Abstract
Частота воспалительных заболеваний кишечника, то есть, болезнь Крона и язвенный колит, значительно возросло за последнее десятилетие. Этиология ВЗК остается неизвестной и в настоящее время терапевтические стратегии основаны на неспецифическое подавление иммунной системы. Разработка методов лечения, которые специально направлены воспаление кишечника и эпителиальной заживление раны может значительно улучшить управление IBD, однако это требует точного выявления воспалительных изменений. В настоящее время потенциальные кандидаты наркотиков, как правило , оцениваются с использованием моделей животных в естественных условиях или с помощью методов , основанных на культуре клеток в пробирке. Гистологическое исследование обычно требует клеток или тканей, представляющих интерес для окрасить, которые может привести к изменению характеристик образца и, кроме того, интерпретация результатов может варьироваться следователем экспертизы. Цифровой голографический микроскопия (DHM), основанный на обнаружении оптической линии задержки длины, позволяетПятно свободной количественный фазовый контраст изображения. Это позволяет результаты прямо коррелирует с абсолютными биофизических параметров. Показано, как измерение изменений плотности ткани с DHM, на основе рефракционной измерения индекса, можно определить количество воспалительных изменений, без окрашивания, в различных слоях образцов ободочной ткани от мышей и людей с колитом. Кроме того, мы покажем непрерывную мультимодального без наклеек мониторинг эпителиальной заживления ран в пробирке, возможно , используя DHM через простой автоматизированной определения раненой области и одновременного определения морфологических параметров , таких как сухой массы и толщины слоя мигрирующих клеток. В заключение DHM представляет собой ценный, новый и количественный инструмент для оценки кишечного воспаления с абсолютными значениями параметров возможных, упрощенную количественную оценку эпителиальной заживления ран в пробирке и , следовательно , имеет высокий потенциал для поступательной диагностической Uсе.
Introduction
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), т.е., язвенного колита (UC) и болезнь Крона (CD) являются идиопатические воспалительные заболевания желудочно - кишечного тракта 1. Исследования в патофизиологии ВЗК и оценки потенциальных новых лекарственных препаратов или новых диагностических подходов особенно важное значение. В обоих фундаментальных исследований и клинического лечения пациентов с воспалительной болезнью кишечника, слизистая оболочка кишечника стала центром внимания 2,3. Слизистая оболочка представляет собой анатомическую границу, при которой взаимодействие между синантропных бактерий, эпителиальных клеток и различных клеточных компонентов кишечной иммунной системы кишечника оркестровать гомеостаза 4,5. Тем не менее, у пациентов с воспалительной болезнью кишечника, неконтролируемое и настойчивый воспаление кишечного тракта приводит к повреждению слизистой оболочки, обнаруживаемый в изъязвления или стеноз, который может , наконец , достигают высшей точки при пробое эпителиального барьерной функции, которая сама по себе обостряет локальное воспаление 6.
Недавно цифровой голографической микроскопии (DHM), вариант количественной фазовой микроскопии 14, был идентифицирован как полезный инструмент для оценки эпителиальной заживления ран в пробирке и в естественных условиях 15. DHM позволяет оценить плотность ткани путем измерения оптической линии задержки длины (РОП) , что диагноз рака перспективы романа 16-18 и количественное определение воспаления тканей , связанных с изменениями 19. Кроме того, DHM позволяет осуществлять мониторинг динамики морфологии клеток путем определения толщины ячейки, ячейка покрыта площадь поверхности и внутриклеточных (белок) количество контента
Здесь мы демонстрируем использование DHM в мышиной модели воспаления кишечника, а также применять DHM для анализа образцов тканей человека для количественного мониторинга заживления ран в качестве метки , свободной от анализа в пробирке. Во-первых, мы оцениваем воспалительные изменения различных ободочной стеновых слоев в colitic мышей и срезов ткани от людей с IBD. После описания процедуры визуализации количественной фазы DHM, мы предоставляем подробные инструкции по использованию компонентов микроскопа, подготовку срезов тканей, а также описывают оценку полученных количественных фазовых изображениях.
