Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

בשלב הדמיה כמוני מולטימודליות עם דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי מדויקת מעריך דלקת מעיים ו אפיתל ריפוי פצעים

Published: September 13, 2016 doi: 10.3791/54460
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, *3, *1
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Institute of Palliative Care, University Hospital Münster, 3Biomedical Technology Center, University of Münster, 4Department of Gastroenterology, Klinikum Bielefeld
* These authors contributed equally

Abstract

שכיחות מחלות מעי דלקתיות, כלומר, מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, גדל באופן משמעותי בעשור האחרון. האטיולוגיה של IBD נותרת עלומה ואסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על הדיכוי הנוקב של מערכת החיסון. פיתוח טיפולים שמתמקדים דלקת מעיים וריפוי הפצע אפיתל יכול לשפר באופן משמעותי וניהול של IBD, אך זה דורש זיהוי מדויק של שינויים דלקתיים. נכון לעכשיו, לתרופות פוטנציאליות בדרך כלל מוערכות באמצעות מודלים של בעלי חי in vivo או עם טכניקות המבוססות תרבות תאים במבחנה. בדיקה היסטולוגית בדרך כלל דורשת את התאים או רקמות של עניין להיצבע, אשר עשוי לשנות את מאפייני מדגם ויתר על כן, הפרשנות של ממצאים יכול להשתנות לפי מומחיות חוקרת. מיקרוסקופיה הולוגרפית הדיגיטלית (DHM), מבוסס על זיהוי של עיכוב מרחק אופטי, מאפשרתכתם ללא הדמיה בניגוד כמותית שלב. זה מאפשר את התוצאות להיות מתואמים ישירות עם פרמטרים biophysical מוחלט. אנו מדגימים כיצד מדידת שינויים בצפיפות רקמה עם DHM, המבוססת על מדידה מקדמת שבירה, יכולה לכמת שינויים דלקתיים, ללא כתמים, בשכבות שונות של דגימות רקמה גסות מעכברים ובני אדם עם קוליטיס. בנוסף, אנו מדגימים ניטור ללא תווית multimodal רציפה של ריפוי פצע אפיתל במבחנה, אפשרית באמצעות DHM באמצעות הקביעה האוטומטית הפשוטה של האזור הפצוע ונחישות סימולטני של פרמטרים מורפולוגיים כגון מסה יבשה ועובי שכבת תאים נודדים. לסיכום, DHM מייצג כלי רב ערך, רומן וכמותיים להערכת דלקת מעיים עם ערכים מוחלטים עבור פרמטרים מותרים, כימות פשוטה של ריפוי פצע אפיתל במבחנה ולכן יש פוטנציאל גבוה u אבחון translationalse.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBD), כלומר, קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD) הם מחלות דלקתיות אידיופטית של מערכת העיכול 1. מחקר לתוך הפתופיזיולוגיה הבסיסית של IBD והערכה תרופות פוטנציאליות חדשות או גישות אבחון חדשות ומתקדמות במיוחד בעל חשיבות. בשני המחקר הבסיסיים בניהול הקליני של חולי IBD, רירית המעי הפכה למוקד של תשומת לב 2,3. רירית מייצג גבול אנטומיים, שבו יחסי הגומלין בין חיידקים commensal, תאי אפיתל מרכיבים תאיים שונים של מערכת החיסון במעי לתזמר הבטן הומאוסטזיס 4,5. עם זאת, בחולים במחלות מעי דלקתיות, דלקת מעיים בלתי מבוקרת ומתמשך מוביל הרירית נזק, לזיהוי כמו כיבים או היצרות, אשר בסופו של דבר יכול להגיע לפסגה בתוך התפלגות תפקוד המחסום אפיתל, שבעצמה מחריף המקומי דלקת 6.

7. אפיתל ריפוי פצע ניתן לדמות ב פצע במבחנה בריפוי מבחנים במודלי Murine של דלקת מעי 8,9. הוא במבחנת in vivo יש גישות חסרונות, המגבילים את הדיוק של הערכת ניסוי. ב מבחני חוץ גופייה, כמו מבחני שריטה קלסיים, דורשים נהלים מכתימים ממושכים או transfection עם chromophores ניאון. הם מוגבלים לעתים קרובות על ידי התפשטות הניטור של תאים הרציף שלהם והגירו כי לא יכול להיות אוטומטית 10. מודלים בשנת vivo, כגון נתרן סולפט dextran (DSS) קוליטיס -induced, לעתים קרובות חסר-outs לקרוא חזק, בין שאר בשל הווריאציה המשמעותית לראות בסמני מעבדה, maמלך כגון סמנים ראויים להעריך חומרת קוליטיס 11,12. ניתוח היסטולוגית של הרירית המוסתת כרגע עדיין הגישה התקפה ביותר כדי לקבוע חומרת קוליטיס אבל זה, כמו במבחנת מבחני ריפוי פצע אפיתל, דורש מכתים והוא תלוי המומחיות של חוקר 13.

לאחרונה מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלי (DHM), נגזרת של מיקרוסקופיה שלב כמותי 14, זוהה כלי שימושי להערכת ריפוי פצעים אפיתל במבחנה ובחי 15. DHM מאפשר הערכה של צפיפות רקמת ידי מדידת עיכוב מרחק אופטי (OPD) , 16-18 וכימותי שינויים ברקמה המתלווה לדלקת 19 אשר אבחן רומן סרטן הסיכויים. בנוסף, DHM מאפשר ניטור של דינמיקת מורפולוגיה תאים על ידי קביעת עובי תא, שטח פן מכוסה תא תאי כמות תוכן (חלבון) מבחני חוץ גופית, DHM גם מאפשרת ניתוח של תהליכים פיזיולוגיים, למשל, חדירות מים הסלולר על ידי הערכת שינויים נפח תא ועובי 21,22. יתר על כן, מדידות DHM יכולות להיות אוטומטיות המונעת הטיה במדגם קשור חוקרת.

