Introduction
מתילציה של בסיסי ציטוזין בדנ"א (5mC) מייצגת סימן אפיגנטיים גדול נמצא הגנום חוליות הקשורות תעתיק השתקת 1. 5mC הוא שהוצג ומתוחזק על ידי methyltransferases DNA 2-5, ו הוכח ממלאי תפקידים חשובים מספר תהליכים ביולוגיים כולל החתמה גנומית, איון כרומוזום X, התמיינות, ופיתוח 3, 6. כתוצאה מכך, השיבוש 5mC דפוסי גנומי קשור במספר המחלות 7, 8-11. למרות ההתקדמות בהבנת תפקיד 5mC בפיתוח ומחלות, הוא עדיין אינו ידוע בעיקר איך זה סימן מתבצע סר בפיתוח רקמות בוגרות. מספר מנגנונים האפשריים של demethylation DNA הוצעו לאחרונה כוללים מנגנוני demethylation אקטיביים ופסיביים 12, 13, 14, 15. גילוי של תוצרי חמצון רציפי 5mC בתיווך enzym טרנסלוקציה עשר-אחת עשרes (tet1 / 2/3) כגון 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), ו -5 carboxylcytosine (5caC) ב איקריוטיים DNA 16, 17, 18, 19 הנחיה ספקולציות אם הם עשויים לשמש ביניים של תהליכים demethylation DNA או לפעול יציב סימני אפיגנטיים בזכות עצמם 13. בעוד ההפגנה כי הרכיב של תיקון כריתת בסיס, הטימין-DNA glycosylase (TDG) יכול להיקשר ולהסיר הן 5fC ו 5caC מ- DNA 19, 20 מצביעה על תפקיד עבור נגזרי 5mC השונים בתוך demethylation DNA פעיל. ראיות אחרונות מראה כי 5fC / 5caC יכול לווסת את קצב נקודות processivity RNA II למעורבות הפוטנציאל של סימנים אלה בתקנה תעתיק 29. בשל חשיבות ביולוגית הפוטנציאל הזה של טפסים חמצון של 5mC, מגוון של טכניקות המבוססות ביוכימיות נוגדן הועסק ללימוד הפצה הגנומי שלהם ותוכן העולמי 16, 19-24.
בהתחשב בכך שרוב tהוא החולייתנים איברים המורכבים של סוגי תאים שונים וכי חלוקת בסיסי ציטוזין שונה היא רקמות תאים מסוג מסוים 16-18, 20, 23, 25-27, בקביעת הפריסה המרחבית של נגזרי 5mC חמצון ברקמות שונות הופך חשובת ניסיוני משימה הכרחית חשיפת התפקודים הביולוגיים שלהם. רוב הגישות מבוססות ביוכימיות נוגדן לא מספקים שום מידע מרחבים בדבר חלוקת הצורות השונות של 5mC ברקמות שונות-סוגי תאים. לעומת זאת, טכניקות המבוססות immunochemistry יכולות לספק כלי מהיר להערכת הפריסה המרחבית ולוקליזציה גרעין של 5mC 28 והנגזרים המושחרים שלה 20. כי הוא אמר, השפע נמוך מאוד המדווח של 5fC (20 בכל 10 6 ציטוזין) ו 5caC (3 מכל 10 6 ציטוזין) בגנום העכבר 18 מהווים אתגר משמעותי עבור immunochemistry הסטנדרטי.
כאן,אנו מתארים שיטת חיסון רגישה מאוד מספקות חזק וכן איתור מהיר של טופס חמצון של ציטוזין ברקמת המוח יונק. על ידי שילוב נוגדנים משני מצומדות peroxidase יחד עם צעד הגברת אות, שיטה זו עוקפת את האתגרים של גילוי הסכומים נמוכים מאוד של 5fC ו 5caC. בנוסף, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשתף לזהות הצורות השונות של ציטוזין עם סמנים ספציפיים שושלת, המשלימה גישות אחרות ביעילות הבהרת התפקודים הביולוגיים של סימני אפיגנטיים אלה.
