Abstract
microfluidic जांच (एमएफपी) तरल पदार्थ के nanoliter मात्रा सीमित द्वारा जैविक substrates पर स्थानीय रसायन शास्त्र के प्रदर्शन की सुविधा। एमएफपी, श्रेणीबद्ध hydrodynamic प्रवाह कारावास (hHFC) की एक विशेष कार्यान्वयन का प्रयोग, कई तरल पदार्थ एक साथ एक सब्सट्रेट के साथ संपर्क में लाया जाता है। स्थानीय रासायनिक क्रिया और तरल आकार देने hHFC का उपयोग कर, स्थानीय स्तर पर lysing और कोशिकाओं को हटाने के द्वारा सेल पैटर्न बनाने के लिए शोषण किया जाता है। एमएफपी की स्कैनिंग की क्षमता का उपयोग करके, सेल monolayers के उपयोगकर्ता परिभाषित पैटर्न बनाया जाता है। इस प्रोटोकॉल तेजी से, वास्तविक समय और स्थानिक नियंत्रित सेल patterning, जो चयनात्मक सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकते सक्षम बनाता है।
Introduction
उनके पैतृक वातावरण में, जैविक ऊतकों में कोशिकाओं को उनके विकास, संगठन, और विकास के निर्देशन जैव रासायनिक और शारीरिक संकेतों की एक सीमा मानता है। इन संकेतों को समझना सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत के चुनिंदा जांच की आवश्यकता है। इस patterning सेल monolayers के लिए तरीकों का विकास जरूरी है। तरीके संस्कृति (patterning) में ज्यामितीय अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं को कोशिका जीव विज्ञान में भौतिक और रासायनिक संकेतों के व्यापक पढ़ाई के लिए सक्षम है। Patterning सेल परतों के लिए मौजूदा तरीकों में से अधिकांश 1 - 4 सतहों पर सेल आसंजन प्रोटीन जमा करने या substrates पर चयनात्मक विकास के लिए microfabricated स्टेंसिल के प्रयोग पर निर्भर करते हैं। इसके विपरीत, यहाँ हम एक विधि के लिए तेजी से बगल में पैटर्न सेल monolayers, यानी, कोशिकाओं संस्कृति में मौजूद है, monolayer के चयनित क्षेत्रों में कोशिकाओं को हटाने के द्वारा। तरीके कि प्रदर्शन ऐसी subtractive patterning 5 - 9 usually एक लेजर का उपयोग कर, अनजाने में जीवित कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए विशेष substrates, सतह के उपचार, जटिल ऑपरेशन, शारीरिक संपर्क या पृथक आवश्यकता होती है। हम यहाँ एक microfluidic जांच (एमएफपी) 10,11, एक गैर संपर्क स्कैनिंग microfluidic प्रौद्योगिकी है कि hydrodynamically एक सब्सट्रेट पर एक तरल किनारा का उपयोग करें। एमएफपी का एक महत्वपूर्ण घटक (चित्रा 1) microfabricated सिर microchannels युक्त है। जुड़े मंच नियंत्रण और दृश्य और प्रतिक्रिया (चित्रा 2) के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप स्कैनिंग के लिए तरल नियंत्रण के लिए सिरिंज पंप, चरणों के होते हैं। अपनी बुनियादी विन्यास में, एमएफपी सिर एक प्रसंस्करण तरल और कुछ विसर्जन तरल (चित्रा 3) के साथ मिलकर इंजेक्शन प्रसंस्करण तरल aspirating के लिए अन्य इंजेक्शन लगाने के लिए शीर्ष पर छिद्र के साथ दो microchannels, एक शामिल हैं। एमएफपी आपरेशन के दौरान, सुप्रीम सब्सट्रेट से एक निश्चित दूरी पर है। जब आकांक्षा प्रवाह की दर (क्यूए) sufficie हैइंजेक्शन प्रवाह की दर (क्यू i), यानी की तुलना में अधिक है ntly, क्यू एक: क्यू मैं ≥ 2.5, प्रसंस्करण तरल सब्सट्रेट पर ही सीमित है। यह एक hydrodynamic प्रवाह कारावास (एचएफसी) में यह परिणाम है। जो इस क्षेत्र में प्रसंस्करण तरल सब्सट्रेट के साथ सीधे संपर्क में है पदचिह्न करार दिया है। (≈ 10 -2 आरई) ठेठ परिचालन की स्थिति के लिए, एचएफसी के भीतर प्रसंस्करण तरल के प्रवाह को एक कम रेनॉल्ड्स संख्या के द्वारा होती है और एक उच्च पेक्लेट संख्या (पे ≈ 10 2)। यह संवहन रासायनिक प्रजातियों के बड़े पैमाने पर स्थानांतरण के प्राथमिक मोड होने के साथ लामिना शासन में तरल प्रवाह निकलता है। प्रवाह प्रसूति के लिए संख्यात्मक और विश्लेषणात्मक मॉडल कहीं वर्णित 12 - 14।
इस पत्र में, हम कई प्रसंस्करण तरल पदार्थ एक साथ सीमित के दृष्टिकोण है, जो कहा जाता है श्रेणीबद्ध एचएफसी (hHFC) 14 का उपयोग करें। एमएफपी साथ hHFC को लागू करने के लिए, दो additionaएल छिद्र इंजेक्शन और आकांक्षा के एक माध्यमिक स्रोत प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं। यह एक दूसरे तरल भीतर एक तरल सीमित करने के लिए सक्षम बनाता है। भीतर से (प्रोसेसिंग) तरल लाभ बाहरी (परिरक्षण) तरल द्वारा सब्सट्रेट पर आवारा मलबे से परिरक्षित जा रहा है। इसके अलावा, hHFC दो मोड में संचालन की अनुमति देता: (i) नेस्ट मोड, जिसमें आंतरिक एचएफसी संपर्क सतह (चित्रा 3 बी), और (ii) pinched मोड, जिसमें आंतरिक तरल खो देता में प्रसंस्करण तरल संपर्क और केवल बाहरी तरल सब्सट्रेट (चित्रा 3 सी) के साथ संपर्क में है। दो मोड के बीच स्विच उपयोगकर्ताओं के प्रभाव या सब्सट्रेट प्रसंस्करण को रोकने के लिए अनुमति देता है और सिर से सतह की खाई को नियंत्रित करने से या इंजेक्शन के प्रवाह के बीच अनुपात (क्यू I2 / क्यू i1) को बदलने के द्वारा हासिल की है। दिए गए चैनल ज्यामिति