הנה, אנחנו מדגימים את השימוש DHM במודל Murine של דלקת מעיים, וגם ליישם DHM ניתוח של דגימות רקמות אדם לניטור כמותי של ריפוי פצעים כמו assay ללא תווית במבחנה. ראשית, אנו מעריכים שינויים דלקתיים של שכבות קיר גסות שונות בעכברי colitic וחתכי רקמות מבני אדם עם IBD. לאחר שתיאר את ההליך בשלב הדמיה כמותי DHM, אנו מספקים הנחיות מפורטות לשימוש מרכיבי מיקרוסקופ, הכנת קטעי רקמה וגם לתאר את ההערכה של תמונות שלב כמותית רכשה.

לאחר מכן, אנו מראים כי DHM יכול להיות UTIlized לניטור multimodal רציף של ריפוי פצעים אפיתל במבחנה, ולתאר את ניתוח מאפיינים הסלולר כמו עובי שכבת תאים, מסה יבשה ונפח הסלולר לתת תובנה שינויי תא תרופה מושרה ואת פיסיולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה האזורית (Landesamt für נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, גרמניה) על פי חוק צער בעלי חיים הגרמני. ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת מינסטר אישר את השימוש ברקמות אנושיות לניתוח היסטולוגית ומיקרוסקופ.

1. בעלי חיים וחומרים

  1. השתמש נקבה או עכברי זכרים של זן DSS-רגיש נדרש השוקלים 20 עד 25 גר ', ואת הבית על פי חקיקת טיפול בבעלי החיים מקומית. ספק צ'או מיוחד עבור מכרסמים autoclaved שתיית כרצונך מים.
  2. להשרות קוליטיס DSS חריפה על ידי מתן 3% w / v נתרן גופרתי dextran (DSS, משקל מולקולרי: 36,000-50,000 Da) במי ברז autoclaved במשך 5 ימים.
    הערה: עוצמת DSS היא משתנה מאוד בהתאם ליצרן יצווה. בדיקת DSS הספק שסופק על-ידי שלך הראשון לזירוז פעילות המחלה, עבורו daמשקל גוף ily הוא אינדיקטור אמין ואובייקטיבי.
  3. לקבלת ערכה היסטולוגית של דגימות רקמה גסות, להרדים עכברים ידי הֲפָחָה CO 2 (או כפי שצוין על ידי הנחיות לאומיות ומוסדיות) בסוף הניסוי.

2. התקנה ניסיונית-קוליטיס DSS ו חוץ-גופית Wound מבחני ריפוי

  1. תרבות הקמת תא של assay ריפוי הפצע.
    1. לגדל תאי קאקו-2 ב לחות 95% ו 5% CO 2 בסביבה על 37 מעלות צלזיוס. השתמש בינוני RPMI עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
    2. זרע קאקו-2 תאים בצפיפות של 4 x 10 5 תאים / 2 ס"מ על 35 מ"מ צלחות פטרי עם תרבות-הכנס גבוה (ראה תרשים 4 א).
      הערה: הכנס יוצר שני באזורים מכוסי תא כי הם מופרדים עם רווח חינם תא מוגדר המייצג את האזור הפצוע להיות מנותח.
    3. שנה בינונית יומיים לאחר seedinז. בצע על ידי aspirating בינוני שיורית הראשונה עם תא פסולת באמצעות פיפטה אוטומטית, לשטוף עם 100 μl של בופר פוספט (PBS) ולהוסיף בינוני RPMI טרי או בינוני מקופח סרום.
    4. התרבות תאים עבור 24 שעות במדיום סרום מקופח (0.1% FBS) בתוספת 20 בסרום ng EGF / מ"ל ​​או 2 מיקרוגרם mitomycin ג / מ"ל ​​סרום כדי לזהות שינויים בהתנהגות ריפוי הפצע. הוסף בינוני RPMI רגיל לשלוט תאים למשך 24 שעות.
    5. לאחר 24 שעות של תרבות, להסיר ולסלק מוסיף תרבות כמתואר בשלב 3.4 ולבצע DHM.
  2. אינדוקציה של קוליטיס DSS החריף
    1. ממיסים 3 גרם של DSS 100 מ"ל autoclaved מים כדי לקבל 3% (w / v) פתרון DSS. לספק פתרון זה במקום שתיית מים כרצונך עכברים למשך 7 ימים. חישוב 5 מ"ל של פתרון DSS לכל עכבר / יום. לספק מי autoclaved ללא DSS עבור עכברי שליטה כרצונך.
  3. הכנה סעיפי cryostatic של murine ומעי גס אנושי
    1. להרדים עכברים ידי הֲפָחָה CO 2 בסוף הניסוי.
    2. לנתח את הבטן בבעלי החיים על ידי laparotomy 23. הסר את המעי הגס כולו באמצעות פינצטה בזהירות לחתוך את הקצה ileal רקטלית באמצעות מספריים כירורגיות. חותכים את המעי הגס עם מספריים longitudinally מן cecal עד הסוף רקטלית ולפתוח את המעי הגס. הסר את כל הצואה מן הדגימה באמצעות פינצטה ואחריו שטיפה עם PBS 24.
    3. הכן לחמניות שויצריות ב לגלגל את המעי גס כולו עם כותנת ניצן longitudinally מן cecal עד הסוף רקטלית עם הרירית המעוקלת פנימה. שבץ דגימות גסות חיתוך טמפרטורה אופטימלית (אוקטובר) מתחם והישאר קפוא ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
    4. הטמע רקמה גסה אנושית דגימה כירורגית במתחם אוקטובר טמפרטורת חיתוך אופטימלי והישאר קפוא ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
    5. קטעי Cut של 7 מיקרומטר עובי של דגימות אוק-מוטבע-מתחם עם העזרה של cryotoלי ממש לפני הבחינה.
      ההערה: עובי המדגם האופטימלי תלוי התמדת תכונות הפיזור של סוג הרקמה תחת חקירה. עבור הניסויים שתוארו באמצעות רקמת המעי הגס, פרוסה בעובי> 10 מיקרומטר הגורם לעלייה משמעותית רעש בשל פיזור אור בתמונות בניגוד שלב כמותית DHM, בעוד דגימות של עובי <5 מיקרומטר להראות סיכון גבוה יותר בחיפוש אחר כלים המושרה נזק מתהליך חיתוך קריו.
    6. עבר מדורים לשקופית מובילה אובייקט זכוכית.