Protocol
כל הנהלים-מעורבים בעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה האתית של מאוניברסיטת נוטינגהם.
1. בחירת הכנת רקמות מתאימה Immunostaining
- צור סעיף מוטבע פרפין של עוברי עכברים CD1 wild-type ורקמות במוח הבוגר כפי שתואר לעיל 25. השתמש במקטעים רקמת המוח קבוע עם או 4% פורמלדהיד (FA) או 4% paraformaldehyde (PFA) עבור immunostaining השיטה 25.
הערה: שימוש סעיפי רקמות מוטבעות פרפין דורש דה-שעווה לפני תיוג נוגדן. מאז הטיפול עם 2 - 4 חומצה הידרוכלורית M (HCl) מועסקי פרוטוקול denaturing DNA אינו תואם אסטרטגיות יחזרו אנטיגן ביותר, אנו ממליצים על השימוש משני סעיפי cryo- או microtome לדו-זיהוי של נגזרי חמצון 5mC עם חלבון סמנים.
2. סעיפים רקמות Embedded Dewaxing פרפין < / P>
- בארון בטיחות ריצה בכיתה שני, לשטוף את סעיפי רקמות מוטבעות פרפין בתוך צנצנת Coplin המלאה קסילן, 2 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב RT.
הערה: חשוב להשתמש קסילן הטרי כמו הסרת פרפין שלמה יכולה להוביל דפוסי מכתים עקביים. - לאחר-שעוות דה, במהירות רעננותם סעיפי הרקמה ידי שטיפה רציפה 95, 75, ו אתנול 50% במשך 10 דקות כל אחד ב RT.
קיבוע 3. Permeabilization של Cryo- וסעיפים Microtome
- תקן את סעיפי רקמות rehydrated ידי הצבה או קרים כקרח PFA 4% או 4% FA במשך 15 דקות ב RT.
- הסר מקבע עודף על ידי שטיפה את הסעיפים PBS (חיץ מלוחים פוספט) במשך 5 דקות ב RT.
- Permeabilize בסעיפים רקמות על ידי הצבת בתוך צנצנת Coplin מלא PBX (0.5% Triton X-100 ב PBS) במשך 30 דקות ב RT. הסר PBX עודף ידי שטיפת חלקים בקרוב PBT (0.01% Tween 20 ב PBS).
- מניחים את חתכי permeabilized ב 2 N HCl למשך 60 דקות ב RT עבור depurination של ה- DNA.
הערה: למרות ריכוזים גבוהים יותר של HCl (למשל, 4 N) להוביל על denaturing DNA יעיל יותר, הם אינם תואמים עבור שיתוף זיהוי של oxi-MCS עם DAPI. - מניחים את הסעיפים 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) במשך 30 דקות ב RT לנטרל את HCl. לחלופין, לשטוף את הסעיפים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד PBS. דגירת מקטעי PBT במשך 5 דקות ב RT.
- מוציאים בזהירות את הנוזל מן האזור שסביב קטע רקמה בלי לתת קטע רקמה להתייבש לחלוטין בכל שלב על ידי רועדת את השקופית בעדינות. השתמש בעט מחסום הידרופובי להקיף את החלק בלי לגעת הסעיף.
הערה: עט מחסום הידרופובי מקטין את היקף הנוגדן נדרש להכתים את הרקמות יכול להרשות מקטעים מרובים כדי להיות מוכתמים בידולנוגדני t באותו השקופיות. - דגירה סעיפים 100 μl של פתרון לחסימת (אלבומין בסרום שור 10% ב PBS) במשך שעה 1 ב RT בתא לח.
