Summary
Este protocolo se describe el uso de espectrofotometría ultravioleta para detectar estructuras reflectantes sobre los organismos (en este ejemplo, el sailfin Molly Poecilia Poeci) y describe las pruebas de opción dicotómicas para los peces que permiten hacer inferencias sobre el papel de las señales ultravioletas durante la selección de pareja.
Abstract
Muchos organismos utilizan señales y señales más allá de la sensibilidad humana durante las interacciones sociales. Es importante tener en cuenta cómo los organismos perciben su mundo cuando se trata de entender su comportamiento y ecología. La sensibilidad al espectro ultravioleta (UV, a 300 - 400 nm) se encuentra a través de múltiples géneros de aves, peces, reptiles, anfibios e incluso mamíferos. Este protocolo describe una técnica para el examen de organismos para la presencia de estructuras que refleja los rayos UV y un método para probar si estas señales se utilizan como señales sociales en el contexto de la elección de la pareja. Se utiliza un espectrofotómetro para detectar la presencia de reflectancia UV y la variación en la intensidad de reflexión entre los individuos y sexos. Un ejemplo de esta técnica se presenta en el cual una prueba de elección de pareja dicotómica expone a los individuos sexualmente receptivas a las personas del sexo opuesto cuya apariencia visual puede ser manipulado por los filtros que, o bien transmiten espectro UV o bloquear longitudes de onda completa. Estasistema permitió la determinación de que mollies sailfin femeninos, pero no de sexo masculino, (Poecilia Poeci) estaban usando marcas UV como parte de sus decisiones de apareamiento. Este tipo de estudios sirven para ampliar nuestro conocimiento de la gama de organismos que utilizan los rayos UV y dar una idea de cómo UV juega un papel importante en sus vidas.
Introduction
La comprensión de las señales y las señales utilizadas en las interacciones sociales de los animales nos permite comprender la variación fenotípica dentro y entre especies. Esta variación juega un papel importante en los procesos evolutivos como la divergencia de la población, la selección sexual, y la especiación. A menudo, sin embargo, los investigadores se limitan a la exploración de las señales más evidentes a los sistemas sensoriales humanos, especialmente aquellos dentro de los reinos visuales o auditivos. El uso de espectrofotometría, sin embargo, nos permite ampliar nuestras investigaciones más allá del espectro visible humano y en longitudes de onda que pueden ser importantes en las interacciones sociales en otras especies.
En particular, la comunicación de corto alcance proporcionada por la luz ultravioleta (UV, a 300 - 400 nm) de sensibilidad tiene el potencial de ser muy ventajoso durante la elección de la pareja 1. Muchos depredadores visuales de caza de aves y peces, por ejemplo, no son capaces de detectar la radiación UV. En los sistemas en los machos muestran elaboradamentea las hembras, los machos estos reducirían el riesgo de depredación manteniendo al mismo tiempo su capacidad para atraer a sus parejas mediante la explotación del espectro UV en lugar de desarrollar señales detectables en el espectro visible 2,3 .. Si uno no tiene en cuenta la posibilidad de que los organismos están comunicando entre otros utilizan estos "canales de comunicación privados", los conductores significativos de comportamiento y la evolución pueden pasarse por alto.
Este protocolo describe una investigación sobre el uso de señales UV para la elección de pareja en el sailfin molly, Poecilia Poeci, un pez que ha polígama capacidad de detectar los rayos UV o utilizar marcas UV conocido ningún anterioridad. Esta especie de pez tiene una gran proximidad filogenética de otros peces vivíparos sensibles a UV 4 y hay pruebas de que P. microspectroscopic latipinna, junto con otras especies tales como P. Molly mexicana y P. formosa, posee una clase de conos (células fotorreceptoras responsables de covisión lor) que son más sensibles a las longitudes de onda UV 5. En esta especie con dimorfismo sexual, la elección femenina ha jugado un papel importante en la evolución de las aletas de colores brillantes y agrandamiento de los machos 6-9. Esta metodología nos permite explorar ya sea UV es un medio adicional por el cual las hembras evaluar la calidad masculina.