3. טכני ציוד, תוכנה ונהלים עבור רכישה והערכה של הולוגרמות הדיגיטלי

  1. מיקרוסקופ הולוגרפי הדיגיטלי הדמית תאים ורקמות כמוני
    1. השתמש במערכת מיקרוסקופ הולוגרפי דיגיטלית מחוץ ציר מאך-זנדר הדמיה תא חי 25, כפי שמוצג באיור 1. ודא מיקרוסקופ מצוידעדשת מיקרוסקופ 10X, הבמה מיקרוסקופ עם בעל לשקפים מובילים אובייקט זכוכית צלחות פטרי בקוטר של 35 מ"מ, תא חימום לשמר טמפרטורה פיזיולוגית על 37 מעלות צלזיוס ותוכנות הדמית שלב כמוני 25.
      הערה: לדוגמה, כמתואר קמפר ואח 26 ו Langehanenberg ואח 27...
      הערה: לחלופין, להשתמש במערכת דומה כי הוא מסוגל לבצע מיקרוסקופ שדה בהיר בשלב הדמיה כמותי של תאי חיים ומגלשות רקמות גזורות.
    2. עדשת קבל מיקרוסקופ נקי עם נייר ניקוי עדשת חומר ניקוי (למשל, אתנול) כפי מומלץ על ידי היצרן של מיקרוסקופ כדי להסיר אבק או זיהומים אחרים.
    3. הפעל את תוכנת רכישת תמונה של המיקרוסקופ DHM, לבחור במצב הדמיה "שדה בהיר" בורר "על" תאורת אור לבנה. ודא קוהלר-illumination של המדגם כפי מומלץ על ידי יצרן מיקרוסקופ תוך שמירה על המדגם בחלון הדמית החיה של תוכנת רכישת תמונה (לחלופין תוכנת רכישת תמונה רגילה יכולה לשמש בשלב זה).
      הערה: עוצמת התמונה צריכה להיות מופצת בצורה הומוגנית בתוך שדה הראייה ואת המיקום המדגם לא צריך לזוז במהלך refocusing האופטי עם כונן המוקד של המיקרוסקופ.
    4. "DHM" בחר במצב הדמיה, להפוך "את" תאורת אור לבן מתג "על" אור הליזר. בדוק כי התאורה עם אור לייזר הוא הומוגני (כלומר, כי עוצמת האור מופץ בצורה הומוגנית בחלון הדמיה חיה של התוכנה הרכישה הדמיה של המיקרוסקופ DHM) ולבחון כי דפוס פרינג הפרעה המוביל מחוץ ציר מופיע עם ניגודיות נאותה תמונות שנתפסו (הולוגרמות דיגיטלית).
  2. הכנת סעיפי cryostat הדמיהעם DHM
    1. קח המדגם (סעיף cryostat על מנשא אובייקט זכוכית, עובי: 7 מיקרומטר, כמתואר 2.3) מהמקפיא. הפשר את המדגם עבור כ -5 דקות ב RT ואווירה נורמלית.
    2. להוסיף 50 - 100 μl פוספט בופר (PBS) כמו הטבעה בינונית על קטע הרקמות בעזרת פיפטה עד שהוא מכוסה לגמרי עם חיץ. מכסה את המדגם עם תלוש כיסוי זכוכית נקיה (עובי זכוכית 170 מיקרומטר).
      הערה: מעל ייבוש יכול לגרום לשינויים משמעותיים של מקדם השבירה ומאפיינים פיזור של המדגם.
    3. ודא התחתון של מוביל הזכוכית להחליק את המכסה מנקה מפני אבק וזיהום אחר שעלולה לגרום פיזור אור. המדגם הוא מוכן לחקירה עם מיקרוסקופ שדה בהיר DHM.
  3. בשלב הדמיה כמותי של סעיפי רקמה עם DHM
    1. הפעל את מיקרוסקופ הולוגרפי הדיגיטלי, לבחור את עדשת מיקרוסקופ 10X הדמיה. הפעל את iרכישת תוכנה קוסמת של המיקרוסקופ DHM ובחר במצב הדמית קובץ בהיר.
    2. מניח את שקף הרקמות כמתואר 2) מחזיק שקופיות מיקרוסקופ, עם להחליק את המכסה מול המטרה מיקרוסקופ.
    3. חלף "על" התאורה בשדה הבהירה של המיקרוסקופ DHM. מקם את המדגם עם הבמה מיקרוסקופ ולהבטיח כי באזור הרקמה של עניין גלוי בחלון ניטור בזמן אמת. לשפר את החדות של התמונה באמצעות כונן המיקוד של מיקרוסקופ.
      הערה: כמו גם השטח של עניין, על שטח של שקופיות ללא רקמה צריכה גם להיות נוכחת שדה הראייה.
    4. לכידת תמונה בשדה בהירה של המדגם הממוקד בחדות באמצעות תוכנת רכישת תמונה.
    5. "DHM" בחר במצב הדמיה, להפוך "את" הארת האור הלבנה ולהפוך "על" הארת ליזר האור. בחר את "זמן החשיפה" להקלטת הולוגרמה מתחת ל -3 msec, להבחין כי holographic מחוץ ציר בשולי הפרעה להופיע עם ניגודיות נאותה בחלון הדמית החיה של תוכנת רכישת הדמיה וללכוד הולוגרמה דיגיטלית.
    6. חזור על שלבי 3.3.3 - 3.3.5 עד מספר מספיק של תמונות שדה בהירות הולוגרמות דיגיטלית של אזורי מדגם השונים הוקלט. רכישת הולוגרמה הושלמה.
  4. הכנת מבחני ריפוי פצעים הדמיה DHM
    1. הפעילו את תא חימום צלחת פטרי של המיקרוסקופ DHM על 1 - 3 שעות לפני תחילת הניסוי כדי להבטיח תנאי טמפרטורה יציבה במהלך המדידות DHM.
    2. הכן שולחן העבודה עם הציוד הדרוש (צלחת פטרי עבור assay ריפוי הפצע מתואר 2.3): טפטפות, פינצטה, מכסה זכוכית עבור צלחת פטרי, 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) שנאגרו תרבית תאים בינוניים עם פיזיולוגיים טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) במשך הכנת המדגם בסביבה סטרילית.
      הערה: 3.
    3. הסר את מכסה הפלסטיק מצלחת פטרי ולהסיר את תרבית תאים בינוניים עם טפטפת. הסר את הסוגר מלמטה צלחת פטרי באמצעות פינצטה.
    4. לשטוף את המדגם 1 - 2 פעמים עם 1 HEPES בינוני מ"ל תרבית תאים שנאגרו על מנת להסיר תאים מתים מרכיבים תאיים הנותרים (למשל, סרום) באזור הפצע. הוסף 2 מ"ל HEPES תרבית תאים בינוניים שנאגרו מכסה את צלחת פטרי עם מכסה זכוכית.
    5. ודא כי מכסה הזכוכית וחלק תחתון צלחת פטרי נוקו מפני אבק וזיהום אחר. לדוגמא מוכנה תצפית זמן לשגות עם DHM.
  5. ניטור רציף multimodal של ריפוי פצעים במבחנה עם DHM
    1. הפעילו את תא חימום צלחת פטרי של המיקרוסקופ DHM על 1 - 3 שעות לפניתחילת הניסוי כדי להבטיח תנאי טמפרטורה יציבה במהלך המדידות DHM.