הערה: הדילוג על שלב זה לא משפיע על יעילות עבודת מכתים בסיסי ציטוזין השונה. - דגירת סעיפי הרקמה ב 100 μl של דילול 1: 5,000 של אנטי-5hmC חד שבטי עכבר דילול 1: 1,000 של נוגדנים ראשוניים אנטי 5caC הארנב polyclonal בחסימת פתרון עבור שעה 1 ב RT בתא לח. לחלופין, לבצע את הדגירה לילה בשעה 4 ° C במידת הצורך.
הערה: ייתכן שחלקים מהעובד ללא נוגדנים ראשוניים יכולים לשמש שולטת מתאימה שלילית עבור ההליך המכתים. 12.5 ימים לפרסם חלקים במוח העוברי murine coitum המועשר 5caC, 5fC ו 5hmC 20 יכול לשמש כביקורת חיובית. - סור נוגדנים עודפים ידי שטיפת החלקים בתוך צנצנת Coplin המלאה PBT שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב Copצנצנת לין ב RT.
הערה: הגדלת נפח פתרונות כביסה יכולה להפחית מכתים רקע. - הסרת עודפי PBT, ואם יש צורך, להקיף את החלקים שוב עם עט מחסום הידרופובי כמו PBT מכילים חומר ניקוי שיכול להחליש את מחסום הידרופובי.
- הפוך דילול 1: 400 של נוגדן HRP-מצומדות נגד ארנב עיזים דילול 1: 400 של החמור אנטי עכבר נוגדנים 555 מצומדות בחסימת פתרון.
- דגירת סעיפי הרקמה ב 100 μl של תערובת נוגדנים משני משלב 4.9 עבור שעה 1 ב RT בתא לח.
- שטפו את החלקים רקמות בתוך צנצנת Coplin מלא שלוש פעמים PBT במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
- מניח את סעיפי רקמות 100 μl של דילול 1: 200 של tyramide למאגר הגברת אות tyramide עבור 2 דקות ב RT.
- מיד, להסיר פתרון tyramide עודף על ידי שטיפת שקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב PBT.
- carefully להסיר PBT עודף ומיד לכסות את החלקים עם ירידה של הרכבה בינונית (ראה חומרים רשימה).
- בעדינות להניח coverslip על סעיפי רקמות ומייד לאטום את coverslip עם לק.
- אחסן את סעיפי הרקמות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לפני בדיקה מיקרוסקופית. בדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 405, 488 ו / או 555 ננומטר (10 - 40X גדלה).
Representative Results
כדי לקבוע את חלוקת 5hmC בסעיפים רקמות המוח, ביצענו איתור שיתוף של שינוי אפיגנטיים זה עם סמן נוירונים שלאחר mitotic, NeuN, העסקת נוגדנים מסחרי אנטי 5hmC כי אינטראקציה ספציפית עם סימן זה, אך לא עם צורות אחרות של שינוי ציטוזין 20, 25. ניתוח immunohistochemical של הפצות 5hmC ו 5caC במוח הבוגר גילה כי בעוד 5hmC מכתים בולט שיתוף לוקליזציה עם תאים חיוביים NeuN, ותאי גלייה NeuN שלילי להחזיק רמות נמוכות יותר של גנומית 5hmC (איור 1) 20.
הראינו לאחרונה כי ט תלוי חמצון 5mC הוא פעיל במהלך מפרט שושלת של תאי גזע עצביים (NSCs) 20. למרות היותו בלתי מורגש immunochemically ב NSCs, 5fC ו 5caC להפגין immunostaining בולט בשלבים מוקדמים של בידול NSCs לקראת עצבי nd שושלות גליה. שני סימנים אלה זמניים לצבור במקביל מראה של הסמנים של עצבי מוקדם והבחנת גליה 20. כדי לקבוע את חלוקת 5caC להבדיל NSCs בצענו מכתים שיתוף של הסימן הזה עם GFAP סמן גליה על התרבויות הקבועות של NSCs ב 3 ימים של אינדוקציה של בידול גליה. בניגוד NSCs או האסטרוציטים בוגרים (מידע לא מוצג), צפינו אות 5caC חזקה שיעור גבוה היחסי של תאי מבטאי GFAP בתרבויות אלה (איור 2) 20.
