Introduction
Metylering av cytosin baser i DNA (5mC) representerer en stor epigenetisk merke finnes i virveldyr genomer forbundet med transkripsjonen tie 1. 5mC blir innført og vedlikeholdt av DNA metyltransferaser 2-5, og har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke biologiske prosesser inkludert genomisk preging, X-kromosom inaktivering, cellulær differensiering og utvikling 3, 6. Følgelig avbrudd av 5mC genomiske mønstre er forbundet med en rekke sykdommer 7, 8-11. Til tross for fremgang i forståelsen 5mC rolle i utvikling og sykdom, er det fortsatt i stor grad ukjent hvordan dette merket blir fjernet i utvikling og voksne vev. Flere mulige mekanismer for DNA-demetylering har nylig blitt foreslått, inkludert aktive og passive demetylering mekanismer 12, 13, 14, 15. Oppdagelsen av produktene av 5mC sekvensiell oksydasjon mediert av 10-11 trans enzymes (tet1 / 2/3), slik som 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), og 5-carboxylcytosine (5caC) i eukaryotisk DNA 16, 17, 18, 19 bedt spekulasjoner om de kan tjene som mellomprodukter ifølge DNA demetylering prosesser eller fungere som stabile epigenetiske merker i sin egen rett 13. Mens demonstrasjonen at komponenten base excision reparasjon, kan tymin-DNA glykosylase (TDG) binde og fjerne både 5FC og 5caC fra DNA 19, 20 antyder en rolle for de modifiserte 5mC derivater i et aktivt DNA demetylering. Nyere bevis som viser at 5FC / 5caC kan modulere frekvensen av RNA II processivity poeng til potensiell involvering av disse merkene i transkripsjonsregulering 29. På grunn av dette potensialet biologiske betydningen av oksiderte former for 5mC, har en rekke biokjemiske og antistoffbaserte teknikker vært ansatt for å studere deres genomisk distribusjon og globalt innhold 16, 19-24.
Gitt at det meste av than vertebrate organer bestå av forskjellige celletyper, og at fordelingen av modifiserte cytosin-baser er vev og celletype-spesifikk 16-18, 20, 23, 25-27, bestemme den romlige fordelingen av oksyderte 5mC derivater i forskjellige vev blir en viktig eksperimentell oppgave nødvendig for avsløring sine biologiske funksjoner. De fleste av de biokjemiske og antistoffbaserte tilnærminger gir ikke noen romlig informasjon angående fordelingen av de modifiserte former av 5mC i forskjellige vev og celletyper. I motsetning til dette, kan immunbaserte teknikker gir en hurtig verktøy for å vurdere den romlige fordelingen og nukleær lokalisering av 5mC 28 og sin oksyderte derivater 20. Det er sagt, rapporterte svært lav overflod av 5FC (20 i hver 10 6 cytosin) og 5caC (3 i hver 10 6 cytosin) i musegenomet 18 representerer en betydelig utfordring for standard immunkjemi.
Her,vi beskrive en svært følsom immunokjemisk metode som gir robust og en rask påvisning av oksidert form av cytosin i pattedyrs hjernevev. Ved å innlemme konjugert sekundære antistoffer kombinert med en signalforsterkning skritt, omgår denne metoden utfordringene i å detektere svært lave mengder 5FC og 5caC. I tillegg kan denne teknikken brukes til å co-oppdage de modifiserte former av cytosin med avstamning spesifikke markører, effektivt utfyller andre tilnærminger i å belyse de biologiske funksjonene til disse epigenetiske merker.
Protocol
Alle dyre involvert prosedyrer ble utført i samsvar med Universitetet i Nottingham etiske vurdering bord.
1. Velge Passer Tissue Forberedelse til Farging
- Generer parafin-embedded delen av villtype CD1 museembryoer og voksne hjernen vev som beskrevet tidligere 25. Bruk hjernen vevssnitt fast med enten 4% formaldehyd (FA) eller 4% Paraformaldehyde (PFA) for farging metode 25.
MERK: Bruk av parafin vevssnitt krever de-voksing før antistoff merking. Siden behandlingen med 2-4 M saltsyre (HCl) ansatt i protokollen for DNA denaturering er ikke kompatibel med de fleste antigen henting strategier, anbefaler vi bruk av enten cryo- eller mikrotom seksjoner for co-deteksjon av 5mC oksidasjons derivater med protein markører.
2. dewaxing Parafin vevssnitt < / P>
- I en løpe klasse II sikkerhetskabinett, vaske parafin vevssnitt i en Coplin krukke fylt med xylen, 2 ganger i 10 minutter hver ved RT.
MERK: Det er viktig å bruke fersk xylen som ufullstendig parafin fjerning kan føre til inkonsistente fargemønstre. - Etter de-voksing, hurtig rehydrere vevssnittene ved vasking etter hverandre i 95, 75, og 50% etanol i 10 minutter hver ved RT.
3. Fiksering og Permeabilization av Cryo- og mikrotom Seksjoner
- Fest rehydratiserte vevssnittene ved å plassere dem i enten iskald 4% PFA eller 4% FA i 15 minutter ved RT.
- Fjerne overskytende bindemiddel ved vasking av delene i PBS (fosfatbuffersaltløsning) i 5 min ved RT.
- Permeabilize vevssnittene ved å plassere i en Coplin krukke fylt med PBX (0,5% Triton X-100 i PBS) i 30 minutter ved RT. Fjern overskudd av PBX ved vasking av seksjonene kort tid i PBT (0,01% Tween 20 i PBS).
- Plasser permeabiliserte-partiene i 2 N HCl i 60 minutter ved RT for depurinering av DNA.
MERK: Selv om høyere konsentrasjoner av HCl (f.eks 4 N) føre til en mer effektiv DNA denaturering, de er ikke kompatible for co-deteksjon av oxi-MC med DAPI. - Plassere delene i 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) i 30 minutter ved RT for å nøytralisere HCl. Alternativt kan vaske seksjonene tre ganger i 5 minutter hver i PBS. Inkuber delene i PBT i 5 min ved RT.
- Fjern forsiktig væske fra området rundt vev delen uten at vevet delen tørke helt på alle trinn ved forsiktig risting raset. Bruk en hydrofob barriere penn til å omringe den delen uten å berøre delen.
MERK: Den hydrofobe barriere penn reduserer volumet av antistoff nødvendig å farge vevet og kan tillate flere seksjoner for å være farget med different antistoffer på samme lysbilde. - Inkuber seksjoner i 100 ul blokkeringsløsning (10% bovint serumalbumin i PBS) i 1 time ved romtemperatur i et fuktig kammer.
MERK: Å hoppe over dette trinnet vil ikke påvirke effektiviteten av flekker de modifiserte cytosin baser. - Inkuber vevssnittene i 100 ul av en 1: 5000-fortynning av muse-monoklonalt anti-5hmC og en 1: 1000 fortynning av kanin-polyklonalt anti-5caC primære antistoffer i blokkeringsløsning i 1 time ved romtemperatur i et fuktig kammer. Alternativt kan utføre inkubering over natten ved 4 ° C hvis det er nødvendig.
MERK: Profiler behandlet uten primære antistoffer kan tjene som egnede negative kontroller for farging prosedyren. De 12,5 dager etter samleie muse-embryonale hjerneseksjoner anriket på 5caC, 5FC og 5hmC 20 kan bli brukt som positiv kontroll. - Fjern overflødig antistoffer ved å vaske delene i en Coplin krukke fylt med PBT tre ganger for 5 min hver i en Coplin krukke ved RT.
MERK: Øke volumet av vaskeløsninger kan redusere bakgrunnsfarging. - Fjern overskudd av PBT og, om nødvendig, omslutter seksjonene igjen med det hydrofobe barriere pennen som PBT inneholde vaskemiddel som kan svekke den hydrofobe barriere.
- Lage en 1: 400 fortynning av geite-anti-kanin HRP-konjugert antistoff og en 1: 400 fortynning av esel anti-muse-555-konjugert antistoff i blokkeringsløsning.
- Inkuber vevssnittene i 100 ul av sekundært antistoff blandingen fra trinn 4,9 i 1 time ved romtemperatur i et fuktig kammer.
- Vask vevssnittene i en Coplin krukke fylt med PBT tre ganger i 5 minutter hver ved RT.
- Plasser vevssnittene i 100 ul av en 1: 200 fortynning av tyramide i tyramide signal forsterkning buffer i 2 minutter ved RT.
- Umiddelbart, fjerne overflødig tyramide løsning ved å vaske skinnene tre ganger for 5 min hver i PBT.
- forsiktigy fjerne overflødig PBT og umiddelbart dekke deler med et fall på en Mounting Medium (se Materials List).
- Stikk forsiktig en dekkglass på vevssnitt og umiddelbart forsegle dekkglass med neglelakk.
- Oppbevar vevssnitt ved 4 ° C i flere timer før mikroskopisk undersøkelse. Undersøke under et fluorescerende mikroskop ved 405, 488 og / eller 555 nm (10 - 40 ganger forstørrelse).
Representative Results
For å bestemme fordelingen av 5hmC i hjernen vevssnitt, utførte vi co-deteksjon av denne epigenetisk modifikasjon med en markør for post-mitotiske nevroner, Neun, ansette kommersiell anti-5hmC antistoff som spesifikt samhandler med dette merket, men ikke med andre former for endret cytosin 20, 25. Immunhistokjemisk analyse av 5hmC og 5caC distribusjoner i den voksne hjernen viste at mens den fremstående 5hmC farging ko-lokaliserer med Neun-positive celler, Neun-negative gliaceller har lavere nivåer av genomisk 5hmC (figur 1): 20.
Vi har nylig viste at Tet-avhengig 5mC oksidasjon er operativ i løpet av avstamning spesifikasjon av nevrale stamceller (NSC) 20. Til tross for at immunokjemisk umulig å oppdage i NSC, 5FC og 5caC vise fremtredende farging på tidlige stadier av NSCs differensiering mot neuronal en nd glia linjene. Begge disse merkene forbigående samle samtidig med utseendet på markører for tidlig neuronal og glial differensiering 20. For å bestemme fordelingen av 5caC i differensiere NSC vi utførte co-farging av dette merket med en glial markør GFAP på de faste kulturer av NSCs på 3 dager med induksjon av glial differensiering. I motsetning til i NSCs eller modne astrocytter (data ikke vist), ble det observert sterk 5caC signal på forholdsvis stor andel av cellene som uttrykker GFAP i disse kulturene (figur 2) 20.
Figur 1. Co-farging av 5hmC (grønn) med Neun (rød) i den voksne hjernen Tissue kontra med DAPI (blå). Individuelle kanaler og det fusjonerte visningen vises. Skala barer er 25 mikrometer.blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Co-farging av 5caC med GFAP i Culture of NSC på dag 3 av Glial Differensiering. Individuelle kanaler og det fusjonerte visningen vises. Skala barer er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Selv om den rapporterte lave overflod av 5mC oksidasjons derivater, 5FC og 5caC i noen vev ville gi betydelige begrensninger for en standard immunkjemi protokoll, inkorporering av peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer tillot påvisning av disse cytosin modifikasjoner i faste vev og celler (Figur 2) . Imidlertid bør den optimale inkubasjonstiden med tyramide oppløsning optimaliseres eksperimentelt for hver enkelt gruppe av tyramide signalforsterkning sett hvor et lineært forhold mellom signalintensitet og varighet av tyramide basert signalforsterkning observeres, for detaljer, se Almeida et al. 2012 26 . I tillegg kan det signal / bakgrunnsforholdet bli betydelig forbedret ved å utføre de vaskinger i en Coplin krukke for å tillate effektiv fjernelse av overskytende antistoffer. Etter inkubering med tyramide løsning, er det viktig å umiddelbart stoppe reaksjonen ved å vaske i PBT oppløsning til decrease bakgrunnsfarging. Det er viktig ikke å la delene tørke ut på noe tidspunkt under prosedyren.
Effektiviteten av DNA depurinering kan forbedres ved å utføre depurinering reaksjonen ved 37 ° C. Mens ved anvendelse av 4 N HCI i stedet for 2-N forbedrer fargingen av de modifiserte former av 5mC ved hjelp av 4 N HCI for DNA depurinering ville ikke tillate samtidig farging med DAPI, som det samhandler utelukkende med dobbelt-trådet DNA.
Selv om denne teknikk kan gi robuste semi-kvantitativ vurdering av de modifiserte former av cytosin-baser hvor detekterbart, kan den ikke brukes til å evaluere de absolutte nivåene av 5mC eller dets oksidasjons derivater. Derfor anbefaler vi bruk av andre komplementære, men kvantitative tilnærminger 16, 19 -24. Siden oppdagelsen av 5mC oksidasjons derivater i pattedyr genomer, har flere metoder blitt utviklet for å studere deres biologiske roller 16, 19-24. Selv om disse approaches kan være verdifulle i å bestemme de absolutte nivåene av 5mC oksidasjon derivater, har de ikke gi informasjon om deres romlige fordelingen 20, 26. Vi har med hell brukt metoden beskrevet her for å kartlegge den romlige fordeling og lokalisering av 5mC oksidasjons derivater i ulike celletyper av utvikling og voksne hjernen 20
Ved å avdekke deres romlige fordeling 20, kan denne teknikken være avgjørende for forståelsen av de biologiske virkningene og skjebnen av oksyderte derivater av 5mC i forskjellige biologiske sammenhenger hvor disse modifiserte derivater av 5mC kan påvises inkludert cellulær differensiering, utvikling og sykdom. I tillegg kan fremgangsmåten beskrives her gi semi-kvantitative vurderinger av de oksyderte derivater av 5mC i forskjellige vev ved å bestemme kinetikken til peroksidase reaksjon (som er proporsjonal med fargeintensitet) på forskjellige inkubasjonstider med tyramide 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