    2. חלף "על" מיקרוסקופ הולוגרפי הדיגיטלי, בחר את עדשת 10X מיקרוסקופ הדמיה. הפעל את תוכנת רכישת תמונה של המיקרוסקופ DHM ובחר במצב הדמיה "שדה בהיר". ודא כי תא חימום צלחת פטרי פועל בטמפרטורה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס).
    3. מניחים את צלחת פטרי עם assay ריפוי הפצע, הכין כמתואר 4), בתא חימום של המיקרוסקופ DHM.
    4. בחר מצב הדמיה בשדה בהיר ומקם את המדגם עם הבמה מיקרוסקופ תוך התבוננות אותו בחלון ניטור בזמן אמת של התוכנה רכישת התמונה של המיקרוסקופ DHM. שים לב כי האזור הרצוי של המדגם מופיע ממוקד בחדות תחת תאורה של אור לבן.
    5. צלם תמונות שדה בהירות של אזורים השונים של המדגם (אזור הפצע או בסביבותיה עם תאים ומחוברים) תחת לבןתאורת אור עם תוכנת רכישת תמונה ומראה מסמך, צפיפות תאים והומוגניות.
    6. "שדה בהיר" בחר במצב הדמיה של המיקרוסקופ DHM. בחר אזור הפצע מתאים תחת תאורה אור לבן בחלון ניטור בזמן אמת עם תוכנת רכישת התמונה של המיקרוסקופ DHM. ודא שאזור הפצע הוא ללא תאים מתים ולא שרידים בסרום, ולהבטיח כי שני הצדדים כוללים שכבת תאים הומוגנית אחת, רצוי עם גבולות ישר.
    7. לכידת תמונת אור לבנה של אזור הפצע הראשוני במצב הדמיה בשדה בהיר עם תוכנת רכישת תמונה של המיקרוסקופ DHM.
    8. הפעל "off" תאורה אור לבן, בחר "DHM" מצב מתג "על" תאורת לייזר. בחר זמן חשיפה של מתחת ל -3 msec עבור הולוגרמה הקלטה (להבחין כי בשולי הפרעה מחוץ ציר הולוגרפית להופיע עם ניגודיות נאותה בחלון הדמית החיה של תוכנת רכישת תמונה של Tהוא DHM מיקרוסקופ) וללכוד הולוגרמה דיגיטלית.
    9. לכידת הולוגרמה מדגם במצב DHM עם תוכנת רכישת התמונה משחזרת תמונה שלב כמותית עם תוכנת שחזור של המיקרוסקופ DHM כדי לבדוק את איכות התמונה.
    10. בחר השהיית זמן מתאים (למשל, 3 - 5 דקות) לרכישת הולוגרמה זמן לשגות עם תוכנת רכישת התמונה של המיקרוסקופ DHM.
    11. בחרו במצב רכישת זמן לשגות של התוכנה רכישת התמונה שבה המדגם הוא מואר רק עם אור לייזר במהלך הרכישה הולוגרמה.
    12. התחל התצפית DHM זמן לשגות של assay ריפוי הפצע.
    13. עצור את רכישת זמן לשגות לאחר הזמן המיועד, לבחור במצב הדמיה בשדה בהיר ולתעד את המראה הסופי של המדגם תחת הדמיה אור לבן.
  6. לשחזר הולוגרמות דיגיטלית של רקמות גזורות ולקבוע את מקדם השבירה הממוצע כפרמטר לכמתצפיפות רקמה
    1. לשחזר תמונות שלב כמוני מן הולוגרמות הדיגיטלית של רקמות גזורות עם התוכנה של המיקרוסקופ DHM, למשל, כמתואר קמפר et al. 26 ו Langehanenberg et al. 27.
    2. קבע את ניגוד שלב ממוצע Δφ בשכבות רקמות שונות (אפיתל, submucosa, stroma) באזורים נבחרו כראוי אינטרסים (ROIs) 19.
    3. קבע את מקדם השבירה של מדיום ההטבעה באמצעות refractometer או לחלופין באמצעות ערך מתאים מהספרות. (ערכי מקדם שביר עבור תקשורת הטבעה אופיינית: n מים = 1.334 28, n בופר פוספט (PBS) = 1.337 29, n תא בינוני תרבות = 1.337-1.339 29,30).
    4. חשבתי את המדדים השבירים של שכבות רקמה שונות לעומת שלב ממוצע ערכי 19
      משוואה 1 הערה: ב EQ. 1 λ הוא אורך הגל של אור הליזר (כאן: λ = 532 ננומטר), D העובי של רקמות הגזורות (כאן: 7 מיקרומטר) ו- n המדיום הוא מקדם השבירה של מדיום ההטבעה (כאן: n בינוני = n PBS = 1.337, שייקבע על ידי אבה-Refractometer).
  7. לשחזר ולהעריך הולוגרמות דיגיטלית מן לשגות זמן ריפוי פצע תצפית סדרה
    1. לשחזר תמונות שלב כמותית מסדרת הולוגרמה הזמן לשגות שהושגה במהלך תצפית ריפוי פצע עם תוכנת מיקרוסקופ DHM 26,27.
    2. נרמל כל סדרה של תמונות שלב כמותית לדימוי עם ניגודיות שלב מקסימלית.
    3. קבע את התחום ג S כי הוא מכוסה על ידי התאים את התמונות בשלב DHM כמותית על ידי פילוח תמונה, אשר יכול להיות לכלנוצר באמצעות מאבחן תא תוכנה חופשית (www.cellprofiler.org 31).
    4. חשבתי את ניגוד שלב הממוצע של התא בתאי Δφ ב ג באזור S.
    5. תחזר את DM המסה היבש הסלולר מתא Δφ בניגוד שלב ממוצע התחום ג S 15
      משוואה 2 (2)
      הערה: המשוואה 2 DM מציין את המסה היבשה הסלולר, ג S מציג את האזור כי היא נכבשה על ידי התאים α = 0.002 מ '2 / קילו.
    6. קבע את התא מקדם השבירה n הסלולר אינטגרלי ואת מקדם השבירה של המדיום n תרבית תאים בינוניים. לקבוע תא n בנפרד באופן ניסיוני מתאי מושעה כמתואר 30 ולמדוד בינוני n עם refractometer. Alternaבקנייה להשתמש בערכי ספרות עבור תא n 30 ו n 29,30 בינוני.
    7. חשב את התא ד עובי התא הממוצע מ λ, תא Δφ, n התא n בינוני 26,32
      משוואה 3 (3)
      הערה: ב EQ. 3 תא הפרמטר d הוא עובי התא הממוצע, λ מציין את אורך גל האור של אור הליזר, תא Δφ מציין את ניגוד השלב הממוצע, ו- n תא n בינוני הם מקדמים שבירת הסלולר האינטגרלי ואת מקדם השבירה של המדיום שמסביב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התקנה טיפוסית הדמיה DHM עבור דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופית (DHM)