Далее мы покажем, что DHM может быть ИМПтрализованную для непрерывного мониторинга мультимодального эпителиального заживления ран в пробирке, и описать анализ клеточных характеристик , таких как толщина слоя клеток, сухой массы и клеточного объема дают представление наркотиков индуцированных и физиологическая клеточных изменений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены региональным комитетом по этике в (в Landesamt für Natur, Umwelt унд Verbraucherschutz, LANUV, Германия) в соответствии с немецким Законом о защите животных. Местного комитета по этике Университета Мюнстера одобрил использование человеческих тканей для гистологического и микроскопического анализа.
1. Животные и материалы
- Использование женского или мужского пола мышей требуемого DSS восприимчивых штамма, который весит от 20 до 25 г, и дом в соответствии с местным законодательством по уходу за животными. Обеспечить специальную чау для грызунов и автоклавируют питьевой воды вволю.
- Индуцируют острый DSS колитов путем введения 3% вес / объем декстрана сульфата натрия (DSS, молекулярная масса: 36,000-50,000 Da) в автоклавного водопроводной воде в течение 5 дней.
Примечание: Действенность DSS сильно варьирует в зависимости от производителя и партии. Проверка поставщика предоставленного DSS сначала для индукции активности заболевания, для которых даILY масса тела является надежным и объективным показателем. - Для гистологического исследования образцов тканей толстой, усыпить мышей CO 2 вдувания (или , как это указано в национальных и институциональных принципов) в конце эксперимента.
2. Экспериментальная установка для DSS-колита и in-vitro заживлении ран Assays
- Клеточные культуры и создание ранозаживления анализа.
- Рост клеток Сасо-2 , в 95% влажности и 5% СО 2 окружающей среды при 37 ° С. Используйте RPMI среду с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина.
- Семенной клетки Сасо-2 при плотности 4 × 10 5 клеток / см 2 на 35 мм чашки Петри с высокой культурой-вставкой (рис 4а).
Примечание: вставка создает две области ячейки покрыты, которые разделены с определенным свободное пространство клеток , представляющее раненую область , которую необходимо проанализировать. - Изменение среднего за два дня после того, как seedinг. Выполните сначала аспирационных остатки среды с остатков клеток с помощью автоматической пипетки, полоскание с 100 мкл фосфатно-буферного раствора (PBS) и добавляют свежую среду RPMI или сывороточный лишенной среды.
- Культуры клеток в течение 24 ч в сыворотке лишенной среде (0,1% FBS) с добавлением 20 нг / мл EGF сыворотки или 2 мкг митомицина / мл сыворотки для обнаружения изменений в процессе заживления ран поведения. Добавить нормальную среду RPMI с контрольными клетками в течение 24 ч.
- Через 24 ч культуры, снимите и выбросьте культуры вставки, как описано в шаге 3.4 и выполнить DHM.
- Индукционная острого колита DSS
- Растворить 3 г ДСС в 100 мл автоклавного воды, чтобы получить 3% (вес / объем) раствора DSS. Обеспечить это решение вместо питьевой воды мышам вволю в течение 7 дней. Рассчитать 5 мл DSS-раствора на мышь / день. Обеспечить автоклавированы воду без DSS для контрольных мышей вволю.
- Приготовление криостатированной секций мышиных и толстой кишки человека
- Эвтаназии мышей СО 2 вдувания в конце эксперимента.
- Рассеките живота животных по лапаротомии 23. Удалите всю толстую кишку тщательно с помощью пинцета и разрезать подвздошную и ректальное конец с помощью хирургических ножниц. Вырезать толстую кишку с ножницами в продольном направлении от слепой кишки до прямой кишки конца и открыть толстую кишку. Удалить все фекалии из образца с помощью пинцета с последующим промыванием PBS , 24.
