Abstract
Den mikroflödessystem sond (MFP) underlättar utförande av lokal kemi på biologiska substrat genom att begränsa nanolitervolymer vätskor. Använda en speciell implementering av MFP, den hierarkiska hydrodynamiskt flöde förlossningen (hHFC), multipla vätskor samtidigt bringas i kontakt med ett substrat. Lokal kemisk påverkan och flytande formning med hjälp av hHFC, utnyttjas för att skapa cellmönster genom lokalt lyse och avlägsna celler. Genom att utnyttja scanning förmåga MFP är användardefinierade mönster av cellmonolager skapas. Detta protokoll möjliggör snabb, realtid och spatialt kontrollerad cell mönstring, vilket kan tillåta selektiv cell-cell och cell-matrix interaktionsstudier.
Introduction
I sin naturliga miljö, celler i biologiska vävnader upplever en rad biokemiska och fysiska signaler som styr deras tillväxt, organisation och utveckling. Att förstå dessa signaler kräver selektiv undersökning av cell-cell och cell-matrix-interaktioner. Detta gör det nödvändigt att utveckla metoder för mönstring cellmonoskikt. Metoder för att geometriskt skilda olika celltyper i odling (mönstring) möjliggör breda studier av fysikaliska och kemiska signaler i cellbiologi. De flesta av de nuvarande metoder för mönstring cellager 1-4 beror på att deponera cellvidhäftningsproteiner på ytor eller använda mikrofabricerade schabloner för selektiv tillväxt på substrat. I kontrast, här presenterar vi en metod för att snabbt mönstercellmonoskikt in situ, det vill säga, celler i odling, genom att ta bort celler i valda områden av monoskiktet. Metoder som utför sådana subtraktiv mönstring 5-9 usually kräver specialiserad substrat, ytbehandling, komplicerad operation, fysisk kontakt eller ablation med hjälp av en laser, oavsiktligt påverkar levande celler. Vi här använder en mikroflödessond (MFP) 10,11, en beröringsfri skanning mikroflödesteknik som hydrodynamiskt begränsar en vätska på ett substrat. En viktig komponent i MFP är mikrofabricerade huvudet innehåller mikro (Figur 1). Den tillhörande plattformen består av sprutpumpar för vätskeregler, scener för avsökning kontroll och ett omvänt mikroskop för visualisering och återkoppling (figur 2). I sin grundkonfiguration innefattar MFP huvudet två mikrokanaler med öppningar i apex, en för injicering av en behandlingsvätska och den andra för att aspirera den injicerade behandlingsvätskan tillsammans med viss nedsänkning vätska (figur 3A). Under MFP drift är toppen på ett fast avstånd från underlaget. När aspirationsflödeshastigheten (Qa) är sufficiently högre än injektionsflödeshastigheten (Q i), det vill säga, Qa: Qi ≥ 2,5, processvätskan är begränsad på substratet. Detta resulterar i ett hydrodynamiskt flöde inneslutning (HFC). Den region i vilken processvätskan är i direkt kontakt med substratet benämnes fotavtryck. För normala driftsförhållanden, är flödet av processvätskan inuti HFC kännetecknas av ett lågt Reynolds tal (Re ≈ 10 -2) och en hög Péclet nummer (Pe ≈ 10 2). Detta innebär vätskeflöden i laminärt regim med konvektion är det primära sättet att massöverföring av kemiska ämnen. De numeriska och analytiska modeller för flödes förlossning beskrivs någon annanstans 12-14.