La detección y medición de las marcas de UV en P. Poeci usando un espectrofotómetro con una sonda de fibra óptica se detalla aquí. Además, si mollies hembra receptiva asocian diferencialmente con machos vistos a través de un filtro óptico de transmisión de luz de espectro completo, incluyendo la radiación UV-A ([UV +]; 320-700 nm) y los machos vistos a través de un filtro de bloqueo de UV-([UV]; 400 - 700 nm) se discute. Este método tiene amplias aplicaciones para el descubrimiento de patrones de sensibilidad UV y el color de los peces y otros organismos, permitiendo la investigación de una variedad de preguntas que implican UV y su papel en el comportamiento.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Ohio Wesleyan.
1. Registro de reflectancia UV de pescado usando un espectrofotómetro
- Calibrar un espectrofotómetro y fuente de luz con un estándar blanca conocida en todo el rango de longitudes de onda que va a medirse según las recomendaciones del instrumento o de software.
- Anestesiar pescado colocando en una solución de 0,5% de acetato de 3-aminobenzoato de metano sal de ácido sulfónico (MS-222) tamponada con una cantidad igual de bicarbonato de sodio hasta que el pescado no responde. Una vez que no responde, inmediatamente coloque el pescado sobre un fondo negro, no reflectante. Nota: EM-222 es potencialmente tóxico, y los guantes deben ser usados en todo momento.
- Tomar todas las medidas en un cuarto oscuro para minimizar el exceso de luz más allá de la de la fuente de luz del espectrómetro.
- reflectancia medida usando una sonda de fibra óptica sujeta contra el cuerpo del organismo. HacerSeguro para formar un ángulo de 45 ° consistente entre la fibra óptica y el cuerpo, como se incluye en algunos diseños de sonda. Nota: Para mantener la coherencia de medición, puede ser deseable promedio a través de varias exploraciones (2 - 5) por región del cuerpo.
- Grabar datos de reflectancia con software de análisis de reflectancia adecuada. Nota: El software utilizado aquí se establece en: integración en el tiempo = 2.000 seg, escaneos promedio = 2, y el suavizado de píxeles = 5. Los datos se copia y se pega a una hoja de cálculo.
- Repetir en múltiples áreas del cuerpo para determinar la presencia o ausencia de reflectancia UV y la gama de la variación fenotípica en todos los organismos. Nota: los análisis preliminares pueden ser necesarios para determinar que, en su caso, las zonas del cuerpo muestran consistentemente marcas UV.
- Volver a los peces a un acuario de sujeción bien oxigenada hasta que esté totalmente recuperado, como lo demuestran los latidos normales opérculo y comportamientos de natación. Nota: un protector comercial para restaurar el revestimiento mucoso al cuerpo puede añadirse para ayudar en la recuperación de la piel.
- Repscomer a través de múltiples individuos, incluyendo ambos sexos, si se desea.
- En la hoja de cálculo en el que todos los datos han sido copiados, los datos de la trama usando un diagrama de dispersión, con reflectancia en el eje Y y longitud de onda en el eje X. picos de amplitud en el rango UV (300 - 400 nm) indican la presencia de reflectancia UV sobre los peces.
2. Ensayos de acoplamiento dicotómicas
NOTA: Realizar observaciones de control, en el que los peces focal, filtros UV y filtros opacos están en su lugar. En estos ensayos, cuando se quitan los filtros opacos, pescado focal estará expuesto a las partes del tanque que muestran la presencia y ausencia de luz UV, pero que carecen de potenciales socios de apareamiento. Para más detalles sobre la validez de las pruebas de opción dicotómicas en este experimento ver Palmer y Hankison (2015) 10, aunque tenga en cuenta que estas pruebas también tienen inconvenientes 11.
- Utilice individuos sexualmente receptivas como organismos de coordinación. Utilice femenina P. Poeci <48 horas después del parto 5 unand machos aislados durante al menos 24 horas antes de la prueba para mejorar la probabilidad de motivación sexual.
- Coloque un solo individuo focal en un área neutral adyacente a la elección de dos compartimentos. Para P. Poeci, use un ensayo en el acuario 75,7 L (30,5 cm x 30,5 cm x 75 cm; Figura 1) dividido en tres secciones por plexiglás tabiques transparentes, formando un área central para el individuo focal flanqueado por dos compartimientos elección de igual tamaño. Asegúrese de que no hay indicios de agua o olfativas son compartidos entre las secciones de tanques individuales. Repita el proceso para observar cada individuo.