- Приготовьте рулеты путем сворачивания всю толстую кишку с ватным тампоном в продольном направлении от слепой кишки до прямой кишки конца со слизистой оболочкой изогнутой внутрь. Встраивание ободочной образцов в оптимальной температуре резания (ОКТ) соединения и держать в замороженном состоянии при -80 ° С до дальнейшего использования.
- Встраивание ободочной ткани человека от хирургического образца в оптимальной температуры резания ОКТ соединения и держать в замороженном состоянии при -80 ° С до дальнейшего использования.
- Срезанные участки 7 мкм толщиной образцов ОСТ-соединением, внедренный с помощью cryotoмне только до экзамена.
Примечание: Оптимальная толщина образца зависит от настойчивости и рассеивающих свойств типа ткани исследуемого. Для описанных экспериментов с использованием ткани толстой кишки, толщина среза> 10 мкм вызывают значительное увеличение шума из-за рассеяния света в количественных контрастных изображений DHM фазы, в то время как образцы толщиной <5 мкм показывают более высокий риск повреждений, вызванных артефактов из процесса крио резки. - Перенос разделов на предметное стекло объекта-носителя.
3. Техническое оборудование, программное обеспечение и процедуры для сбора и оценки цифровых голограмм
- Цифровой голографический микроскоп для количественного клеток и визуализации тканей
- Используйте Внеосевое цифровой голографической системы микроскопии Маха-Цандера для клеток живого изображения 25, как показано на рисунке 1. Убедитесь в том, что микроскоп оснащен10X микроскоп объектив, столик микроскопа с держателем для несущих слайдах объектов из стекла и чашки Петри диаметром 35 мм, нагревательную камеру для сохранения физиологической температуры при 37 ° C и программное обеспечение для количественного фазового изображения 25.
Примечание: Например, как описано в разделе Kemper и соавт 26 и Langehanenberg и др. 27..
Примечание: В качестве альтернативы, использовать подобную систему, которая способна выполнять светлопольной микроскопии и количественного фазового визуализации живых клеток и рассеченных тканей слайдов. - Чистый объектив микроскопа и конденсатор с бумагой для очистки объективов и моющего средства (например, этанол) в соответствии с рекомендациями производителя микроскопа для удаления пыли и других загрязнений.
- Запустите программу захвата изображений микроскопа DHM, выберите режим "Светлое поле" изображения и переключатель "на" освещении белым светом. Обеспечить Колер-Корреквания образца в соответствии с рекомендациями производителя микроскопа при наблюдении образца в окне живого изображения программного обеспечения захвата изображений (в качестве альтернативы стандартное программное обеспечение захвата изображения можно использовать на этом этапе).
Примечание: Интенсивность изображения должны быть равномерно распределены в поле зрения и положение образца не должен двигаться при оптическом переориентацию с фокусной приводом микроскопа. - Выберите режим "DHM" изображения, включить "выключено" белого света освещения и переключатель "на" лазерного света. Убедитесь , что освещение лазерным светом является однородным (т.е., что интенсивность света равномерно распределен в окне живого изображения программного обеспечения сбора изображений микроскопа DHM) и заметим , что вне оси несущей картина интерференционных полос появляется с достаточной контрастности в захваченные изображения (цифровые голограммы).
- Используйте Внеосевое цифровой голографической системы микроскопии Маха-Цандера для клеток живого изображения 25, как показано на рисунке 1. Убедитесь в том, что микроскоп оснащен10X микроскоп объектив, столик микроскопа с держателем для несущих слайдах объектов из стекла и чашки Петри диаметром 35 мм, нагревательную камеру для сохранения физиологической температуры при 37 ° C и программное обеспечение для количественного фазового изображения 25.
- Приготовление криостата секций для визуализациис DHM
- Возьмем (раздел криостата на объект носитель стекла, толщина: 7 мкм, как это описано в разделе 2.3) образец из морозильника. Размораживание образца в течение примерно 5 мин при комнатной температуре и нормальной атмосфере.