I detta dokument använder vi tillvägagångssätt samtidigt begränsande flera processvätskor, som kallas hierarkisk HFC (hHFC) 14. För att genomföra hHFC med MFP, två additional öppningar behövs för att ge en sekundär källa injektions och aspiration. Detta gör det möjligt för oss att begränsa en vätska i en andra vätska. De inre (bearbetning) flytande förmåner från att avskärmas från strö skräp på substratet genom yttre (avskärmning) vätska. Dessutom hHFC möjliggör drift i två lägen: (i) den kapslade läget, där processvätskan i de inre HFC i kontakt med ytan (figur 3B), och (ii) den strypta läget, i vilket den inre vätskan förlorar kontakt och endast den yttre vätskan är i kontakt med substratet (figur 3C). Växla mellan de två lägena tillåter användare att utföra eller stoppa behandlingen av substratet och uppnås genom att styra head-to-yta gap eller genom att ändra förhållandet mellan injektionsströmmarna (Q i2 / Q i1). För en given kanalgeometri, kan fotavtryck av processvätskan på substratet styras genom modulering av flödesförhållanden (figur 3D). natrium-hydroxid (NaOH) används som det inre processvätskan för att lysera cellerna, och lysatet kontinuerligt aspireras från ytan. Eftersom de kemiska effekterna av processvätskan är lokaliserade till den inre HFC fotavtryck, de intilliggande cellerna förblir oberörd, som tillåter Spatiotemporal studier av cell-cell-interaktioner. Skannings funktionalitet MFP möjliggör skapandet av användardefinierade geometrier av cellmönster (Figur 4). Vidare är valet av NaOH som processvätska rymmer nedströms DNA-analys (Figur 7).
Protocol
1. MFP Head och Platform rengöring och förberedelse
OBS: Detta protokoll använder vertikalt orienterad kisel-glas hybrid MFP leder 15,16. Kiselkomponent av huvudet innehåller mikrokanaler, som är etsade till ett djup av 100 | j, m. Den etsade kisel är bundet till glas med användning av anodisk bondning. Kanalen designen innefattar ett mönster bestående av sex kanaler, två vardera för injektion och aspiration, och två för insprutning av nedsänkning vätska (Figur 1). Kanalerna som används för att injicera nedsänkning vätska fylla på media som omger det biologiska provet, på så sätt undvika förluster på grund av aspiration och indunstning. De inre kanaler och yttre kanaler som används i det pågående arbetet är 100 x 100 ^ m och 200 x 100 pm respektive. Post tillverkning och bearbetning, MFP huvuden med tydliga kanaler och polerade spetsar erhålls.
- Framställning av pumpstationen och vätskehanteringanordning
- Använd kapillärer med en 1/16 '' (1,59 mm) ytterdiameter och 0,02 '' (0,51 mm) innerdiameter för alla slangar kopplade till sprutor. Variera kapillär storlek beroende på tillämpning och erhålla kontakter och kopplingar gränssnitt MFP huvudet med sprutorna. Använd ultrarent vatten överallt där späd är nödvändiga.
- Rena sprutor (250 - 500 mikroliter volym) och sprutkolvama genom sonikering i 0,5% blekmedelslösning i ultrarent vatten före till- och efter levande cellförsök. Skölj dem ordentligt med vatten. Fylla dem med vatten genom att sänka ner deras spetsar helt i ett vattenbad och aspire med hjälp av kolven. Rensa vätskan medan inom vattenbadet med sprutan axeln bringa tätningen vid utloppet av sprutan. Upprepa aspirera och rensa tills inga luftbubblor syns i sprutan kolumner.
- Anslut fyllda sprutor till sprutpumpar använder Luer-lock kopplingar. Använda en omkopplare ventil som är monterad påpumpar för att rikta vätskan från sprutan till en av två kapillärer som leder antingen till MFP huvudet eller till de vätskereservoarer (Figur 6). (Om ingen växel ventil finns se avsnitt 1.4.4). Rensa båda kapillärer med vatten från sprutorna vid en flödeshastighet av cirka 10 till 50 | j, l / min, beroende på storleken av sprutan tills ca 10 | il vatten är kvar i sprutorna.
- Pre-sätta den renade kapillärerna i en lämplig mikroflödes kontakt / adapter som samverkar med kanal vias i huvudet (t.ex. M1 kontakt - se material).
- MFP head beredning
- Rengör MFP huvudet genom ultraljudsbehandling med användning av glas rengöringsmedel för vanlig rengöring eller 0,5% blekmedel för stränga rengöring, under 5 min. Rensa kanaler med vatten genom nedsänkning av spetsen i vatten och applicering av vakuum för att viorna.
- Inspektera kanaler under ett stereomikroskop för potentiella hinder (igensättning) och retorv föregående steg om nödvändigt.
- Montera rena huvudet på huvudet hållaren och skruva fast kontakten med pre-in och renas rör på huvudet. Skruva fast huvudet innehavaren till Z-steget, som används för kontroll av gapavstånd mellan huvudet och cellmonoskiktet.
- Kalibrera skannings stadier av MFP-plattformen
- Utför slutpunkt kalibrering av X-, Y- och Z-faser innan du ansluter huvudet till plattformen, enligt tillverkarens protokoll med en lämplig programvara gränssnitt. Kalibrerade stadier säkerställa noggrannhet vid placeringen av MFP huvudet.
- Erhållande av en oren nollspaltavstånd (nollställning) genom att MFP huvudet över en kammare glida utan celler och långsamt ner i 5 um steg. På sond kontakt med substratet, ska observeras Newtonska ringar. Detta är en grov uppskattning. En exakt position skall erhållas efter justering samplanheten sondens spets till substrate.
- För att säkerställa planjämnhet av sonden apex, justera lutningen av huvudet med användning av en goniometer (vid gränsytan av huvudet och Z-steget). När den formas säkerställa att Newtonska ringar är symmetriska (Figur 1). Flytta MFP huvudet 20 um bort från substratet och justera lutningen med hjälp av goniometer. Upprepa descend, nollställning och lutningsjustering tills Newtons ringar är symmetriska vid kontakt. Med lutning justeras, ställ in z-positionen som producerar symmetriska Newton-ringar som noll.
OBS: Z-stadiet styr huvud-till-substratavståndet, medan XY steget styr avsökningen av substratet (figur 2). En detaljerad förklaring finns i vårt tidigare arbete 14.
- Kemiska preparat för lokal borttagning av cellskikt
Varning: I förekommande fall, användning säkerhetsutrustning (t.ex. nitril, skyddsglasögon) för de kemikalier som förbereds. Använd en rök hood om det behövs för framställning av lösningar. Förbered alla kemikalier och buffertar med ultrarent vatten som utspädningsmedel.- Förbered 50 mM NaOH-lösning som processvätskan för det inre injiceringskanalen (i2 med flödet Q I2 i figur 1).
- Förbereda extraktionsbufferten lösning som krävs för det yttre injektion (i1 med flödet Q I1 i fig 1), sammansatt av 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,5% Tween 20, och 10 ^ iM rodamin B i 50 mM Tris (hydroximetyl) aminometan vid pH 8. För rensning, använder vatten i aspirations sprutor.
- Filtrera alla lösningar med en 0,2 um sprutfilter. Degas alla filtrerade lösningar med en torkapparat tills löst luft stopp bubblar upp till ytan.
- Med användning av dräneringsledningen som är ansluten till de sprutpumpar, rensa kvarleva vatten och aspirera avgasade lösningar i injektionssprutor på 40 | j, l / min tills sprutorna är fulla (250 eller 500 | j, l).Detta säkerställer bubbelfritt fyllning av sprutor, kontakter och kapillärer. Ventilen-två-kapillärsystem spruta-switch tillåter fyllning av sprutor mitten experiment. I avsaknad av en sådan växelventil, koppla kapillärerna från huvudet och fylla kapillärerna och sprutan genom att aspirera de avgasade lösningar innan du ansluter dem till huvudet.
- Aspire bearbetning och skärmande vätskor genom kapillärerna tillåter användning av små volymer under drift. Om kemikalierna kan framställas i stora volymer, fyll sprutor med de lösningar som krävs direkt. Till exempel, kan aspirations sprutor som innehåller vatten fyllas med användning av detta tillvägagångssätt.
- Rensa kapillärerna till MFP huvudet med vätskorna som tilldelas för varje kanal som definieras i 1.4.1 och 1.4.2.
OBS: extraktionsbuffert lösning skyddar NaOH i den inre inneslutningen och rodamin komponenten i bufferten underlättar visualisering av the hHFC under drift. - Om cellerna är över-sammanflytande, med cellaggregat som uppträder på den odlade ytan, kompletterar extraktionsbufferten med 10% Proteinase K. Detta kompletterar verkan av NaOH på dessa aggregat genom upplösning denaturerade proteiner som lysatet kommer in i aspirationskanalerna. Detta förhindrar igensättning av kanalerna under drift.