כדי לבצע הדמיה בשדה בהיר והדמיה בניגוד שלב כמותית DHM, אנחנו מוחלים מיקרוסקופ הפוכה כמתואר ב איור 1. המערכת שונתה על ידי הצמדת מודול DHM, כפי שתואר קודם לכן 25. הולוגרמות דיגיטלית נוצרו על ידי תאורה המדגם עם האור של תדר-הוכפל Nd: YAG לייזר λ = 532 ננומטר) בתצורת מאך-זנדר (איור 1 א). רקמות גזורות נותחו vivo לשעבר בשקופיות מובילות זכוכית. בתרביות תאים חיים נצפו מנות מיוחדות פטרי לריפוי פצעים התבוננות כפי שמוצג באיור. 1 ג. הדגימות היו צלמו תאורת שידור באמצעות 10X מילעדשת croscope (NA = 0.3) ו עדשת צינור. מצלמה המכשיר תשלום מצמידים שימש כדי להקליט את דפוסי התערבות (הולוגרמות מחוץ ציר דיגיטלי) שנוצר על ידי superimposing תמונה לדוגמה (גל האובייקט) עם גל התייחסות מוטה מעט. ההולוגרמות שנתפסו דיגיטלית שוחזרו ע"י שלב מרחבית הסטה שחזור בשילוב עם autofocusing הולוגרפית אופציונלי 26,33.

הערכת Murine DSS-Induced קוליטיס ידי DHM

קוליטיס חריפה הושרה בעכברים על ידי הממשל של 3% w / v נתרן גופרתי dextran (DSS) במי שתייה במשך 5 ימים. הביטוי ומהלך קוליטיס היה ואחריו ניטור עבור הרזיה פרוגרסיבי בקבוצה שטופלו DSS בהשוואה לקבוצת הביקורת. (איור 2 מותאמים 19). אנדוסקופית, בינונית עד חמורה colitis נצפתה כפי שמשתקף עיבוי של קיר המעי הגס, שינויים של הדפוס וסקולרית (למשל, דימום ספונטני, חץ אדום), מהפרשות הפיברין (חץ לבן) גרעיניות של המשטח הרירי (איור 2 ב). ערכה היסטולוגית קונבנציונלית של hematoxylin ו eosin (HE) מוכתם סעיפים במעי גסים גילו בצקת ניכרת הקיר הגס של DSS שטופל פסוקי חיות בקרה, המצוי בעיקר ב submucosa (חץ אפור איור 2 ג). מקביל תמונות בניגוד שלב כמותית DHM ומפות מקדמות שבירה קשורות לאחזר באמצעות משוואת 1, מתאר אף שינויי הרקמות הנ"ל. בנוסף, מקדם השבירה, מקודד 256 רמות אפור, הצביעו על הבדלים בצפיפות בשכבות רקמות כולל האפיתל (חץ לבן) ואת stroma (חץ שחור) ב יליד, דגימות רקמה בלא כתם (איור 2 C). מקדם השבירה צומצם משמעותית באפיתל, כמו גם ב submucosa ו stroma של עכברים colitic לעומת קבוצת הביקורת הבריאה (איור 2 E). בנוסף, נמצאים קשר משמעותי בין הפרמטר הקליני (פסד יחסי של משקל גוף) ואת הפרמטר הפיזי המוחלט (מקדם שבירה) יכול להיבחן (R 2 ליניארי = 0.64; האיור 2 D, עיבוד 19).

הערכת מחלת קרוהן בבני אדם על ידי DHM

מחלת קרוהן מזוהה לעתים קרובות על ידי שינויים דלקתיים מדהים של לדופן המעי, זוהה על ידי אנדוסקופיה העיכול. תכונות מקרוסקופית מאפיין מהוות פירוט של המשטח הרירי, כיבים אורכים עם exudat הפיבריןיונים (המכונים גם "שבילי חילזון") וספונטניים דימום (איור 3 א). ערכה היסטולוגית ידי מכתים HE של דגימות רקמת מחולים עם CD הפעיל בדרך כלל חושפי קיר גס וכן בצקת submucosal. מקביל תמונות בניגוד שלב DHM כמותית ומפות מקדמות שבירה קשורות לאחזר באמצעות משוואת 1 גם זוהה נפיחות דלקתית בתיווך שיפור / החומה הגסה, כאן לראות האפיתל (איור 3 ב '). יתר על כן, מקדמת השבירה כפרמטר מוחלט, גם צומצמה משמעותי בכל שכבות הקיר (אפיתל, submucosa ו stroma) בדגימות רקמה גסות מחולה עם CD הפעיל הפסוקים האלה ברמיסיה (איור 3 ג).