- Добавить 50 - 100 мкл фосфатно-солевой буфер (PBS) в качестве вложение среды на участке ткани, используя пипетку, пока она не будет полностью покрыт буфером. Накройте образец покровным стеклом чистое стекло (стекло толщиной 170 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: пересушивание может вызвать значительные изменения показателя преломления и рассеяния свойства образца. - Убедитесь, что в нижней части держателя стекла и покровного стекла очищают от пыли и других загрязнений, которые могут вызвать рассеивание света. Образец готов к исследованию с ярким полем микроскопии и DHM.
- Количественная фаза формирования изображения срезов ткани с DHM
- Включите цифровой голографический микроскоп, выбрать 10X микроскопа объектив для работы с изображениями. Начало Iмагом приобретение программного обеспечения микроскопа DHM и выберите режим яркого изображения файла.
- Поместите слайд ткани, как это описано в пункте 2) в держатель стекло микроскопа, с покровным стеклом, обращенной объектива микроскопа.
- Переключатель "на" светлом поле освещения микроскопа DHM. Поместите образец с столику микроскопа и убедитесь, что область ткани интереса видна в окне мониторинга в реальном времени. Повышение резкости изображения с помощью фокуса диска микроскопа.
Примечание: Так же , как область интереса, область скольжения без ткани должны также присутствовать в поле зрения. - Захват светлого поля изображение резко сосредоточены образца с использованием программного обеспечения получения изображений.
- Выберите режим съемки "DHM", включить "выключено" в освещении белым светом и повернуть "на" лазерного светового освещения. Выберите "время экспозиции" для записи голограмм ниже 3 мс, заметим, что holographic внеосевая интерференционные полосы появляются с достаточной контрастности в окне живого изображения программного обеспечения сбора изображений и захватить цифровую голограмму.
- Повторите шаги 3.3.3 - 3.3.5, пока достаточное количество ярких полевых изображений и цифровых голограмм различных областей образца не зафиксировано. Голограмма приобретение завершена.
- Подготовка заживление ран анализов для визуализации DHM
- Включите блюдо нагревательной камеры Петри микроскопа DHM около 1 - 3 ч до начала эксперимента для обеспечения стабильных температурных условий в процессе измерений DHM.
- Подготовьте рабочее место с необходимым оборудованием (чашки Петри для заживления ран анализ описан в разделе 2.3): пипеток, пинцета стеклянной крышкой для чашки Петри, 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислоты (HEPES) буферным среда для культивирования клеток с физиологическим температура (37 ° С) для подготовки проб в стерильной среде.
Примечание: 3. - Удалите пластиковую крышку от чашки Петри и удалить среду для культивирования клеток с помощью пипетки. Удалите вставку из тарелки дна Петри с помощью пинцета.
- Отмывки образца 1 - 2 раза с 1 мл HEPES буферизованных среда для культивирования клеток для того , чтобы удалить мертвые клетки и оставшиеся клеточные компоненты (например, сыворотки) в области раны. Добавляют 2 мл HEPES забуференного среда для культивирования клеток и крышки чашки Петри со стеклянной крышкой.
- Убедитесь в том, что стеклянная крышка и блюдо дно Петри были очищены от пыли и других загрязнений. Образец готов к времени наблюдения покадровой с DHM.
- Непрерывное мультимодальный мониторинг заживления ран в пробирке с DHM
- Включите камеру нагрева блюдо Петри из DHM микроскопа около 1 - 3 ч додо начала эксперимента для обеспечения стабильных температурных условий в процессе измерений DHM.
- Переключатель "на" цифровой голографический микроскоп, выберите 10X микроскопа объектив для работы с изображениями. Запустите программу захвата изображений микроскопа DHM и выберите режим визуализации "светлого поля". Убедитесь, что камера нагрева для чашки Петри работает физиологической температуры (37 ° С).
- Поместите чашку Петри с ранозаживляющих анализа, полученного, как описано в 4), в нагревательной камере микроскопа DHM.