के लिए, सब्सट्रेट पर प्रसंस्करण तरल के प्रवाह की स्थिति पदचिह्न (चित्रा 3 डी) नियमन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सोडियम hydrऑक्साइड (NaOH) कोशिकाओं lyse करने के भीतरी प्रसंस्करण तरल के रूप में प्रयोग किया जाता है, और lysate लगातार सतह से aspirated है। क्योंकि प्रसंस्करण तरल पदार्थ की रासायनिक प्रभाव भीतरी एचएफसी पदचिह्न के लिए स्थानीय कर रहे हैं, सन्निकट कक्षों, बेफिक्र रहते हैं जो सेल सेल बातचीत के spatiotemporal के अध्ययन की अनुमति देता है। एमएफपी की स्कैनिंग कार्यक्षमता सेल पैटर्न के उपयोगकर्ता परिभाषित geometries (चित्रा 4) के निर्माण की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रसंस्करण तरल रूप में NaOH के चुनाव को नीचे की ओर डीएनए विश्लेषण (चित्रा 7) रह सकते हैं।
Protocol
1. एमएफपी सिर और प्लेटफार्म सफाई और तैयारी
नोट: इस प्रोटोकॉल खड़ी उन्मुख सिलिकॉन कांच संकर एमएफपी के प्रमुख 15,16 उपयोग करता है। सिर की सिलिकॉन घटक microchannels है, जो 100 मीटर की गहराई तक etched हैं शामिल हैं। नक्काशी सिलिकॉन anodic संबंध का उपयोग कर गिलास को बंधुआ है। चैनल डिजाइन विसर्जन तरल (चित्रा 1) इंजेक्शन लगाने के लिए छह चैनलों, इंजेक्शन और आकांक्षा के लिए दो-दो, और दो से मिलकर एक पैटर्न शामिल हैं। विसर्जन तरल इंजेक्शन लगाने के लिए इस्तेमाल किया चैनलों मीडिया जैविक नमूने आसपास है, इस प्रकार आकांक्षा और वाष्पीकरण की वजह से नुकसान से बचने की भरपाई होगी। भीतरी और बाहरी चैनलों वर्तमान काम में इस्तेमाल किया चैनलों 100 × 100 माइक्रोन और 200 × 100 माइक्रोन क्रमशः रहे हैं। पोस्ट निर्माण और प्रसंस्करण, स्पष्ट चैनलों और पॉलिश apexes साथ एमएफपी सिर प्राप्त कर रहे हैं।
- पम्पिंग स्टेशन की तैयारी और तरल पदार्थ से निपटनेउपकरण
- एक 1/16 '' (1.59 मिमी) बाहरी व्यास और 0.02 '' (0.51 मिमी) भीतरी व्यास सीरिंज से जुड़े सभी tubings के लिए साथ केशिकाओं का प्रयोग करें। आवेदन के आधार पर केशिका आकार भिन्न और उचित कनेक्टर्स और फिटिंग प्राप्त सीरिंज के साथ एमएफपी सिर इंटरफेस करने के लिए। ultrapure पानी का प्रयोग करें जहाँ भी dilutions जरूरी हैं।
- स्वच्छ सीरिंज (250 - 500 μl मात्रा) ultrapure पानी से पहले वाली में 0.5% ब्लीच समाधान में sonication द्वारा और सिरिंज plungers और जीवित कोशिका के प्रयोगों के बाद। उन्हें पानी से अच्छी तरह कुल्ला। उनके सुझावों एक नहाने के पानी में पूरी तरह से डुबो और सवार का उपयोग कर श्वास द्वारा उन्हें पानी के साथ भरें। जबकि सिरिंज शाफ्ट सिरिंज के बाहर निकलने पर मुहर संपर्क करने के साथ नहाने के पानी के भीतर तरल पर्ज। दोहराएँ महाप्राण और शुद्ध कोई हवाई बुलबुले जब तक सिरिंज कॉलम में देखा जाता है।
- Luer ताला कनेक्टर्स का उपयोग सिरिंज पंप से भरा सीरिंज कनेक्ट करें। एक स्विच वाल्व पर घुड़सवार का प्रयोग करेंपंप दो केशिकाओं या तो एमएफपी सिर (चित्रा 6) करने के लिए या तरल जलाशयों के लिए अग्रणी में से एक के लिए सिरिंज से तरल प्रत्यक्ष। (यदि कोई स्विच वाल्व उपलब्ध है धारा 1.4.4 देखें)। जब तक पानी के बारे में 10 μl सीरिंज में छोड़ दिया है 50 μl / मिनट, सिरिंज के आकार पर निर्भर करता है - 10 के बारे में एक प्रवाह दर पर सीरिंज से पानी के साथ दोनों केशिकाओं पर्ज।
- (- सामग्री देख जैसे, एम 1 कनेक्टर) एक उपयुक्त microfluidic कनेक्टर / एडाप्टर जो सिर में चैनल विअस के साथ इंटरफेस में पर्ज केशिकाओं पूर्व डालें।
- एमएफपी सिर तैयारी
- साफ मानक सफाई या कड़े सफाई के लिए 0.5% ब्लीच के लिए कांच के बने पदार्थ डिटर्जेंट का उपयोग कर sonication द्वारा एमएफपी सिर, 5 मिनट के लिए। पानी में डुबो सर्वोच्च और विअस के लिए वैक्यूम लगाने से पानी के साथ चैनलों पर्ज।
- संभावित अवरोधों (clogging) और पुनः के लिए एक stereomicroscope के तहत चैनलों का निरीक्षणपिछले चरण यदि आवश्यक हो तो पीट।
- सिर धारक पर साफ सिर माउंट और सिर पर पूर्व डाला जाता है और पर्ज टयूबिंग के साथ कनेक्टर पेंच। जेड-मंच है, जो सिर और सेल monolayer के बीच की खाई दूरी के नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है करने के लिए सिर धारक भाड़ में।
- एमएफपी मंच की स्कैनिंग चरणों औजार
- एक्स, वाई और जेड-चरणों के समापन बिंदु अंशांकन एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर इंटरफेस के साथ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, मंच करने के लिए सिर को जोड़ने से पहले प्रदर्शन करना। कैलिब्रेटेड चरणों स्थिति एमएफपी सिर में सटीकता सुनिश्चित करने।
- एक कच्चे शून्य के अंतर दूरी (zeroing) कोशिकाओं के बिना एक कक्ष स्लाइड पर एमएफपी सिर लाकर प्राप्त करें और धीरे-धीरे 5 माइक्रोन चरणों में उतर। सब्सट्रेट के साथ जांच के संपर्क करने पर, न्यूटन के छल्ले मनाया जाना चाहिए। यह एक मोटे अनुमान है। एक सटीक स्थिति substrat जांच एपेक्स के coplanarity समायोजित करने के बाद प्राप्त किया जा रहा हैई।