ניטור מולטימודליות של ריפוי פצעים חוץ-גופית

קאקו-2 תאים לריפוי פצעי מבחנים בוצעו באמצעות צלחת פטרי מיוחדת לספק תנאים סטנדרטיים. המנה צויד הכנס תרבות להרכיב שני חדרים שונים, אשר מופרדים על ידי פער של 500 מיקרומטר (איור 4). כדי לדמות סביבות פיסיולוגיות שונות, תאים נבדקו גם ללא טיפול, מגורה על ידי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) או עכבות עם ג mitomycin. התקנת DHM מאפשרת ניטור רציף של ריפוי הפצע תהליך לאורך זמן, מתואר כאן דימויים בניגוד שלב כמותית נציג DHM (מקודד 256 רמות אפורות) לאחר 0, 22.5 ו -45 שעות לאחר תחילת הניסוי (איור 4 ב). מקבילי מגרשי 3D פסאודו שווא בצבעים באיור 5 ולתאר את ההתפתחות מרחבית של עובי שכבת תאים בשלושה di mensions. בהתבסס על עיכוב האורך האופטי הנתיב, מקדמת שבירה הסלולר ומשוואות 2 ו -3, DHM מאפשר הערכה דינמית סימולטני של הגירה, שגשוג ומורפולוגיה ידי ניטור זמני של מאפיינים סלולריים כמו שטח פן מכוסה תא, עובי תא ממוצע ומסה יבשה הסלולר ( איור 4 ג). לסיכום, הנתונים באיור 4 להמחיש כי תוצאות סימולצית EGF בתוך הגירה מהירה של תאים לאזור הפצע, בתוך עובי תא ממוצע גדל במסה יבשה גבוהה בתחום מבט לעומת שליטה בתאים. לעומת זאת, mitomycin C תאי עכבות מכסי ירד שטח פנים במעט לתאי קבוצת במהלך הניסוי ולהראות גם עלייה המונית יבשה מעט נמוכה יותר. עם זאת, עובי התא הממוצע מופיע בבירור ירידה לעומת שניהם, מגורה ותאי שליטה.

n-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. מעגל מחוץ ציר התקנה עבור דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי (DHM). התקנה סכמטי של תחנת עבודת DHM (א). מקביל תצלום המתאר את התקנת מיקרוסקופ (צג, תמונת תוכנות שליטת חיה (1), מחוץ ציר התקנה מיקרוסקופ דיגיטלי (2), (B), המסלול האופטי של המיקרוסקופ (קו מקווקו ירוק) מדגם (מסומן באדום חץ; (ג)). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הערכת Murine DSS-Induced קוליטיס ידי DHM. הקורס של קוליטיס בעקבות יומי אותיasurement ממשקל הגוף ביחס ובדיקה אנדוסקופית ומעקב חזר. פסד עצום של משקל גוף ביחס מיום 4 לאחר תחילת ממשל DSS (המותאם מ 19) (א) לווה סימנים אנדוסקופי של קוליטיס הוקמה כולל כיבים מוקדי ופגיעות רירית (B). ניתוח סעיפי cryostatic HE מוכתמים קונבנציונליים גילה בצקת Submucosal, עיבוי של muscularis וכן חודר לתוך דלקתיות ריריות בולט ברירית. מקביל תמונות בניגוד שלב כמותית DHM ומפות מקדמות שבירה קשורות לאחזר באמצעות משוואת 1 (מקודד 256 רמות אפורות) אשר את השינויים הבצקים של submucosa במהלך התהליך הדלקתי (חץ לבן מציין האפיתל, submucosa האפור stroma השחור) (C). ההפסד היחסי של משקל גוף (פרמטר קליני) בקורלציה משמעותית עם מקדם השבירה (פרמטר פיזי מוחלט, ליניארי R 2 = 0.64; (ד), עיבוד 19), אשר צומצם משמעותית באפיתל וכן ב submucosa ו stroma של עכברים colitic לעומת קבוצת הביקורת הבריאה (ממוצע ± SEM, *** p <0.001;. E) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הערכה של מחלת קרוהן בבני אדם על ידי DHM. דגימות רקמה גסות מחול עם אנדוסקופית ו היסטולוגית אשרה מחלת קרוהן נבדקו (א). HE-מכתים מוצג התארכות של מאורות ריריים וכן חודרים מסומנים של תאים דלקתיים. יתר על כן, בצקת Submucosal והגדלת propria muscularis זוהה. ניתוח של קורesponding תמונות בניגוד שלב כמותית DHM ומפות מקדמות שבירה קשורות לאחזר באמצעות משוואה (1) (מקודד 256 רמות אפורות) גם גילה שינויים בצקים (שצוינו כאן על ידי כוכב לבן ושחור) באפיתל (B). הבדלים משמעותיים מקדם שבירה ממוצעת התגלו בדגימות מחולי CD עם אבוקה פעילה (מוטות ברורות) או פוגה (פסים שחורים). הבדלים אלה נראים כל סוג רקמה (ממוצע ± SEM, *** p <0.001; C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
ניטור איור 4. ריפוי הפצע אפיתל על ידי White Light מיקרוסקופית DHM. תאים בתרבית היו טראן sferred לתוך צלחות פטרי עם מוסיף מיוחד (חץ אדום). לפני מוסיף תרבות הוסרו, התאים טופלו עם או EGF או C mitomycin במשך 24 שעות, או שטופלו בינוני לבד (שליטה unstimulated) (א). לאחר ההסרה מוסיפה תרבות, ריפוי פצעים היה פיקוח רציף על ידי הדמיה בניגוד שלב ידי DHM לאורך זמן. קווי המתאר נייד שאפשר לזהותו בבירור. תמונות עם ניגודיות כמותית DHM שלב נציג מוצגים בתחילת הניסוי, לאחר 22.5 שעות ובסוף המדידה לאחר 45 שעות (ב '). לוח (C) מראה את השינויים זמניים הקביל פני השטח מכוסה תא (ג S), עובי תא הממוצע (תא ד) ואת המסה (DM) היבש הסלולר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך-page = "תמיד"> איור 5
איור 5. איור של שינויי מורפולוגיה שכבת תאים על ידי מגרשי D מקודד בצבע False פסאודו 3 של תמונות עם ניגודיות כמוני DHM השלב. מגרשי 3D פסאודו שווא נציג בצבעים של התמונות עם ניגודיות שלב כמותית DHM באיור 4B בזמן t = 0, לאחר 22.5 שעות ו בסוף המדידה לאחר 45 שעות, להמחיש ההתפתחות המרחבית של עובי שכבות התא הבקרה, mitomycin C-עכבות ותאי מגורה EGF ב 3D. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מראים כי DHM מספק הערכה מדויקת של ניזק היסטולוגית במודלים קוליטיס בעכברי דגימות רקמה גסה אנושיות vivo לשעבר. יתר על כן, אנו לראות DHM יכול לפקח ריפוי פצע אפיתל ברציפות תוך מתן מידע multimodal זמנית על שינויים הסלולר. ב DHM, השחזור של הולוגרמות שנתפסו דיגיטלי מבוצע 32 מספרית. לכן, בהשוואה מיקרוסקופ שדה בהיר, בניגוד שלב Zernike במיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת, DHM מספק בניגוד שלב כמותית עם תיקון פוקוס מספרי עוקב אופציונאלי (הדמיה רב-פוקוס) 27. בשלב הדמיה כמותי מבוססת על קביעת שינויי מרחק אופטי ובכך הוא עצמאי מאוד של מכשיר המדידה מנוצל. זה מפשט את ההשוואה של נתוני מדידה כי נרכשים עם כלי נגינה שונים. בנוסף, DHM דורש עוצמת אור נמוכה רק objeתאורת ct. זה מאפשר ניתוח פולשנית של רקמות גזורות בלא כתם מקטין את כמות האינטראקציה מדגמת הנדרשת במהלך תצפיות ארוכת טווח הזמן לשגות של תאי חיים.