- Выберите режим яркого изображения поля и поместить образец с столик микроскопа, наблюдая его в окне мониторинга в реальном времени программного обеспечения захвата изображений микроскопа DHM. Заметим, что требуемая площадь образца появляется целенаправленными при освещении белым светом.
- Захват яркие полевые изображения различных областей образца (раневой области и прилегающих районах с сливающихся клеток) под белымсветовой освещенности с программным обеспечением захвата изображений и внешний вид документа, плотности клеток и однородности.
- Выберите "светлое поле" режим визуализации микроскопа DHM. Выберите подходящую область раны при освещении белым светом в окне мониторинга в реальном времени с программным обеспечением захвата изображений микроскопа DHM. Убедитесь, что рана площадь свободна от мертвых клеток и без сыворотки остается, и обеспечить, чтобы обе стороны включают одну гомогенную клеточный слой, предпочтительно с прямыми границами.
- Захват белого света изображение исходной области раны в режиме яркого изображения поля с программным обеспечением захвата изображений микроскопа DHM.
- Включите "выключено" белого света освещения, выберите режим "DHM" и переключатель "на" лазерной подсветкой. Выберите время экспозиции ниже 3 мс для записи голограммы (отметим, что голографический внеосевой интерференционные полосы появляются с достаточной контрастности в окне живого изображения программного обеспечения захвата изображений из тон DHM микроскоп) и захватить цифровую голограмму.
- Захват образца голограммы в режиме DHM с программным обеспечением захвата изображений и реконструировать количественный фазовый изображение с программным обеспечением реконструкции микроскопа DHM для того, чтобы проверить качество изображения.
- Выберите подходящую задержку по времени (например, 3 - 5 мин) для покадровой приобретения голограммой с программным обеспечением захвата изображений микроскопа DHM.
- Выберите режим приобретения покадровой программного обеспечения получения изображений, в котором образец подсвечивается только лазерным светом во время получения голограммы.
- Начало замедленную наблюдение DHM в заживлении ран анализа.
- Прекратить приобретение покадровой после предполагаемого времени, выберите режим формирования изображения яркое поле и документировать окончательный вид образца под белым светом визуализации.
- Реконструировать цифровые голограммы рассеченных тканей и определяют средний показатель преломления в качестве параметра для количественной оценкиплотность ткани
- Реконструировать количественных фазовых изображений с цифровых голограмм расчлененный тканей с программным обеспечением микроскопа DHM, например, как описано в Кемпер и др. 26 и Langehanenberg и др. 27.
- Определить средний фазовый контраст ДФ в разных слоях ткани (эпителий, подслизистая, стромы) в специально выбранных областей интересов (Rois) 19.
- Определить показатель преломления вложение среды с помощью рефрактометра или в качестве альтернативы, используя соответствующее значение из литературы. (значения индекса рефракции для типичного вложения сред: N воды = 1,334 28, н забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) = 1.337 29, п среда для культивирования клеток = 1.337-1.339 29,30).
- Расчет показателей преломления различных слоев ткани от среднего значения контрастности фазы 19
Примечание: В уравнении. 1 λ является длина волны лазерного луча (здесь: λ = 532 нм), d толщина рассеченных тканей (здесь: 7 мкм) и п среда является показатель преломления вложению среды (здесь: N среда = N ПБС = 1,337, определенная Аббе-Рефрактометр).
- Реконструировать и оценивать цифровые голограммы с покадровой ранозаживляющее наблюдения серии
- Реконструировать количественных фазовых изображений из временных рядов покадровой голограммы , полученной при заживлении наблюдения исцеления с микроскопа программным обеспечением DHM 26,27.
- Нормализация каждой серии количественных фазовых изображений к изображению с максимальной фазового контраста.
- Определить площадь S ^, которая покрыта клетками в количественных фазовых изображениях DHM путем сегментации изображений, которое может быть вформируется с использованием профилировщика свободного программного обеспечения клеток (www.cellprofiler.org 31).
- Вычислить среднюю фазовый контраст клеток Аф сота в области S с.
