デジタルホログラフィック顕微鏡とマルチモーダル定量位相イメージングは、正確に腸の炎症および上皮創傷治癒を評価します
Summary
Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.
Abstract
炎症性腸疾患の発生率、 すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎は、大幅に過去10年間で増加しています。 IBDの病因は不明のままであり、現在の治療戦略は、免疫系の非特異的抑制に基づいています。具体的に有意にIBDの管理を改善することができ、腸の炎症および上皮創傷治癒を標的とする治療法の開発は、しかし、これは、炎症性の変化を正確に検出する必要があります。現在、潜在的な薬物候補は、通常、 インビボまたはインビトロでの細胞培養に基づく技術を用いて、動物モデルを用いて評価されます。組織学的検査は、通常、サンプルの特性を変えることができ、さらに、調査結果の解釈は研究者の専門知識によって変えることができ、目的の細胞または組織染色することが必要です。デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）は、光路長遅延の検出に基づいて、可能汚れのない定量的位相コントラストイメージング。この結果は、直接絶対生物物理学的パラメータと相関させることを可能にします。私たちは、屈折率測定に基づいて、DHMと組織密度の変化の測定は、大腸炎マウスとヒトの結腸組織標本の異なる層に、染色することなく、炎症性の変化を定量化する方法を示しています。さらに、当社は、創傷領域の簡単な自動化された決意と、そのような移行細胞の乾燥質量と層の厚さなどの形態学的パラメータの同時決意を通じてDHMを使用して可能in vitroでの上皮創傷治癒、の連続マルチモーダルラベルフリーの監視を実証します。結論として、DHMは貴重な、新規かつ定量的なツールの可能なパラメータの絶対値を持つ腸の炎症を評価するための、in vitroでの上皮創傷治癒の簡素化定量化を表し、したがって、翻訳診断uのための高い可能性を秘めていますSE。
Introduction
炎症性腸疾患（IBD）、 すなわち、潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、消化管1の特発性炎症性障害です。 IBDの根底にある病態生理および潜在的な新薬や新たな診断手法の評価の研究は、特に重要です。基礎研究およびIBD患者の臨床管理の両方で、腸粘膜が注目2,3の焦点となっています。粘膜は、共生細菌、上皮細胞および腸の免疫系の種々の細胞成分間の相互作用は、腸のホメオスタシス4,5を編成れる解剖学的境界を表します。しかし、IBD患者に、制御されていないと持続性の腸の炎症は最終的にそれ自体が局所の炎症6を悪化させる上皮バリア機能の崩壊に終わることができます潰瘍や狭窄などの検出可能な損傷を、粘膜につながります。
<pクラスは、= "jove_content">上皮は、創傷治癒、炎症ので下記上皮再生のために重要であるだけでなく、消化管手術7後の消化管潰瘍や縫合不全の治癒のためのコア要件です。上皮は治癒がアッセイ治癒インビトロ創傷でシミュレートし、腸の炎症8,9のマウスモデルにすることができます巻か。両方のin vitroおよびin vivoでのアプローチは実験的評価の精度を制限する欠点を持っている。in vitroアッセイを、古典的なスクラッチアッセイのように、蛍光発色団と長引く染色手順またはトランスフェクションを必要とします。彼らは多くの場合、10を自動化することができない細胞増殖および遊走のそれらの不連続な監視によって制限されている。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎などのin vivoモデルを、頻繁に起因見られる大きな変化に一部、堅牢な読み取りアウトを欠いています実験室でのマーカーで、ミリアンペア不適切な王このようなマーカーは、大腸炎の重症度11,12を評価しました 。炎症を起こした粘膜の組織学的分析は、まだ現在大腸炎の重症度を決定するための最も有効な手法であるが、これは、in vitroでの上皮創傷治癒アッセイのように、染色を必要とし、研究者の専門知識13に依存しています。最近、デジタルホログラフィック顕微鏡（DHM）、定量的位相顕微鏡14の変異体は、 インビトロおよびインビボ 15 における上皮の創傷治癒の評価のための有用なツールとして同定された。DHMは、（OPD）の光路長遅延を測定することにより、組織密度の評価を可能にします、その見通し新たな癌の診断16-18と炎症関連組織の変化19の定量化。また、DHMは、セルの厚さ、セル覆われた表面領域および細胞内（タンパク質）コンテンツ量を決定することにより、細胞形態動態のモニタリングを可能にします<sup> 15,20。 in vitroアッセイでは、DHMはまた、細胞体積と厚さ21,22の変化を評価することによって、 例えば、携帯透水性、生理学的プロセスの分析を可能にします。また、DHM測定は、研究者に関連したサンプルバイアスを防止する自動化することができます。
ここでは、腸の炎症のマウスモデルにおけるDHMの使用を実証し、また、ラベルフリーのin vitroアッセイとして、創傷治癒の定量的モニタリングのためのヒト組織試料の分析にDHMを適用します。まず、我々は、IBDを有するヒトから大腸炎マウスおよび組織切片における異なる結腸壁層の炎症性変化を評価します。 DHM定量位相画像化手順を説明した後、我々は、詳細な顕微鏡部品を使用するための指示、組織切片を調製し、また、取得した定量的な位相画像の評価を記述を提供します。
次に、我々は、DHMはUTIできることを示していますin vitroでの上皮創傷治癒の連続マルチモーダル監視のためlized、および細胞層の厚さ、乾燥質量と細胞容積のような細胞の特性の分析を記述し、薬物誘導し、生理的な細胞の変化への洞察を与えます。
Protocol
全ての動物実験は、ドイツ動物保護法に基づく（Landesamtエリーゼナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、LANUV、ドイツ）地域の倫理委員会によって承認されました。ミュンスター大学の地元の倫理委員会は、組織学的および顕微鏡分析のためのヒト組織の使用を承認しました。 1.動物と材料地元の動物管理法律に従って女性または20〜25グラムの重量を量る必要DSS-?…
Representative Results
デジタルホログラフィック顕微鏡用DHMイメージングのための典型的なセットアップ（DHM） 図 1Bに示すように、明視野イメージングおよび定量DHM位相コントラスト撮影を行うために、我々は、倒立顕微鏡を適用しました。 25前述したように、システムは、DHMモジ?…
Discussion
私たちは、DHMは、ex vivoでのマウス大腸炎モデルおよびヒトの結腸組織試料における組織学的損傷の正確な評価を提供することを実証している。また、我々は、DHMが連続的に同時に携帯の変化についてのマルチモーダル情報を提供しながら、上皮創傷治癒を監視することができます示します。 DHMでは、デジタルで撮影したホログラムの再構成が数値的に32に行われます。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.
Materials
| Reagents | ||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 |
| DMEM/Ham´s F12 | PAA Laboratories – Pasching – Austria | E15-813 |
| EGF | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
| Isopentane (2- Methylbutane) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 |
| Mitomycin C | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 |
| Equipment | ||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 |
| Digital holographic microscope | ||
| Component | Model | Company |
| Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany |
| Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany |
| Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |
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Cite This Article
Lenz, P., Brückner, M., Ketelhut, S., Heidemann, J., Kemper, B., Bettenworth, D. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54460, doi:10.3791/54460 (2016).