בארסנל הטיפולי עבור IBD הרחיב באופן משמעותי במהלך שני העשורים האחרונים. מלבד כניסתה של טיפולי TNF-α אנטי, אשר יעילים הוא UC ו- CD ויש לי פרופילי לוואי מקובלים, רומן ונוגדנים ספציפיים לחיזוק integrins הוכנסו לאחרונה לתוך פרקטיקה קלינית 34-37. כמה חומרים מבטיחים אחרים נבחנים כיום היעילות הטיפולית שלהם IBD 38-40. עם זאת, לפני השימוש הקליני בבני אדם, את היעילות והבטיחות של טיפולים הפוטנציאליים אלה צריכות להיות מוכחים במחקרים בבעלי חיים. קוליטיס DSS-Induced הוא אחד הדגמים קוליטיס בעכברים השכיחים ביותר, בשל השחזור שלה הגבוה ועלויות נמוכות 23. בנוסף, מודל זה יכול אלכך שיחול על עכברים גנטיים שינו זני 41. בעוד סמנים מערכתיים, למשל, CRP, הם משתנים מאוד במודלים של בעלי חיים, ערכה היסטולוגית של המעי הגס מייצגת את הגישה התקפה ביותר להעריך את חומרת מחל 42,43. אף על פי כן, הערכה כמותית של דלקת היסטולוגית פי ניקוד מערכות תלויה מאוד מומחיות חוקרת וניסיון. הערכה אוטומטית ניקוד על ידי פרמטרים אובייקטיביים ככל האפשר עם DHM מתגברים על מגבלות אלה, ויתר על כן הוא גם חיסכון בזמן, נמנעו הצורך מכתים 19. יתר על כן, DHM ניתן להשתמש כדי לבחון דגימות כירורגית גסות, כמו גם דגימות ריריות שהושגו במהלך אנדוסקופיה.

התחדשות אפיתל וריפוי פצעים הוא מנגנון מרכזי במהלך תהליך פתולוגי מספר כולל כיב קיבה ומעיים או דליפת anastomotic. כאשר ישנן גישות שונות מבטיחים להעריך ריפוי פצע אפיתל נאיבו 44, טכניקות אלה דורשות כלי בדיקה מתוחכמות אינם זמינים כעת נרחב. לכן, כיום ריפוי אפיתל נחקר כלל על ידי מבחני שריטה במבחנה 9. מבחנים אלה מאפשרים בחינה תקפה של סגירת פצע אבל בדרך הכלל ראשון מחייבים את מכתים התא, אשר מונעת חזר הערכת 10,45. בנוסף, אין נתוני שינוי הסלולר ניתן לרכוש במקביל התקנה ניסיונית זו. עם זאת, מידע זה עשוי להיות בעל חשיבות משמעותית שכן הוא יכול לשמש כדי להבדיל בין אפופטוזיס ונימק 46 ועל מנת להעריך את תא התפשטות והגירה 46. לכן, האפשרות לקבוע עובי תא, מסה יבשה או צפיפות רקמה זמנית על המעקב של סגירת פצע על ידי בדיקת DHM הוא בעל ערך גבוה במחקר רירי.

מטרות הטיפול לחולי מחלות מעי דלקתיות האדם כבר שינוי בעשורים האחרונים באופן קבוע <sup> 47. בעוד שבתחילה לשליטת הדלקת נחשבה להיות בעל חשיבות הראשונה במעלה, לאחר מכן פוגה ללא סטרואידים ועכשיו רירית ריפוי הן מטרות עיקריות של טיפול 48. לאחרונה, זה היה שיערותיו כי רמיסיה היסטולוגית יכולה להיות אפילו עדיפה על רירית ריפוי לבד 49. עם זאת, וישנן כמה מערכות הניקוד היסטולוגית זמין עבור האדם IBD, השתנות-משקיף השאר נותר גבוה 50. לכן, יש צורך בגישה סטנדרטית להערכת דגימות גסות היסטולוגית. DHM עשוי לתרום מטרה זו יש להעריך נוסף בניסוי קליני פרוספקטיבי עם חולי IBD אדם.