- Получение клеточного сухой массы DM от среднего значения контраста фазы Аф сота в области S C 15
(2)
Примечание: В уравнении 2 ДМ обозначает клеточный сухой массы, S C представляет область, которая занята клетками, а = 0,002 м 2 / кг. - Определить интегральный клеточный показатель преломления п клетки и показателя преломления среды для культивирования клеток н среды. Определить п ячейку отдельно экспериментально от взвешенных клеток , как описано в 30 и измеряют н среду с помощью рефрактометра. Alternaтивно использовать значения литературы для русской ячейки 30 и п среды 29,30.
- Расчет средней толщины ячейки d ячейки от X, Аф клетки, клетки и п п средней 26,32
(3)
Примечание: В уравнении. 3 параметр d ячейки является средняя толщина ячейки, λ обозначает свет длина волны лазерного света, Δφ ячейка обозначает среднее фазового контраста, и п клеток и п среда являются неотъемлемой клеточный показатель преломления и показатель преломления окружающей среды.
(2) 
(3) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичная установка для DHM визуализации для цифрового голографического микроскопии (DHM)
Для выполнения светлого поля с изображениями и количественного DHM фазового контраста изображений, мы применили инвертированного микроскопа , как показано на рисунке 1 B. Система была изменена путем присоединения модуля DHM, как описано ранее 25. Цифровые голограммы были получены при освещении образца с учетом удвоением частоты Nd: YAG лазера l = 532 нм) в конфигурации Маха-Цандера (Рисунок 1). Препарированные ткани анализировали ех естественных условиях на слайдах стекла носителя. Живые клеточные культуры наблюдали в специальных чашках Петри для наблюдения заживлении ран , как это показано на рис. 1 , C. Образцы были обследованы в свечении передачи через 10X миcroscope объектива (NA = 0,3) и трубка объектива. Камера устройства с зарядовой связью был использован для записи интерференционных картин (цифровые голограммы вне оси), генерируемые накладывая изображения образца (объектная волна) с слегка наклонена опорной волной. В цифровом виде Захваченные голограммы были реконструированы с помощью пространственного фазового сдвига реконструкции в сочетании с дополнительным голографический 26,33 автофокусировки.
Оценка Мышиные DSS-индуцированной колита DHM
Острый колит индуцировали у мышей при введении 3% вес / объем декстрана сульфата натрия (DSS) в питьевой воде в течение 5 дней. Проявление и ход колита последовало наблюдение за прогрессирующей потерей веса в DSS обработанной группе по сравнению с контрольной группой. (Рисунок 2. адаптировано из 19). Эндоскопа, умеренной до тяжелой палочкитис наблюдали , как это отражается утолщение кишечной стенки, изменения сосудистого рисунка (например, спонтанное кровотечение, красная стрелка), фибрин exudations (белая стрелка) и зернистостью поверхности слизистой оболочки (рис 2В). Обычные гистологической оценки гематоксилином и эозином (ОН) окрашивали ободочной срезы показывают заметный отек в кишечной стенки ДСС обработанных аяты контрольных животных, преимущественно расположенные в подслизистой (Рисунок 2 C серая стрелка). Соответствующая количественная DHM фазового контраста изображения и связанные с ними преломляющих индексных карт, извлекаемые по формуле 1, также изображен вышеупомянутые изменения ткани. Кроме того, показатель преломления, закодированы до 256 уровней серого, показали различия в плотности в слоях ткани , включая эпителий (белая стрелка) и стромы (черная стрелка) в нативных, образцов неокрашенных тканей (рис 2 C). Показатель преломления был значительно уменьшен в эпителии, а также в подслизистой и стромы colitic мышей по сравнению с здоровой контрольной группы (рисунок 2 Е). Кроме того, может наблюдаться значительная корреляция между клиническим параметром (относительная потеря массы тела) и абсолютного физического параметра (показатель преломления) (R 2 = 0,64 линейный; Рисунок 2 D, адаптированный из 19).
Оценка болезни Крона у человека при DHM
Болезнь Крона часто идентифицируется замечательными воспалительными изменениями кишечной стенки, обнаруженных гастроинтестинальной эндоскопии. Характерные макроскопические особенности включают зернистости поверхности слизистой оболочки, продольные язвы с фибрином exudatИоны (также называют «улитка тропы») и спонтанные кровотечения (рисунок 3 А). Гистологическая оценка Его окрашивания образцов ткани от пациентов с активным CD часто показывают кишечной стенки, а также подслизистую отек. Соответствующая количественная DHM фазового контраста изображения и связанные с рефракционной карты индекса , извлекаемые уравнением 1 также обнаружены воспалительно-опосредованной улучшающего / набухание стенки кишки, здесь видели в эпителии (рисунок 3 В). Кроме того, показатель преломления в качестве абсолютного параметра, также значительно снижается во всех слоях стенки (эпителий, подслизистой основы и стромы) в пробах ткани ободочной кишки от пациентов с активным CD стихи те , в стадии ремиссии (рисунок 3 С).
Мультимодальные Мониторинг раневого in-vitro
Сасо-2 клеток ранозаживляющие анализы проводили с использованием специального чашки Петри, чтобы обеспечить стандартные условия. Тарелка снабжена культуральную вставкой , образующей две разные камеры, которые разделены зазором 500 мкм (рис 4 А). Для имитации различных физиологических средах, клетки исследовали либо без обработки, стимулируется эпидермальным фактором роста (EGF) или ингибируется с митомицином. Установка DHM позволяет непрерывный мониторинг раневого процесса с течением времени исцеления, изображенным здесь представительных количественных DHM фазового контраста изображений (кодированные до 256 уровней серого) после того, как 0, 22,5 и 45 ч после начала эксперимента (рис 4 Б). Соответствующий ложные цветные псевдо 3D графики на рисунке 5 иллюстрируют пространственное развитие толщины клеточного слоя в трех димерность. На основе оптической линии задержки длины, ячеистого показателя преломления и уравнений 2 и 3, DHM позволяет одновременно обеспечивает динамическую оценку миграции, пролиферации и морфологией путем временного мониторинга клеточных характеристик, таких, как площадь ячейки покрываемой поверхности, средняя толщина клеток и клеточного сухой массы ( Рисунок 4 С). Таким образом, данные на рисунке 4 показывает , что результаты ЭФР моделирование в более быстрой миграции клеток в область раны, в увеличенной толщины средней ячейки и в более высокой массе сухого вещества в поле зрения по сравнению с контрольными клетками. В противоположность этому, митомицина покрывают ингибированные клетки слегка уменьшилась площадь поверхности, чем контрольные клетки в ходе эксперимента, и показывают также немного меньше сухого увеличение массы. Тем не менее, средняя толщина ячейки оказывается явно уменьшилась по сравнению с обоих, стимулировали и контрольные клетки.