- Framställning av cellmonoskikt på kammarobjektglas
Varning: Använd en cellkultur huva för att odla cellerna och hantera utrustningen enligt regler uppställda av biosäkerhet officer i laboratoriet. Notera särskilda krav för specifika cellinjer och anpassa protokoll och utrustning i enlighet därmed.- Använd cellodlings inkubatorer (vid 5% CO2 och vid 37 ° C) för kultur och utbyggnad av celler som skall mönstras. Utför expansionen användning av standardcellodlingsprotokoll 17,18 i T-kolvar. Använd odling medier enligt kraven för den specifika cell linje (t.ex. serum och antibiotika kompletterat DMEM för odling MCF7 och MDAMB 231).
- På att nå cellsammanflytning i odlingskolvar, trypsinize och samla celler och utsäde 2 x 10 5 celler / cm2 i vart och ett av de två kammar bilder för mönstring och kultur över 48 timmar. Använda celler i en av kamrarna som en kontroll för celltillväxt och viabilitet.
- På att nå cellsammanflytning på kammarobjektglas, inkubera cellerna under 45 min med 500 | il cell tracker färgämneslösning (t.ex. grön - CMFDA eller orange - CMRA) vid 10 | iM koncentration framställes i serumfritt medium. Detta görs för cell visualisering under mönstringen. Tvätta märkta cellerna med PBS genom att försiktigt spola varje kammare med hjälp av en pipett och därefter odla cellerna i serum kompletterade media för mönstringsexperiment.
- Erhålla en referensbild av cellen-tracker-färgade cellytan i syfte att cellräkning. Detta görs för att säkerställaconfluency av cellskiktet. Dessutom fungerar den som ett stöd för kvantifiering experiment om prov återhämtning och DNA-analys är mål.
OBS: I det fall då cellviabiliteten till är bedömas under mönstring, kan cellerna färgas med en Live / Dead cytotoxicitet kit i enlighet med tillverkarens instruktioner.
2. Skapa hierarkiska hydrodynamiskt flöde Förlossning (hHFC)
- Flytta MFP över cellmonoskiktet till ett gap avstånd av 50 ^ m från objektglaset. Denna klyfta avstånd samtidigt som kontakt mellan hHFC svarar också för monolagerytan och tjockleksvariation.
- Injicera NaOH vid 6 eller 8 l / min genom i2. Utvärdera andra flöden (dvs Q I1, Q A1 och Q A2) med hjälp av flödesregler i figur 3.
- Modulera storleken av det inre HFC genom att ändra förhållandet av Q I2 / Q I1 genom att använda injektionssprutor.Till exempel använder en Q I1 mellan 1,3 l / min och 4 l / min, med Q I2 fastställas till 8 l / min, vilket resulterar i en NaOH fotavtryck av 150 - 300 celler (100 - 200 nm 2 / cell) ( Figur 3D).
- Injicera fullständigt medium från de yttre rsta öppningar på MFP huvudet vid en flödeshastighet av 20 | il / min för att ta hänsyn till avdunstning av media och aspiration under driften av den hHFC.
3. Mönstring Cellmonoskikt Använda hHFC
Obs! Avsökningsmönster fastställer områdena för cellmonoskiktet där cellerna extraheras (subtraktiv mönstring), lämnar de återstående cellerna för att studera specifika biologiska frågor. Detta mönster kan vara raka linjer eller en array av fläckar, till exempel. Komplexa mönster kräver utformning av en lämplig skanningsbana. Till exempel, ger en rutig avsökningsbana ett rutnät av cellområden (visad exempelvis i fig 4A
- Uppsättningen arrangera för att skanna probehuvudet över cellmonoskiktet i användardefinierade mönster (genom att ställa in X-, Y- och Z-koordinater) vid en avsökningshastighet av 10 | j, m / s vid ett gap avstånd av 50 ^ m.
- Med kapslade hHFC i drift och i kontakt med monolagret, skannar MFP med en bana av det önskade mönstret för att åstadkomma mönstrade cell tas bort.
- För en co-kultur efter den första celltypen avlägsnande, utsäde en annan cellinje för att fylla luckorna, med hjälp av metoder som beskrivs i avsnitt 1.5. Flytta mellan kapslade och nöp lägen (genom att öka gapet avstånd, till exempel) för att styra bort cell.
OBS: Avsökningshastigheten kan behöva vara undersökgated för andra cellinjer. Skanningen hastighet som används i denna demonstration effekter komplett cell bort över de skannade regioner för de använda cellinjer.
4. Nedströms Behandling för Provtagning och DNA Amplification
- Förbered provtagningsstation för nedströms analys av lysatet. För provtagningsstation använder en 3D tryckt 8-band PCR rörhållare. Alternativt välja en lämplig slanghållare för att tjäna som denna adapter, vilken är i stånd att monterad inuti avsökningsområde av huvudet utanför substratet. Torka rörhållaren med 70% etanol eller annan yta saneringsmedel baserade på den önskade för tillämpningen stringens. Använd en magnetisk klämma på tubhållaren att fästa den på substrathållaren.
- Efter beredning av provtagningsstation placerar MFP huvudet 100 pm från monolagret. Börjar manövrera hHFC med 50 mM NaOH-lösning som processvätskan för det inre injiceringskanalen med flödeshastigheter av 1, 6, -7 Och -17,5 l / min för Q I1, Q I2, Q A1 och Q A2 respektive.
- När flödet förlossning har stabiliserats (i cirka 10 sekunder), ned sonden huvudet till ett gap avstånd av 50 pm för att utföra NaOH baserade lokala lys av den valda subpopulation av celler med hHFC. När lys av delpopulation är klar (ca 30 sek per fotavtryck), rikta huvudet mot rören i provtagningsstation. Mata det uppsamlade lysatet in i PCR-rör direkt (Figur 6).
- För nedströmsbearbetning av lysatet, först neutralisera pH hos lösningen genom att blanda lysatet med Tris-buffert (1: 1). Efter neutralisation, värm lysatet till 95 ° C i 30 min. Sedan direkt ladda lysatet i en standard qPCR arbetsflöde som fastställts av leverantören av instrumentet.
Representative Results
Den beskrivna protokollet för snabb subtraktiv mönstring av cellmonoskikt demonstreras med användning av en flerkomponent MFP plattform (fig 1 och 2). Protokollet utnyttjar den hierarkiska hydrodynamiskt flöde inneslutning (hHFC; figur 3) för att lokalt behandla och avlägsna celler från cellmonoskikt, med användning av NaOH som processvätskan. Den hHFC konfigurationen innefattar en inre HFC och en yttre HFC. Den begränsade NaOH i den inre hHFC introducerar kemisk påverkan och skjuvning på cellerna i kontakt. Inom denna fotavtryck cellerna homogent utsätts för kemisk påverkan av NaOH, på grund av konvektion driven massöverföring inom och med försumbar spridning till regionen utanför inneslutningen. Skjuvningen på cellerna å andra sidan, kan ändras genom att variera flödeshastigheten för NaOH. Att förenkla driftsparametrar, valde vi att göra kemisk verkan den dominerande mekanismen för avlägsnande cell i jämförelse med skjuvning. Tilluppskatta skjuvkraft som appliceras av hHFC på ytan, var ett finit-elementmodell byggd med hjälp av COMSOL Multiphysics 5.0. Simuleringar kördes med hjälp av CFD-modulen för laminära flöden. Två inloppsrandvillkor till injektions öppningar geometrin och två utloppsrandvillkor till aspirations öppningar (Figur 5) tillämpades för olika flödeshastigheter och öppningsmått som används i den aktuella demonstrationen. I modellen erhålls, flödesregler dikterade skjuv-profil, medan flödeshastigheterna definierade storleken på skjuvningen på ytan. Praktiskt, en kombination av båda bestämmer om hHFC i kontakt med ytan. Att hålla dessa faktorer i åtanke, vi satt ut för att hitta ett område av flödeshastigheter för drift i syfte att erhålla kemiskt dominerande cell bort. För att skapa en hHFC använder vi regeln om en total aspiration injektion flödeshastighetsförhållande på 3,5 flöde. De andra flödes regler som används definierades för att minimera igensättning i aspirations kanaler,vilket kan orsakas av denaturerade proteiner som klibbar till kanalytorna. Genom att använda den utvecklade modellen, fann vi flödeshastigheter från 5 till 10 | j, l / min översätta till en skjuvspänning mellan 1 och 3 N / m 2. Utan den kemiska effekten av NaOH, till exempel i fallet med extraktionsbuffert, skjuvspänningen inte skulle vara tillräckligt hög för att avlägsna cellerna 19. Inom den observerade intervallet, kan vi konstatera att drift vid högre flödeshastigheter är mer praktiskt på grund av störningar i strömningsbanan vid låga aspirationsflödeshastigheter (dvs Q I2 <4 l / min) på grund av cellrester i kanalerna.