בהליך ניסיוני שהוצגו, דגימות מוארים צילמו באמצעות אור לייזר קוהרנטית מאוד. לכן, ההחלטה ב DHM מוגבל בעיקר על ידי השפעות פיזור עקיפים אור נגרמות בשל חוסר של התאורה המדגמת, דגימות עבות, אבק אוזיהומים אחרים כגון מים מרוכזים בנתיב האופטי. על מנת להשיג נתונים מדידים מדויקים מאוד מתמונות בניגוד שלב כמותית DHM, הכנה קפדנית ויישור של התקנת DHM ואת המדגם הם הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול. ביסודיות לנקות אלמנטים הדמיה אופטית, בפרט המטרה הקבל מיקרוסקופ מיקרוסקופ, נדרשים כדי למזער את הרעש. גם מדגם שקופיות מובילות, מכסת צלחת הפטר ותחתון, כמו גם מדיום תרבית התאים המנוצל צריכות להיות מוגנות מפני זיהומים חלקיקי. זו מושגת על ידי סינון וניקוי כל הרכיבים והולם בקפידה של נוזלים מיושם.

עוד טיפים מפורטים פתרון בעיות הם כדלקמן: אם הולוגרמה הדיגיטלית ו / או את התמונות בשלב DHM כמוני של רקמות גזורות הם רועשים, מוביל הזכוכית לכסות להחליק עלולה להיות מזוהם עם אבק. אם כן, יש לנקות את ספק זכוכית כיסוי להחליק עם אלכוהול (למשל, אתנול טהור). אם סמיךNess של רקמות גזורות גדול מדי (> 10 מיקרומטר) וכך תוצאות פיזור אור, נסו להשתמש קטעי רקמה רזים. במקרה כי התאורה עם אור הליזר אינה מפוזרת בצורה הומוגנית, ליישר את תאורת האובייקט באמצעות הקבל המיקרוסקופי. אם מרוכז מים על החלק התחתון של מכסה זכוכית משרת פיזור אפקטים, לבדוק את הטמפרטורה של חדר החימום ולחות בחדר. במקרה צפיפות התא גבוה מדי או תא גידול יותר משכבה אחת, להפחית את צפיפות התאים במהלך הכנת מבחני ריפוי פצע. לבסוף, כפי DHM מבוססת על העיקרון של אינטרפרומטריה, השיטה היא רגישה לתנודות או הפרעות מכאניות אחרות, המשתנים בהתאם לסביבת מעבדת הפרט. עם זאת, השפעות כאלה בדרך כלל ניתן למזער על ידי פעמי חשיפה נבחרו כראוי (בדרך כלל בטווח של האלפית שני או נמוך יותר) להקלטה הולוגרפיה במהלך תקופת ההכנה של הגדרת הניסוי.

לסיכוםתוצאות, שלנו להוכיח כי DHM מחזיקה יתרונות גדולים על שדה בהיר שיטות מיקרוסקופיה הדמיה בניגוד שלב קיימים כגון בניגוד שלב Zernike ודסק"ש בשל יכולתו להעריך היסטולוגית דלקת vivo לשעבר כמותית באופן כמעט אוטומטי. יתר על כן DHM מאפשרת הערכה משולבת רציפה ללא תווית של ריפוי פצע אפיתל במבחנה עם אינטראקציה ממוזערת עם הדגימות. זו סוללת את הדרך כדי בדיקה היסטולוגית אוטומטי מבחינת '' פתולוגיה דיגיטלית '' ומחקרים המורחבת להמשיך לחקור את הפוטנציאל של translational DHM על חולי IBD. בנוסף, DHM מציע הרומן חוץ גופית הזדמנויות ללמוד נדידת תאים כמותית, מורפולוגיה ושגשוגם.

התרגום של DHM לתוך הפרקטיקה הקלינית יש פוטנציאל לשפר אבחון IBD. כפי DHM מאפשרת כימות של דרגות שונות של דלקת מעיים באמצעותפרמטרים פיסיים כמו שינויים בצפיפות, הערכה אובייקטיבית ומדויקת יותר של המחלה במובן של "פתולוגיה דיגיטלית" נראים אפשריים. הערכת המטרה יכולה להיות השפעה חשובה על הטיפול הקליני של חולי IBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany A5486
Cell Culture Flask Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 658170
Costar Stripette Corning Inc., New York, USA 4488
Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
DMEM/Ham's F12 PAA Laboratories - Pasching - Austria E15-813
EGF Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
Falcon Tube 50 ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070
Isopentane (2-Methylbutane) Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M32631-1L
Methylene blue Merck, Darmstadt, Germany 1159430025
Mitomycin C Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany M4287
Microscope Slides G. Menzel, Braunschweig, Germany J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583
Pen/Strep/Amphotericin B Lonza, Verviers, Belgium 1558
Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
RPMI 1640 Lonza, Verviers, Belgium 3626
Sodium Chloride 0.9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
Trypsin EDTA Lonza, Verviers, Belgium 7815
Vitro – Clud R. Langenbrinck, Teningen, Germany 04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high ibidi GmbH, Munich, Germany 81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert ibidi GmbH, Munich, Germany 80050
Equipment
MICROM HM550 Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA 46320
Digital holographic microscope
Component Model Company
Inverted Microscope iMIC Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser Compass 315M Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera DMK 41BF02 The Imaging Source, Bremen, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317 (2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017 (2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210 (2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009 (2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912 (2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Tags

רפואה גיליון 115 גסטרואנטרולוגיה מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלית בשלב הדמיה כמוני ללא תווית כתם-חינם דלקת ריפוי פצעים מיקרוסקופיה כמוני
בשלב הדמיה כמוני מולטימודליות עם דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי מדויקת מעריך דלקת מעיים ו אפיתל ריפוי פצעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lenz, P., Brückner, M.,… More

Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter