologisk information epidemiologists bedriver frågeformulär typ populationsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
United States Environmental Protection Agency genom sitt kontor för forskning och utveckling som finansieras och förvaltas den forskning som beskrivs här. Det har utsatts för byråns administrativa granskning och godkänts för publicering. Omnämnandet av firmanamn eller kommersiella produkter utgör inte godkännande eller rekommendation för användning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori: lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni: heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Consumables | |||
| 1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µl pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1,000 µl pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4 °C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D.
- Mandel, I.
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