- जांच एपेक्स के coplanarity सुनिश्चित करने के लिए, (सिर के इंटरफेस में और जेड चरण) एक गोनियोमीटर का उपयोग कर सिर के झुकाव को समायोजित। जब गठन सुनिश्चित करना है कि न्यूटन के छल्ले सममित (चित्रा 1) कर रहे हैं। एमएफपी सिर 20 माइक्रोन सब्सट्रेट से दूर जाने और गोनियोमीटर का उपयोग कर झुकाव को समायोजित। दोहराएँ उतरना, zeroing और न्यूटन के छल्ले तक झुकाव समायोजन संपर्क पर सममित हैं। झुकाव समायोजित के साथ, Z स्थिति है जो शून्य के रूप में सममित न्यूटन के छल्ले का उत्पादन निर्धारित किया है।
नोट: जेड चरण नियंत्रित सिर से सब्सट्रेट दूरी, XY मंच सब्सट्रेट की स्कैनिंग (चित्रा 2) को नियंत्रित करता है, जबकि। एक विस्तृत विवरण हमारे पहले काम 14 में पाया जा सकता है।
- सेल परतों के स्थानीय हटाने के लिए केमिकल की तैयारी
सावधानी: जहां उपयुक्त हो, उपयोग सुरक्षा उपकरणों (जैसे, nitrile दस्ताने, सुरक्षा चश्मा) रसायनों के लिए तैयार किया जा रहा। एक धूआं हू का प्रयोग करेंडी यदि समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक है। मंदक के रूप में ultrapure पानी के साथ सभी रसायनों और buffers तैयार करें।- आंतरिक इंजेक्शन चैनल (चित्रा 1 में प्रवाह क्यू I2 साथ I2) के लिए प्रसंस्करण तरल के रूप में 50 मिमी NaOH समाधान तैयार है।
- निष्कर्षण बफर समाधान बाहरी इंजेक्शन (चित्रा 1 में प्रवाह क्यू I1 साथ i1) के लिए आवश्यक, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 0.5% बीच 20 से बना तैयार है, और 10 माइक्रोन 50 मिमी Tris (hydroxymethyl) पर aminomethane में rhodamine बी पीएच 8. मिटाने के लिए, आकांक्षा सीरिंज में पानी का उपयोग करें।
- एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर सभी समाधान फ़िल्टर। देगास सभी फ़िल्टर समाधान जब तक भंग हवा को रोकने की सतह के लिए बुदबुदाती एक desiccator का उपयोग कर।
- नाली सिरिंज पंप से जुड़ा लाइन का उपयोग करना, बचे हुए पानी को शुद्ध और 40 μl / मिनट पर इंजेक्शन सीरिंज में degassed समाधान निकालना जब तक सीरिंज पूर्ण (250 या 500 μl) कर रहे हैं।इस सीरिंज, कनेक्टर्स, और केशिकाओं का बुलबुला मुक्त भरने सुनिश्चित करता है। सिरिंज स्विच वाल्व-दो-केशिका प्रणाली सीरिंज मध्य प्रयोग के भरने की अनुमति देता है। इस तरह के एक स्विच वाल्व के अभाव में, सिर से केशिकाओं काटना और उन्हें सिर को reconnecting से पहले degassed समाधान aspirating द्वारा केशिकाओं और सिरिंज भरने के लिए।
- प्रसंस्करण Aspirating और केशिकाओं के माध्यम से तरल पदार्थ परिरक्षण आपरेशन के दौरान छोटे संस्करणों के उपयोग के लिए अनुमति देता है। रसायन बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है, तो आवश्यक समाधान के साथ सीधे सीरिंज भरें। उदाहरण के लिए, आकांक्षा सीरिंज कि पानी रोकने के इस दृष्टिकोण का उपयोग कर भरा जा सकता है।
- तरल पदार्थ के रूप में प्रत्येक चैनल 1.4.1 और 1.4.2 में परिभाषित के लिए आवंटित साथ एमएफपी सिर पर केशिकाओं पर्ज।
नोट: निष्कर्षण बफर समाधान भीतरी कारावास और बफर में rhodamine घटक में NaOH ढाल वीं के दृश्य की सुविधाआपरेशन के दौरान ई hHFC। - कोशिकाओं, अधिक मिला हुआ हैं सेल समुच्चय सुसंस्कृत सतह पर प्रदर्शित होने के साथ हैं, तो 10% proteinase लालकृष्ण साथ निकासी बफर यह विकृत प्रोटीन भंग के रूप में lysate आकांक्षा चैनलों में प्रवेश करती है के द्वारा इन समुच्चय पर NaOH की कार्रवाई की खुराक पूरक। इस कार्रवाई के दौरान चैनलों के clogging रोकता है।
- चैम्बर स्लाइड पर सेल monolayers की तैयारी
सावधानी: संवर्धन कोशिकाओं के लिए एक सेल संस्कृति हुड का प्रयोग करें और प्रयोगशाला की जैव सुरक्षा अधिकारी द्वारा निर्धारित नियमों के अनुसार उपकरण संभाल। विशेष सेल लाइनों की विशेष आवश्यकताओं को ध्यान दें और तदनुसार प्रोटोकॉल और उपकरणों के लिए अनुकूलित।- उपयोग सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों (5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर) संस्कृति और कोशिकाओं के विस्तार के लिए नमूनों किया जाना। टी बोतल में मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल 17,18 का उपयोग कर विस्तार प्रदर्शन करना। विशेष सेल की आवश्यकताओं के अनुसार संवर्धन मीडिया का प्रयोग करेंएल लाइन (जैसे, सीरम और एंटीबायोटिक MCF7 और MDAMB 231 संवर्धन के लिए पूरक DMEM)।
- संस्कृति बोतल में सेल संगम पहुंचने पर trypsinize और कोशिकाओं और बीज 2 × 10 5 कोशिकाओं patterning और 48 घंटा से अधिक संस्कृति के लिए 2-कक्ष स्लाइड में से प्रत्येक में / 2 सेमी इकट्ठा। सेल के विकास और व्यवहार्यता के लिए एक नियंत्रण के रूप में कक्षों में से एक में कोशिकाओं का प्रयोग करें।
- चैम्बर स्लाइड पर सेल संगम पहुंचने पर 500 μl सेल ट्रैकर डाई समाधान के साथ 45 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं (जैसे, हरे - CMFDA या नारंगी - CMRA) सीरम मुक्त माध्यम में तैयार 10 माइक्रोन एकाग्रता में। इस patterning के दौरान सेल दृश्य के लिए किया जाता है। धीरे प्रत्येक कक्ष निस्तब्धता एक पिपेट का उपयोग, और बाद में संस्कृति patterning प्रयोगों के लिए सीरम पूरक मीडिया में कोशिकाओं द्वारा पीबीएस के साथ लेबल की कोशिकाओं को धो लें।
- सेल गिनती के प्रयोजन के लिए सेल ट्रैकर से सना हुआ कोशिका की सतह का एक संदर्भ छवि प्राप्त करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता हैसेल परत की confluency। इसके अलावा, यह मात्रा का ठहराव प्रयोगों अगर नमूना वसूली और डीएनए विश्लेषण उद्देश्य हैं के लिए एक सहायता के रूप में कार्य करता है।
नोट: मामला है कि सेल व्यवहार्यता patterning के दौरान मूल्यांकन किया जाना है, कोशिकाओं निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक लाइव / मृत cytotoxicity किट के साथ कलंकित किया जा सकता।
2. बनाना श्रेणीबद्ध Hydrodynamic प्रवाह बन्दिश (hHFC)
- कांच स्लाइड से 50 माइक्रोन के अंतराल दूरी के सेल monolayer खत्म एमएफपी ले जाएँ। यह अंतर दूरी hHFC के संपर्क सुनिश्चित करते हुए भी monolayer सतह और मोटाई परिवर्तन के लिए खातों।
- 6 या 8 μl पर NaOH इंजेक्षन / I2 के माध्यम से मि। अन्य प्रवाह दरों का मूल्यांकन (यानी, क्यू I1, क्यू A1 और क्यू A2) चित्रा 3 में प्रवाह नियमों का उपयोग।
- क्यू I2 / क्यू I1 के अनुपात बदलने इंजेक्शन सीरिंज का उपयोग करके आंतरिक एचएफसी के आकार व्यवस्थित करना।300 कोशिकाओं - उदाहरण के लिए, 1.3 μl / मिनट और 4 μl / मिनट, क्यू I2 के साथ 8 μl / मिनट है, जो 150 के एक NaOH के पदचिह्न में यह परिणाम पर तय बीच एक क्यू I1 का उपयोग (100 - 200 सुक्ष्ममापी 2 / सेल) ( चित्रा 3 डी)।
- hHFC की कार्रवाई के दौरान मीडिया और आकांक्षा के वाष्पीकरण के लिए खाते में 20 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर एमएफपी सिर पर सबसे बाहरी छिद्र से पूरा मध्यम इंजेक्षन।
3. patterning के सेल monolayers hHFC का प्रयोग
नोट: स्कैनिंग पैटर्न विशिष्ट जैविक सवालों का अध्ययन करने के लिए शेष कोशिकाओं को छोड़ने सेल monolayer जहां कोशिकाओं को निकाला जाता है (subtractive patterning) के क्षेत्रों, निर्धारित करता है। यह पैटर्न सीधे लाइनों या धब्बे की एक सरणी, उदाहरण के लिए हो सकता है। जटिल पैटर्न एक उपयुक्त स्कैनिंग प्रक्षेपवक्र की डिजाइन की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, एक चेकर स्कैनिंग प्रक्षेपवक्र (सेल क्षेत्रों का एक ग्रिड चित्रा -4 ए में उदाहरण के लिए दिखाया गया है प्रदान करता है
- 50 माइक्रोन के अंतराल दूरी पर 10 माइक्रोन / एस के स्कैन वेग में (एक्स, वाई और जेड निर्देशांक की स्थापना करके) उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित पैटर्न में सेल monolayer भर में जांच सिर को स्कैन करने के लिए मंच सॉफ्टवेयर सेट करें।
- आपरेशन में और monolayer के साथ संपर्क में नेस्ट hHFC साथ, नमूनों सेल हटाने प्रभाव के लिए वांछित पैटर्न के एक प्रक्षेपवक्र के साथ एमएफपी स्कैन।
- पहले सेल प्रकार हटाने के बाद एक सह-संस्कृति के लिए, एक अलग सेल लाइन बीज, अंतराल को भरने के लिए धारा 1.5 में वर्णित विधियों का उपयोग कर। नेस्ट और pinched मोड सेल हटाने को नियंत्रित करने (जीएपी दूरी बढ़ रही है, उदाहरण के लिए) के बीच ले जाएँ।
नोट: वेग स्कैन investi होना पड़ सकता हैअन्य सेल लाइनों के लिए gated। स्कैन वेग इस्तेमाल किया सेल लाइनों के लिए स्कैन क्षेत्रों पर इस प्रदर्शन के प्रभाव पूर्ण सेल हटाने में इस्तेमाल किया।
4. सैम्पलिंग और डीएनए प्रवर्धन के लिए डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण
- lysate के बहाव के विश्लेषण के लिए नमूना स्टेशन तैयार करें। नमूना स्टेशन के लिए, का उपयोग एक 3 डी मुद्रित 8-पट्टी पीसीआर ट्यूब धारक। वैकल्पिक रूप से, इस अनुकूलक, जो सब्सट्रेट बाहर सिर की स्कैनिंग सीमा के भीतर रखा जा रहा करने में सक्षम है के रूप में काम करने के लिए एक उचित ट्यूब धारक चुनें। 70% इथेनॉल या तंगी आवेदन के लिए वांछित के आधार पर अन्य सतह decontaminants के साथ ट्यूब धारक साफ कर लें। सब्सट्रेट धारक पर संलग्न करने के लिए ट्यूब धारक पर एक चुंबकीय क्लिप का प्रयोग करें।
- नमूना स्टेशन तैयार करने के बाद, स्थिति monolayer से एमएफपी सिर 100 माइक्रोन। 1 के प्रवाह की दर, 6 के साथ आंतरिक इंजेक्शन चैनल के लिए प्रसंस्करण तरल के रूप में 50 मिमी NaOH समाधान के साथ hHFC परिचालन शुरू, -7 और -17.5 μl / क्यू I1, क्यू I2, क्यू A1 और A2 क्यू क्रमशः के लिए मिनट।
- एक बार जब प्रवाह कारावास (लगभग 10 सेकंड में) स्थिर हो गया है, 50 माइक्रोन के अंतराल दूरी hHFC के साथ कोशिकाओं के चुने हुए उप-जनसंख्या का NaOH के आधार पर स्थानीय सेल प्रदर्शन करने के लिए जांच सिर उतर। एक बार उप-जनसंख्या का सेल पूरा (लगभग 30 पदचिह्न प्रति सेकंड) है, नमूना स्टेशन में ट्यूबों की ओर सिर प्रत्यक्ष। निकालें पीसीआर ट्यूबों में एकत्र lysate सीधे (चित्रा 6)।
- lysate के बहाव के प्रसंस्करण के लिए, पहली Tris बफर (: 1 1) के साथ lysate मिश्रण से समाधान के पीएच बेअसर। निराकरण के बाद, 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए lysate गर्मी। तो फिर सीधे lysate लोड एक मानक qPCR कार्यप्रवाह में साधन के आपूर्तिकर्ता द्वारा निर्धारित रूप में।
Representative Results
सेल monolayers के तेजी से subtractive patterning के लिए वर्णित प्रोटोकॉल एक बहु घटक एमएफपी मंच का उपयोग (आंकड़े 1 और 2) प्रदर्शन किया है। स्थानीय स्तर पर इलाज के लिए और NaOH प्रसंस्करण तरल के रूप में उपयोग करते हुए, सेल monolayers से कोशिकाओं को दूर करने के लिए, (चित्रा 3 hHFC) प्रोटोकॉल श्रेणीबद्ध hydrodynamic प्रवाह कारावास कार्यरत हैं। hHFC विन्यास एक आंतरिक एचएफसी और एक बाहरी कार्पोरेशन शामिल हैं। भीतरी hHFC में ही सीमित NaOH रासायनिक क्रिया और संपर्क में कोशिकाओं पर कतरनी परिचय। इस पदचिह्न के भीतर, कोशिकाओं ही ढंग NaOH के रासायनिक क्रिया को उजागर कर रहे हैं, के भीतर और बाहर कारावास क्षेत्र के लिए नगण्य प्रसार के साथ संवहन संचालित बड़े पैमाने पर स्थानांतरण के कारण। दूसरी तरफ कोशिकाओं पर कतरनी, NaOH के प्रवाह की दर अलग से बदला जा सकता है। संचालन मानकों को आसान बनाने के लिए, हम कतरनी की तुलना में रासायनिक क्रिया सेल हटाने की प्रभावी तंत्र बनाने के लिए चुना है। सेवा मेरेसतह पर कतरनी hHFC द्वारा लागू बल का अनुमान है, एक परिमित तत्व मॉडल Comsol Multiphysics 5.0 का उपयोग कर बनाया गया था। सिमुलेशन लामिना का प्रवाह के लिए सीएफडी मॉड्यूल का उपयोग कर चलाए जा रहे थे। दो ज्यामिति के इंजेक्शन छिद्र और आकांक्षा छिद्र करने के लिए दो आउटलेट सीमा की स्थिति (चित्रा 5) के लिए प्रवेश सीमा की स्थिति प्रवाह दरों और एपर्चर आयाम वर्तमान प्रदर्शन में इस्तेमाल की श्रृंखला के लिए लागू किया गया। मॉडल प्राप्त में, प्रवाह नियम, कतरनी प्रोफ़ाइल तय करती है, जबकि प्रवाह दरों सतह पर कतरनी की भयावहता को परिभाषित किया। व्यावहारिक रूप से, दोनों के संयोजन निर्धारित करता है कि hHFC संपर्क सतह। मन में इन कारकों को ध्यान में रखते हैं, तब हम रासायनिक प्रमुख सेल हटाने प्राप्त करने में ऑपरेशन के लिए प्रवाह दरों की एक सीमा खोजने के लिए निकल पड़े। एक hHFC बनाने के लिए, हम 3.5 के इंजेक्शन प्रवाह की दर के अनुपात में कुल आकांक्षा के प्रवाह नियम का उपयोग करें। अन्य प्रवाह इस्तेमाल नियमों आकांक्षा चैनलों के भीतर clogging कम करने के लिए निर्धारित किया गया था,जो चैनल सतहों से चिपके विकृत प्रोटीन की वजह से हो सकता है। विकसित मॉडल का उपयोग करना, हम प्रवाह की दर 5 से 10 μl / मिनट अनुवाद करने के लिए एक कतरनी तनाव को 1 और 3 एन / एम 2 के बीच पाया। NaOH के रासायनिक प्रभाव के बिना, निष्कर्षण बफर के मामले में उदाहरण के लिए, कतरनी तनाव नहीं पर्याप्त उच्च कोशिकाओं को दूर करने के लिए 19 होगा। मनाया सीमा के भीतर, हम ध्यान दें उच्च प्रवाह दरों पर कि ऑपरेशन चैनलों में सेल मलबे के कारण कम आकांक्षा प्रवाह की दर (यानी, क्यू I2 <4 μl / मिनट) में प्रवाह पथ में perturbations के कारण अधिक व्यावहारिक है।
अध्ययन कतरनी प्रोफ़ाइल और व्यावहारिक दृष्टिकोण, 6 और 8 μl / मिनट की NaOH के प्रवाह की दर (क्यू I2) को ध्यान में रखते patterning प्रयोगों और क्यू I1, क्यू A1 और 3 चित्र में दिखाया प्रवाह नियमों के अनुसार क्यू A2 के लिए उपयोग किया जाता है। अनुपात इंजेक्शन प्रवाह की (क्यू I2 / क्यू I1) यू की अनुमति देता हैआगे Autebert एट अल। 14 द्वारा सविस्तार मूल सिद्धांत के साथ, hHFC पदचिह्न (चित्रा 3 डी और चित्रा 4 बी) के आकार को व्यवस्थित करना। HHFC एमएफपी मंच के उच्च संकल्प स्कैनिंग की क्षमता के साथ मिलकर की तरल आकार देने की क्षमता का उपयोग करना, हम कई पैमानों पर रहते सेल ग्रिड पीढ़ी का प्रदर्शन और इसके अलावा सह संस्कृतियों (चित्रा 4C) के विकास में दिए गए प्रोटोकॉल के आवेदन दिखा।
मंच भी हमें नीचे की ओर विश्लेषण के लिए नमूना lysate पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। प्राप्त lysate की गुणवत्ता में दिखाने के लिए, हम स्थानीय स्तर कोशिकाओं को एक और पांच पैरों के निशान से दो स्वतंत्र प्रयोगों में lysed नमूना, डीएनए की मात्रा lysate (चित्रा 7) से प्राप्त में बदलाव दिखा। यहाँ, हम डीएनए β-actin प्राइमरों का उपयोग (आगे lysate में निहित प्रवर्धित: GGATGCAGAAGGAGATCACT और रिवर्स: CGATCCACACGGAGTACTTG ) प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में निष्प्रभावी lysate के 4 μl का उपयोग कर।
सीरिंज, मोटर चरणों और एक नियंत्रक चित्रा 1. एमएफपी मंच और सिर के मॉड्यूल। (ए) मंच के परिचालन मॉड्यूल मोटर चालित शामिल। एमएफपी एक मोटर जेड चरण सिर और सब्सट्रेट के बीच की खाई दूरी को नियंत्रित करने के लिए जुड़ा हुआ है, और सब्सट्रेट धारक एक्स और वाई मोटर चालित चरणों स्कैनिंग प्रणाली का गठन करने से जुड़ी है। (बी) एमएफपी सिर पम्पिंग स्टेशन से कनेक्ट करने के fluidic विअस, बढ़ते छेद जेड मंच पर सिर माउंट करने के लिए है, और चैनलों कि पॉलिश सर्वोच्च बाहर निकालता है। सर्वोच्च सेल संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए समतलीय सेट है। सममित न्यूटन के छल्ले मनाया जा सकता है जब सर्वोच्च और सब्सट्रेट समतलीय और संपर्क में हैं। p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. एमएफपी मंच। उच्च संकल्प स्कैनिंग मंच एक मशीनीकृत सिर धारक उच्च परिशुद्धता मोटर जेड चरण के साथ interfacing के साथ सुसज्जित है। सब्सट्रेट धारक स्कैनिंग प्रयोजनों के लिए XY मंच से जुड़ा है। बहाव के विश्लेषण के लिए lysate की वसूली के लिए, एक 3 डी मुद्रित नमूना स्टेशन सब्सट्रेट धारक (इनसेट में दिखाया गया है) की ओर करने के लिए चुंबकीय काटा गया है। सिरिंज पंप, एक औंधा माइक्रोस्कोप, नियंत्रकों और प्रदर्शित मंच के आसपास स्थित हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3 "src =" / files / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg "/>
चित्रा 3. श्रेणीबद्ध hydrodynamic प्रवाह कारावास (hHFC) सेल हटाने के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के लिए। (ए) एक भी आवास वित्त कंपनी के योजनाबद्ध। (बी) नेस्ट और (सी) hHFC आपरेशन के pinched मोड। (डी) के दो अलग-अलग इंजेक्शन / आकांक्षा प्रवाह अनुपात के लिए पदचिह्न की छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. एमएफपी का उपयोग करते हुए सेल monolayers के पैटर्न। (ए) एक एमडीए MB-231 सेल monolayer पर एमएफपी का प्रोग्राम स्कैनिंग द्वारा सेल ग्रिड पीढ़ी। प्रकोष्ठों हरी सेल पर नजर रखने वाली डाई के साथ दाग रहे थे। (बी) के अलग-अलग इंजेक्शन अनुपात के लिए पदचिह्न (एन) एक MCF7 सेल monolayer पर। योजनाबद्ध n में एक परिवर्तन के साथ भीतरी एचएफसी के आकार में होने की उम्मीद है परिवर्तन दिखाता है। (सी) नमूनों सह संस्कृति MCF7 monolayer के subtractive patterning घटाया क्षेत्रों में एमडीए MB-231 कोशिकाओं बोने के बाद से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. सतह पर कतरनी तनाव जब hHFC। रैखिक आंतरिक इंजेक्शन प्रवाह की दर के साथ सतह बढ़ जाती है पर कतरनी तनाव आवेदन। उच्चतम बिंदु कतरनी दो भीतरी छिद्र (नीचे सही इनसेट), जहां प्रसंस्करण तरल ही सीमित है (लाल प्रवाह लाइनों, ऊपर छोड़ दिया इनसेट) के बीच पाया जाता है। एपर्चर परिमित तत्व मॉडल में इस्तेमाल आयाम 200, 100, 100 और 200 माइक्रोन i1 के लिए कर रहे हैं, I2, A1और A2, क्रमशः। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 6 एमएफपी मंच के ऑपरेटिंग मोड सेल हटाने और patterning प्रदर्शन करने के लिए। (ए) सेल द्वारा subtractive patterning के लिए प्रवाह पथ के योजनाबद्ध। सादगी के लिए, प्रत्येक इंजेक्शन और आकांक्षा प्रवाह पथ का केवल एक ही दिखाए जाते हैं। सीरिंज पंपों में नाली वाल्व का उपयोग कर भर रहे हैं। i1 और i2 निष्कर्षण बफर और NaOH क्रमश: इंजेक्शन लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। (बी) lysate वसूली के लिए प्रवाह पथ के योजनाबद्ध। इस प्रवाह पथ (ए) में प्रवाह पथ का उपयोग कर विश्लेषण के लिए सेल lysate के संग्रह के बाद सक्रिय है। CLIC कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ k।
QPCR का उपयोग करते हुए सेल lysate से डीएनए के 7 चित्रा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण। Lysate में डीएनए 5 पैरों के निशान (5 एफपी) और 1 पदचिह्न (1 एफपी) से निकाले गए (ए) प्रवर्धन भूखंडों। नियंत्रण दोनों मामलों के लिए lysate संग्रह के बाद निकाले गए थे। (बी) के डीएनए का घटता निकाले डीएनए की गुणवत्ता दिखा lysate से परिलक्षित पिघला। qPCR प्रदर्शन किया गया था (एन = 2, एन = 3) β-actin जीन बढ़ाना। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा एस 1। 6 चैनल एमएफपी सिर के लिए चैनल डिजाइन का एक छोटा imageचैनल patterning प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया। hHFC प्रदर्शन कर 200, 100, 100, 200 माइक्रोन विस्तृत, और 100 माइक्रोन गहरी हैं। दो सबसे बाहरी चैनल, जो विसर्जन तरल की भरपाई 500 माइक्रोन चौड़ा और 100 मीटर गहरी हैं। एक ही डिजाइन के लिए एक GDS फ़ाइल इस लेख के लिए एक पूरक के रूप में प्रदान किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
हम सेल monolayers के subtractive patterning कि स्थानिक परिभाषित सेल पैटर्न की तेजी पीढ़ी सक्षम बनाता है के लिए एक बहुमुखी प्रोटोकॉल उपस्थित थे। सेल monolayers के चुनिंदा सेल hHFC में प्रसंस्करण तरल रूप में NaOH का उपयोग किया जाता है। NaOH तत्क्षण प्रोटीन कोशिका झिल्ली में निहित denatures। हम lysate के बहाव के प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए NaOH के 50 मिमी एकाग्रता का उपयोग करें। यह एकाग्रता अधिक तेजी से सेल को हटाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, बशर्ते lysate डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण एक उद्देश्य नहीं है। hHFC सुनिश्चित करता है कि सेल monolayer के असंसाधित आसपास के क्षेत्रों अप्रभावित रहते हैं और या तो पैटर्न के विस्तार या कोशिकाओं के अन्य संपत्तियों की जांच कर लिए उपलब्ध हैं।
सेल हटाने की दर दोनों रसायन शास्त्र और कतरनी प्रवाह द्वारा प्रस्तुत की एक समारोह है। हम रसायन विज्ञान प्रमुख सेल हटाने के लिए प्रवाह दरों का परिचालन सीमा का चयन करें। 20 & # - 10 की स्कैनिंग वेग181; मीटर / सेकंड 6 के एक NaOH इंजेक्शन प्रवाह की दर का उपयोग कर - 8 μl / मिनट 'तेजी' subtractive patterning की सुविधा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। सेल हटाने की तीव्र दर कुछ चुनौतियों सतह मुद्रण द्वारा सामना आधारित patterning दृष्टिकोण 20,21 संबोधित करते हैं। इन विधियों, उदाहरण के लिए, स्थानिक परिभाषित क्षेत्रों में कोशिकाओं के विकास को सीमित करने के लिए सूक्ष्म संपर्क मुद्रण और कोशिकाओं के बाद बोने पैटर्न के माध्यम से प्राप्त करने के लिए कोशिका आसंजन प्रोटीन के चुनिंदा बयान से एक तंत्र की आवश्यकता है। वे कम throughput द्वारा सीमित है और पैटर्न पीढ़ी के लिए कई अनुक्रमिक चरणों के साथ ही प्रत्येक पैटर्न के लिए एक नया स्टैंसिल / डाक टिकट की आवश्यकता होती है। वर्णित विधि परिभाषित क्षेत्रों पर कोशिकाओं के चुनिंदा विकास की आवश्यकता नहीं है, और मुद्रण के विपरीत subtractive patterning प्रदर्शन से कई सीमाओं पर काबू, जबकि सेल संस्कृति सब्सट्रेट के किसी भी अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता नहीं है।
प्रोटोकॉल इस पत्र में उल्लिखित, patterning सेल monolayers के throughput के साथवृद्धि हुई है, जबकि उत्पन्न पैटर्न के तत्काल दृश्य प्रतिक्रिया प्राप्त करने के। इस पैटर्न के वास्तविक समय संशोधन की सुविधा। इस तरह के नियंत्रण परिदृश्य में जो सतह पर एक दिया सेल व्यवहार्यता सजातीय नहीं है में महत्वपूर्ण हो सकता है। विधि का एक अन्य लाभ यह है कि एक ही सिर और रसायन शास्त्र जिससे एक नमूनों सेल monolayer पैदा करने में शामिल कदम की संख्या को कम करने, कई पैटर्न उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सिर में चैनलों और सिर ज्यामिति के आयामों के आवेदन की जरूरतों के हिसाब से बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार patterning के संकल्प पर नियंत्रण की अनुमति देता है। वर्तमान काम में सभी प्रयोगों तय एपर्चर आयामों के साथ एक एमएफपी सिर का उपयोग कर, विशेष रूप से आंतरिक छिद्र के साथ 100 × 100 माइक्रोन और बाहरी छिद्र पर 200 × 100 माइक्रोन पर प्रदर्शन किया गया। बड़ा बाहरी छिद्र के साथ इस डिजाइन से छिद्र के clogging बिना hHFC के सतत संचालन सुनिश्चित करने के लिए चुना गया थाआवारा सेल मलबे। हम सेल हटाने में सफल परिणाम के साथ भीतरी एपर्चर आयामों के साथ सिर का परीक्षण किया है 50 × 50 माइक्रोन और उन दोनों के बीच 50 माइक्रोन रिक्ति,। छोटे छिद्र का प्रयोग करें, 10 × 10 माइक्रोन से नीचे 10 माइक्रोन अंतर के साथ, एक छोटे पदचिह्न आकार (~ 30 × 30 माइक्रोन) के लिए स्केलिंग की अनुमति होगी, इस प्रकार patterning में एक उच्च संकल्प सक्षम करने से। हम परिचालन मुद्दों मनाया एपर्चर छोटे से कम 10 माइक्रोन आकार के साथ की वजह से विविक्त clogging करने के लिए। क्योंकि इस तरह के परिचालन कठिनाइयों के, 100 माइक्रोन संकल्प की वर्तमान सीमा है और इस तरह वर्णित तकनीक की एक सीमा है। हालांकि, हम इस hHFC के तरल को आकार देने की क्षमता का उपयोग कर पता कर सकते हैं। हमने दिखा दिया है कि सेल को हटाने का संकल्प क्यू I2 / क्यू I1 को नियंत्रित करने से एपर्चर आयामों का सेट दिया के लिए देखते जा सकता है (चित्रा 4 बी) और शीर्ष करने वाली सब्सट्रेट खाई 10,14। वर्तमान काम में इस्तेमाल किया चरणों 100 एनएम का एक न्यूनतम कदम आकार की है।इन चलाया मापदंडों का एक संयोजन पदचिह्न आकार और स्कैनिंग दूरी के संदर्भ में सेल हटाने के स्थानिक संकल्प में सुधार कर सकते हैं।
नमूनों सह संस्कृतियों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच विशेष सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए वांछित हैं, अनुक्रमिक बोने और patterning प्रोटोकॉल का वर्णन का उपयोग किया जा सकता है। अंत में, उच्च गुणवत्ता के amplifiable डीएनए डीएनए में विलक्षण चोटी से, lysate से प्राप्त किया जा सकता स्पष्ट रूप वक्र (7 चित्रा देखें) पिघला। हम चारों ओर 1.6 एक भी पदचिह्न (लगभग 300 कोशिकाओं) qPCR का उपयोग करते हुए, जो सैद्धांतिक उम्मीद (6-8 पीजी / सेल) के करीब है से एनजी के एक डीएनए मात्रा का मूल्यांकन किया। यह कई डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए है, जबकि किसी भी डीएनए अलगाव तरीकों का उपयोग हो गईं उपयुक्त निकाले डीएनए की एक मात्रा इंगित करता है। इस के लिए रास्ते खुल संवर्धित कोशिकाओं की जांच कर रही स्थानीय डीएनए विश्लेषण के आधार पर। hHFC की क्षमता तरल पदार्थ आकार देने के लिए भी एसी पर जीवित कोशिकाओं और प्रोटीन जमा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताtivated सतहों, जो subtractive patterning और अनुक्रमिक सह संवर्धन इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत के साथ संयोजन में संस्कृति substrates पर जटिल सेल और सेल मैट्रिक्स पैटर्न के निर्माण के लिए सक्षम बनाता है। बहुमुखी प्रतिभा और सेल monolayers की hHFC आधारित subtractive patterning और निकाले कोशिकाओं पर डीएनए विश्लेषण प्रदर्शन करने की संभावना के द्वारा प्रदान नियंत्रण, जीव के लिए सेट सेल बातचीत से जुड़े spatially हल अध्ययन करने के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Microfluidic Probe (MFP) | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich | ||
| Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume |
| Chemicals and cell lines | |||
| Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
| Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
| Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. | |
| DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
| DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
| CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
| CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
| β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. | |
| MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
| Equipment and fluidic connections | |||
| Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
| Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
| Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | Component of pumping station. | |
| Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
| Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
| DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | Controlled using DS-U3 controller unit | |
| Software | |||
| Win - Commander | LANG GmBH, Germany | Stage control software. | |
| Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | Pump control software. | |
| NIS Elements | Nikon, Switzerland | Basic research module for image acquisition and analysis. | |
References
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils. Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).
- Schütze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).
- Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells. Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).
- Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy. Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).
- Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate. J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Multipurpose microfluidic probe. Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. Microfluidics in the "open space" for performing localized chemistry on biological interfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).
- Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient. Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).
- Christ, K. V., Turner, K. T. Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure. Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).
- Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces. Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. A Vertical Microfluidic Probe. Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).
- Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens. Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).
- Pollard, J. W., Walker, J. M. Basic Cell Culture Protocols. , Humana Press. (1997).
- Mitry, R. R., Hughes, D. R. Human cell culture protocols. Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).
- Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. Quantitative analysis of cell detachment by shear stress. Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).
- Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization. Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).
- Tasoglu, S., Demirci, U. Bioprinting for stem cell research. Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).