Figura 1. Configuración Experimental acuario Un acuario rectangular dividida en tres secciones:. Una zona central que llevó a cabo el individuo focal y dos compartimentos finales que contenían pares de objetos (la figura muestra una mujer en el medio con machos de objetos en los extremos). fil intercambiablestros que, o bien reflectancia UV bloqueado o permitido podría ser colocado sobre las mamparas de cristal que dividen las secciones macho y hembra del acuario. Esta cifra se modificó a partir de Palmer y Hankison (2015) 10. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Bajo condiciones de luz de espectro completo (iluminación cuyo espectro se extiende en el UV-A), aislar una pareja de apareamiento potencial en cada compartimento final (compartimiento de elección) del acuario de prueba. Asegúrese de que los socios potenciales de apareamiento se parecen entre sí lo más cerca posible de las características de tamaño, coloración y visualización, por lo que la principal diferencia entre los dos compañeros de apareamiento aislados es si aparecen detrás de un filtro que bloquea o transmite la luz UV.
NOTA: Puede ser preferible para grabar reflectancia en el espectro visible para permitir la mejor coincidencia de colores posible, alaunque en este caso a juego hecho por ojo. - Aclimatarse individuos menores de aislamiento visual (filtros opacos) durante 15 minutos. Garantizar que la radiación UV + y - filtros están en su lugar en este momento. Tras la aclimatación, retire los filtros opacos. Para asegurar que los sesgos secundarios no están presentes (preferencia inherente para un lado del tanque, independientemente de objeto), asignar aleatoriamente el + UV y UV - lados del tanque para cada cada ensayo.
- Registrar la cantidad de tiempo que pasa el individuo focal dentro de las zonas de preferencias específicas (zonas cercanas a los compartimentos de la elección, en este caso aproximadamente dos cuerpos longitudes estándar) mediante el uso de cronómetros. Para los peces hembra, ésta es la cantidad de tiempo que pasa cerca de cada uno de dos machos, y viceversa para los peces focal masculina.
NOTA: Software de grabación de eventos también se puede utilizar para la grabación. Quince minutos ensayos se utilizaron en este experimento y el pescado que no visitaron cada zona de preferencia al menos una vez fueron excluidos de los resultados como que no responde. - Registrar y analizar el tiempo que peces pasan casi vacío UV y UV - + compartimentos para asegurarse de que no hay un sesgo inherente hacia un entorno de iluminación particular que puede influir en la elección de apareamiento de los peces. Utilizar pruebas t pareadas para determinar si las personas prefieren una condición UV en particular.
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Representative Results
Las figuras 1 y 2 muestran el acuario preferencias de apareamiento configurar y sitios de medición UV para nuestros experimentos.
Medición de la reflectancia UV permitió la determinación de que P. Poeci sí poseen características UV, especialmente a lo largo de los lados de sus cuerpos (Figura 3), además de la variación individual en estos rasgos. Una vez que se encontraron rasgos UV, las pruebas revelaron que la hembra, pero no de sexo masculino, P. latipinna utilizar estas características en sus decisiones de apareamiento (Mujer: 15 t = 4,08, p = 0,001; Hombres: 14 t = 0,67, p = 0,517; Figura 4). Que ambos sexos poseen rasgos UV, pero que los rasgos son utilizadas únicamente por las mujeres como parte de la preferencia compañero puede indicar un papel de estas características en otras interacciones sociales, tales como los bancos de arena o de forrajeo, en P. Poeci.
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Figura 2. Ubicaciones en el Poeci Poecilia que se realizaron mediciones de reflectancia UV. Regiones se determinaron inicialmente a partir de ensayos de reflectancia preliminares con muestras tomadas de reflectancia a través de casi todas las regiones del cuerpo. De 1 - 3, DF (aleta dorsal) y CF (aleta caudal) se refieren a regiones del cuerpo que se muestran en la Figura 3 Esta figura es una modificación de Palmer y Hankison (2015) 10.. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Media espectros de masculino y femenino Poecilia Poeci. Los gráficos muestran las medias sreflectancia pectral mide en cinco lugares (zonas laterales, aleta caudal, aleta dorsal) SE. Las áreas dentro de los recuadros representan la reflectancia en el espectro UV. Esta cifra se modificó a partir de Palmer y Hankison (2015) 10. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Media Asociado tiempos de machos y hembras. Los gráficos muestran el tiempo medio de SE que hembras y machos pasaron cerca de compartimentos masculinos vistos a través de los rayos UV + y filtros UV durante el control y pruebas experimentales. Esta cifra se modificó a partir de Palmer y Hankison (2015) 10. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Espectrofotometría tuvo éxito en la identificación de marcas UV sobre P. Poeci. Ambos sexos de P. Poeci poseen marcas UV a lo largo de sus lados. Además, algunos machos tenían marcas de UV en sus aletas dorsales, rasgos que antes se consideraban importante en las preferencias sexuales femeninos 7.