איור 1. Co-immunostaining של 5hmC (ירוק) עם NeuN (אדום) ברקמות למבוגרים המוח counterstained עם DAPI (כחול). ערוצי הפרט ואת תצוגה ממוזגת מוצגים. ברי סולם הם 25 מיקרומטר.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Co-immunostaining של 5caC עם GFAP בתרבות של המל"ל ב יום 3 של גליה בידול. ערוצי פרט ואת התצוגה הממוזגת מוצגים. ברי סולם הם 20 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
למרות השפע הנמוך דיווח נגזר חמצון 5mC, 5fC ו 5caC ברקמות כמה יציג מגבלות משמעותיות עבור פרוטוקול immunochemistry רגיל, השילוב של נוגדנים משני מצומדות peroxidase אפשר זיהוי של שינויי ציטוזין אלה ברקמות קבועות ותאים (איור 2) . עם זאת, זמן הדגירה האופטימלי עם פתרון tyramide צריך להיות מותאם באופן ניסיוני עבור כל אצווה פרט של tyramide ערכת הגברת אות שבו קשר ליניארי בין עוצמת אות ומשך הגברת אות מבוססת tyramide הוא ציין, לפרטי רא אלמיידה et al. 2012 26 . בנוסף, יחס אות / רקע ניתן לשפר באופן משמעותי על ידי ביצוע השוטף בצנצנת Coplin כדי לאפשר הסרה יעילה של נוגדנים עודפים. לאחר דגירה עם פתרון tyramide, חשוב מיד כדי לעצור את התגובה על ידי שטיפה בתמיסת PBT דמכתים רקע ecrease. זה קריטי לא לאפשר סעיפים לייבש בכל נקודה במהלך ההליך.
היעילות של depurination DNA ניתן לשפר על ידי ביצוע התגובה depurination על 37 מעלות צלזיוס. בעת שימוש 4 N HCl במקום 2 N משפר מכתים הצורות השונות של 5mC באמצעות 4 N HCl עבור depurination DNA לא ירשתי מכתים שיתוף עם DAPI, כפי שהוא מקיים אינטראקציה בלעדי עם DNA גדילים כפול.
למרות טכניקה זו יכולה לספק הערכה וכמותיות חזקה של צורות השונות של בסיסי ציטוזין שם לזיהוי, זה לא יכול לשמש לצורך הערכת הרמות המוחלטות של 5mC או נגזר החמצון שלה. לכן, אנו ממליצים על שימוש משלימים אחרים אבל כמותית מתקרב 16, 19 -24. מאז גילויו של נגזרי חמצון 5mC הגנומים יונקים, מספר גישות פותחו ללמוד התפקידים הביולוגיים שלהם 16, 19-24. אמנם אלה approaצ 'ס יכול להיות בעל ערך בקביעת הרמות המוחלטות של נגזרי חמצון 5mC, הם אינם מספקים מידע לגבי הפריסה המרחבית שלהם 20, 26. יש לנו בהצלחה השתמשו בשיטה המתוארת כאן כדי למפות את ההתפלגות ולוקליזציה המרחבי של נגזרי חמצון 5mC בסוגי תאים שונים של המוח המתפתח ומבוגר 20
מדגים הפריסה המרחבית שלהם 20, טכניקה זו יכולה להיות מכרעת להבנת השלכות הביולוגיות ועל הגורל נגזר חמצון של 5mC בהקשרים ביולוגיים שונים בם נגזרים שונים אלה של 5mC ניתן לאתר כולל בידול, פיתוח ומחלות הסלולר. בנוסף, השיטה אנו מתארים כאן יכולה לתת הערכות כמותית למחצה של נגזרי החמצון של 5mC ברקמות שונות על ידי בחינה של קינטיקה של תגובת peroxidase (אשר עומדת ביחס לעוצמת המכתים) בזמני דגירה שונים עם tyramiדה 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