Med tanke på den studerade skjuvning profil och praktiska överväganden, NaOH Flödena (Q I2) av 6 och 8 ul / min används för mönstring experiment och Q I1, Q A1 och Q A2 enligt flödesregler som visas i figur 3. Förhållandet insprutningsmönster (Q I2 / Q I1) kan us att ytterligare modulera storleken på hHFC fotavtryck (figur 3D och figur 4B), med den underliggande principen utarbetats av Autebert et al. 14. Genom att använda det vätskeformnings förmåga hHFC kombination med hög upplösning scanning förmåga MFP plattform, visar vi live-cell nätgenerering vid multipla skalor och dessutom visar tillämpningen av det givet protokoll för att utveckla samodlingar (Figur 4C).
Plattformen gör det också möjligt för oss att utföra prov lysat hämtning för nedströms analys. För att visa kvaliteten på den erhållna lysatet prov vi lokalt lyserade celler från en och fem fotspår i två oberoende experiment, som visar variationen i mängder av DNA som erhållits från lysatet (Figur 7). Här, vi förstärkta DNA som finns i lysatet med hjälp av p-aktin primers (framåt: GGATGCAGAAGGAGATCACT och bakåt: CGATCCACACGGAGTACTTG ) Med hjälp av 4 pl av den neutraliserade lysat i varje PCR-reaktion.
Figur 1. Moduler av MFP-plattformen och huvudet. (A) De operativa moduler plattformen omfattar motoriserade sprutor, motoriserade scener och en styrenhet. MFP-enheten är ansluten till en motordriven Z-stadium för att styra gapet avståndet mellan huvudet och substratet, och substrathållaren är ansluten till X- och Y-motoriserade stadier som utgör avsökningssystemet. (B) MFP huvudet har fluidic vior att ansluta pumpstationen, monteringshål för att montera huvudet på Z-steget, och kanaler som lämnar den polerade spetsen. Apex är inställd i samma plan till cellodlings-underlaget. Symmetrisk Newtons ringar kan observeras när spetsen och underlaget är i samma plan och i kontakt. p_upload / 54447 / 54447fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. MFP plattform. Den högupplösta scanning plattform är utrustad med en bearbetad huvudet innehavaren samverkar med hög precision motoriserad Z-steget. Substrathållaren är ansluten till XY-planet för skanning ändamål. För återvinning av lysatet för nedströms analys, är en 3D tryckt provtagningsstation klippt magnetiskt till sidan av substrathållaren (visad i infälld). Sprutpumpar, ett inverterat mikroskop, regulatorer och displayer är placerade runt plattformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3 "src =" / filer / ftp_upload / 54447 / 54447fig3.jpg "/>
Figur 3. Hierarkisk hydrodynamiskt flöde förlossningen (hHFC) för rumsliga och tidsmässiga kontroll av avlägsnande cell. (A) Schematisk bild av en enda HFC. (B) Kapslade och (C) kläms sättet hHFC drift. (D) Bild av fotavtrycket för två olika injektions / aspirationsflödesförhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mönster cellmonolager med hjälp av MFP. (A) Cell-nätgenerering av programmerad scanning av MFP på MDA-MB-231-cellmonolager. Cellerna färgades med grön cell-tracker färgämne. (B) Fotavtrycket för de olika insprutningskvoter (n) På en MCF7 cellmonoskiktet. Den schematiska visar den förväntade variationen i formen av den inre HFC med en förändring i n. (C) Mönstrad co-kultur genom subtraktiv mönstring av MCF7 mono följt av ympning MDA-MB-231-celler i de subtraherade regioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Skjuvspänning på ytan vid tillämpningen hHFC. Skjuvspänningen på ytan ökar linjärt med den inre insprutningsflödeshastighet. Den högsta skärpunkten finns mellan de två inre öppningar (nedre högra infällda), där processvätskan är begränsad (röd flödeslinjer, uppe till vänster infällda). Öppningens dimensioner som används i den finita elementmodellen är 200, 100, 100 och 200 pm för I1, I2, a1och a2 respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Driftlägen för MFP plattform för att utföra avlägsnande cell och mönstring. (A) Schematisk bild av flödesvägen för subtraktiv mönstring av cellys. För enkelhets skull är endast en av varje injektion och aspirationsflödesbanor visas. Sprutorna är fyllda med hjälp av tömningsventilen i pumparna. i1 och i2 används för injicering av extraktionsbuffert och NaOH, respektive. (B) Schematisk bild av flödesvägen för lysat återhämtning. Denna flödesbana aktiveras efter insamling av cellysat för analys med hjälp av flödesvägen i (A). Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Nedströms analys av DNA från cellysatet med hjälp av qPCR. (A) Förstärkning tomter av DNA i lysat utvinns från 5 fotspår (5 FP) och ett fotavtryck (1 fp). Kontroller extraherades efter lysat kollektion för båda fallen. (B) Smält kurvor av DNA som amplifierats från lysatet som visar kvaliteten på den extraherade DNA. qPCR utfördes (N = 2, n = 3) för att förstärka den β-aktin-genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1. En skalad bild av kanaldesignen för 6-kanals MFP huvudsom används för mönstring experiment. Kanaler som utför hHFC är 200, 100, 100, 200 | im bred och 100 | j, m djup. De två yttersta kanalerna, som fylla nedsänkning vätska är 500 um bred och 100 um djup. En GDS-fil för samma design har lämnats som en komplettering till den här artikeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi presenterar en mångsidig protokoll för subtraktiv mönstring av cellmonoskikt som möjliggör snabb generering av rumsligt definierade cellmönster. Selektiv lysis av cellmonoskikt utförs med användning av NaOH som processvätskan i hHFC. NaOH denaturerar momentant de proteiner som finns i cellmembranet. Vi rekommenderar användning av 50 mM koncentration av NaOH för att säkerställa nedströms bearbetning av lysatet. Denna koncentration kan ökas för snabbare cell avlägsnande, förutsatt lysat nedströms behandling är inte ett mål. Den hHFC säkerställer att de obearbetade omgivande områden av cellmonoskiktet förblir opåverkade och är tillgängliga för antingen expandera mönster eller sondera andra egenskaper hos cellerna.
Hastigheten för avlägsnande cell är en funktion av både kemin och skjuvning presenteras av flödet. Vi väljer en räckvidd på flödeshastigheter för att ha kemi dominerande cell bort. Avsökningshastigheter av 10-20 & #181; m / sek med användning av en NaOH insprutningsflödeshastighet på 6-8 l / min används för att underlätta "snabb" subtraktiv mönstring. Den snabba hastigheten för avlägsnande cell tar några utmaningar som ytan utskrift möter baserat mönstring närmar 20,21. Dessa metoder kräver en mekanism för att begränsa tillväxten av celler i rumsligt avgränsade områden, t ex genom selektiv avsättning av cellvidhäftningsproteiner via mikro-kontakttryckning och efterföljande ympning av celler för att erhålla mönstret. De begränsas av låg genomströmning och kräver flera på varandra följande steg för mönstergenerering samt en ny stencil / stämpel för varje mönster. Den beskrivna metoden kräver inte selektiv tillväxt av celler på definierade områden, och övervinner flera begränsningar genom att utföra subtraktiv mönstring i motsats till utskrift, utan att kräva någon ytterligare behandling av cellodlings-underlaget.
Med det protokoll som beskrivs i detta dokument, genomströmningen av mönstringscellmonoskiktökas, och samtidigt erhålla omedelbar visuell feedback av mönstret genereras. Detta underlättar realtids modifiering av mönstren. En sådan kontroll kan vara avgörande i situationer där cellviabilitet på en given yta är inte homogen. En annan fördel med förfarandet är att samma huvud och kemi kan användas för att generera flera mönster, vilket minskar antalet steg som är involverade i generering av ett mönstrat cellmonoskiktet.
Dimensionerna på kanalerna i huvudet och geometri kan skalas i enlighet med kraven i ansökan, vilket möjliggör kontroll över upplösningen av mönstringen. Alla experiment i det pågående arbetet utfördes med hjälp av en MFP huvud med fasta dimensioner bländare, särskilt med inre öppningar på 100 x 100 pm och yttre öppningar på 200 x 100 pm. Denna design med större yttre öppningar valdes för att säkerställa kontinuerlig drift av hHFC utan att täppa till de hål genomströ celldebris. Vi har testat huvuden med inre öppningsmått 50 × 50 pm och 50 pm avståndet mellan dem, med lyckat resultat i avlägsna cell. Användning av mindre öppningar, ner till 10 x 10 ^ m med 10 um mellanrum, skulle tillåta skalning till en mindre fotavtryck storlek (~ 30 × 30 um), vilket möjliggör en högre upplösning i mönstring. Vi observerade operativa frågor med öppningsstorlekar mindre än 10 pm på grund av igensättning av partiklar. På grund av sådana operativa svårigheter är 100 ^ m den aktuella gränsen för upplösning och därmed en begränsning av den beskrivna tekniken. Men vi kan lösa detta genom att använda flytande formnings förmåga hHFC. Vi har visat att upplösningen för avlägsnande cell kan ställas in för en given uppsättning av öppningsdimensioner genom att styra Q I2 / Q I1 (figur 4b) och spetsen till substratgapet 10,14. Stegen som används i det pågående arbetet har en minsta stegstorlek på 100 nm.En kombination av dessa styrbara parametrar kan förbättra den rumsliga upplösningen i avlägsnande cell i termer av fotavtrycket storlek och avsökningsavståndet.
Om mönstrade co-kulturer önskas för att studera specifika cell-cell interaktioner mellan olika celltyper, kan utföras sekventiell sådd och mönstring med hjälp av det protokoll som beskrivs. Slutligen kan amplifierbar DNA av hög kvalitet erhållas från lysatet, som framgår av singularis topp i DNA smältkurvan (se figur 7). Vi utvärderade ett DNA kvantitet av cirka 1,6 ng från en enda fotavtryck (ca 300 celler) med användning av qPCR, vilket är nära den teoretiska förväntan (6-8 pg / cell). Detta tyder på en kvantitet av det extraherade DNA lämplig för flera nedströmsprocesser medan man undviker användning av DNA-isoleringsmetoder. Detta öppnar möjligheter för DNA-analys-baserade lokala sondering av odlade celler. Förmågan hos hHFC att forma vätskor kan också användas för att avsätta levande celler och proteiner på acaktiveras ytor, vilket i kombination med den subtraktiva mönstring och sekventiell sam-odling presenteras i detta protokoll möjliggör skapandet av komplexa cell- och cell-matrix mönster på kultursubstrat. Den mångsidighet och kontrollen som tillhandahålls av hHFC-baserad subtraktiv mönstring av cellmonoskikt och möjligheten att utföra DNA-analys på de extraherade cellerna, ger ett kraftfullt nytt verktyg inställd på biologer att utföra rumsligt upplösta studier med cellinteraktioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Microfluidic Probe (MFP) | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research - Zürich | ||
| Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm2 and capable of holding up to 3 ml of media volume |
| Chemicals and cell lines | |||
| Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
| Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
| Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. | |
| DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
| DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
| CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
| CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
| β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. | |
| MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
| Equipment and fluidic connections | |||
| Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
| Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
| Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | Component of pumping station. | |
| Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
| Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
| DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | Controlled using DS-U3 controller unit | |
| Software | |||
| Win - Commander | LANG GmBH, Germany | Stage control software. | |
| Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | Pump control software. | |
| NIS Elements | Nikon, Switzerland | Basic research module for image acquisition and analysis. | |
References
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils. Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).
- Schütze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).
- Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells. Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).
- Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy. Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).
- Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate. J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Multipurpose microfluidic probe. Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. Microfluidics in the "open space" for performing localized chemistry on biological interfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).
- Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient. Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).
- Christ, K. V., Turner, K. T. Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure. Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).
- Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces. Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. A Vertical Microfluidic Probe. Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).
- Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens. Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).
- Pollard, J. W., Walker, J. M. Basic Cell Culture Protocols. , Humana Press. (1997).
- Mitry, R. R., Hughes, D. R. Human cell culture protocols. Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).
- Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. Quantitative analysis of cell detachment by shear stress. Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).
- Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization. Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).
- Tasoglu, S., Demirci, U. Bioprinting for stem cell research. Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).