Recomendamos el uso de espectrofotometría UV como mecanismo para detectar la presencia de marcas UV. La prueba adicional podría determinar su papel en las interacciones sociales, incluyendo las preferencias de apareamiento (como se detalla aquí). Alternativamente, las características UV podrían influir en los bancos de arena, individual, sexo, o el reconocimiento de especies, o interacciones intrasexuales 3, 12-15.
A pesar de la utilidad de espectrofotometría a una mejor comprensión de las características UV de organismos, especialmente en relación con su comportamiento social, hay algunos pasos críticos necesarios para entender completamente los comportamientos, y algunas limitaciones a lo que puede be concluyó. Todos los experimentos deben probar si los individuos focales tienen preferencia por UV + o UV - ambientes mediante la inclusión de controles que no tienen los individuos de prueba en los tanques de la elección de acompañamiento, especialmente en lo que bloquea los rayos UV puede causar cambios en el "brillo" o luminancia los organismos observan. Mientras luminancia no se ha demostrado que influyen en la preferencia femenina en especies estrechamente relacionadas con P. Poeci 16-18 datos adicionales que detallan el papel de las pruebas de brillo y de preferencia se abordó en un estudio previo 19 y podría ser un paso importante para garantizar que la preferencia no se basa en los cambios de brillo. Alternativamente, las diferencias en el flujo de iluminación (brillo total por unidad de tiempo) se pueden compensar, lo que permite un mayor control de las condiciones de iluminación en sistemas en los que esto es motivo de preocupación 2,20.
Además, para las pruebas de selección de pareja, los individuos elección debe corresponder lo más cerca posible detamaño y coloración (también conocido como el atractivo), de modo que la elección refleja con más fuerza preferencia por UV o UV + -. Las técnicas alternativas que permiten a un solo individuo que se observa bajo los rayos UV y UV + - pueden ser útiles para algunos organismos 21. Estos estudios pueden permitir el control de las diferencias en el comportamiento individual (como el mismo individuo se observó bajo UV y UV + - condiciones al mismo tiempo). Si bien no hemos visto diferencias de comportamiento entre nuestros peces en nuestro diseño experimental, este aspecto puede ser importante para otros organismos o diseños experimentales. Además, los estudios que retoman el examen hembras individuales mientras que el cambio de los lados de los filtros UV 2, o que los filtros de conmutación de mitad de camino a través de una prueba individual también serían útiles, tanto para controlar el sesgo lateral individual. Por último, mientras que los ensayos de espectrofotometría y las preferencias de apareamiento pueden revelar estos aspectos del fenotipo de un organismo, el protocolo aquí haceres no tener la capacidad de determinar completamente el significado de los rasgos UV y lo que pueden ser reveladores de la céntrica individuos. ensayos de aptitud para comprender cómo los rasgos UV se ven afectados por el desarrollo, la herencia, las condiciones ambientales (como la previsibilidad de los alimentos o de los depredadores), u otros factores serían útiles para entender aún más el significado y el papel de las características UV.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrophotometer, P1000 | Ocean Optics | newer models are availabe | |
| DT 1000 xenon UV light source | Ocean Optics | newer models are availabe | |
| Ocean Optics Overture Software | Ocean Optics | newer software is available | |
| R200-Angle-UV bifurcated fiber-optic probe (Guided Wave) | Ocean Optics | newer models are availabe | |
| Certified reflectance standard, white | labsphere | ||
| 75.7 L Aquarium, divided | Experimental Builder | ||
| Full Spectrum Bulb | Nature's Sunlight | ||
| UV blocking sheet | GAM UV Sheet |
References
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