Рисунок 1. Использовано Внеосевое Установка для цифрового голографического микроскопии (DHM). Схематическое настройка рабочей станции DHM (A). Соответствующая фотография , изображающая установку микроскопа (монитор, живые изображения и программное обеспечение управления (1), отклонения от оси установки цифровой микроскоп (2), (В), оптический путь микроскопа (зеленая пунктирная линия) , и образец (обозначенный красным стрелка (C)). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Оценка Мышиные DSS-индуцированной колита DHM. Течение колита последовало ежедневно меняasurement относительного веса тела и повторного эндоскопического последующего обследования. Массивная потеря относительной массы тела от 4 -й день после начала введения DSS (адаптировано из 19) (A) сопровождалось эндоскопических признаков установленного колита , включая фокусных изъязвления и слизистых оболочек уязвимости (B). Анализ традиционных ОН-окрашенными криостатированной участков выявлено подслизистую отек, утолщение и мышечной выраженной слизистой воспалительного инфильтрата в слизистой оболочке. Соответствующая количественная DHM фазового контраста изображения и связанные с рефракционной карты индекса извлекаемые Уравнение 1 (кодируется 256 уровней серого) подтвердили отечной изменения подслизистой во время воспалительного процесса (белая стрелка указывает на эпителий, серый и черный подслизистой стромы) (C). Относительная потеря массы тела (клинический показатель) достоверно коррелирует с показателем преломления (абсолютный физический параметр, R 2 линейных = 0,64; (D), адаптированный с 19), которая была значительно уменьшена в эпителии, а также в подслизистой и стромы colitic мышей по сравнению с здоровой контрольной группы (среднее значение ± SEM, *** Р <0,001;. Е) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Оценка болезни Крона у людей с помощью DHM. Образцы Толстокишечные ткани у пациентов с эндоскопически и гистологически подтвержденной болезнью Крона были рассмотрены (А). HE-окрашивание отображается удлинение крипт слизистой оболочки и выраженный инфильтрат воспалительных клеток. Кроме того, был обнаружен подслизистой отек и расширение мышечная. Анализ корбанкаesponding количественных DHM фазового контраста изображения и связанные с рефракционной карты индекса извлекаемые уравнения (1) (код 256 уровней серого) также показал отечной изменения (здесь обозначается белой и черной звезды) в эпителии (B). Значительные различия в среднего показателя преломления были обнаружены в образцах от пациентов с активной CD вспышки (прозрачный бар) или ремиссия (черные полосы). Эти различия наблюдаются в каждом типе ткани (среднее значение ± SEM, *** р <0,001; C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Мониторинг эпителиальной заживление ран белым светом микроскопией и DHM. Культивируемые клетки Transferred в чашки Петри со специальными вставками (красная стрелка). Перед тем как культуральные вставки были удалены, клетки обрабатывали либо ЭФР или митомицина С в течение 24 ч, или обработанные только средой (нестимулируемый управления) (A). После удаления культуры вставок, ранозаживляющее непрерывно контролировали с помощью контрастной визуализации фазы с помощью DHM с течением времени. Клеточные контуры могут быть четко признаны. Характерные количественные DHM фазового контраста изображения отображаются в начале эксперимента, после 22,5 часов и в конце измерения через 45 ч (В). Панель (C) показаны соответствующие временные изменения в клеточной покрываемой поверхности (S С), средняя толщина ячейки (d - клеток) и клеточного сухой массы (DM). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Иллюстрация слой клеток Морфология Изменения фальшивыми с цветовым кодированием Псевдо 3 D злоумышлениям контрастные изображения Количественный DHM фазы. Типичные ложные цветовым кодированием псевдо 3D графики количественных DHM фазового контраста изображений на рисунке 4В при Т = 0, после 22,5 ч и в конце измерения после 45 часов, иллюстрируют пространственное развитие толщины слоев клеток для Control-, митомицина-тормозится и EGF-стимулированной клетки в 3D. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Показано , что DHM обеспечивает точную оценку гистологического повреждения в мышиных моделях колита и образцах тканей человека ободочной бывших естественных условиях. Кроме того, мы показали DHM может непрерывно контролировать эпителиальной заживление ран при одновременном обеспечении мультимодальных информации о клеточных изменений. В DHM, реконструкция отснятых в цифровом виде голограмм выполняется численно 32. Таким образом, по сравнению с яркой микроскопии, фазового контраста Цернике и дифференциального интерференционного контраста микроскопии, DHM обеспечивает количественный фазовый контраст с необязательными последующего численного коррекции фокусировки (мульти-фокус визуализации) 27. Количественная фаза формирования изображения основан на определении изменений оптической длины пути и, таким образом, сильно зависит от используемого измерительного устройства. Это упрощает сравнение данных измерений, которые приобретаются с различными инструментами. Кроме того, DHM требует только низкой интенсивности света для OBJEкт освещение. Это позволяет минимально инвазивной анализ неокрашенных рассеченных тканей и сводит к минимуму количество взаимодействия образца, необходимого во время длительных покадровой наблюдений живых клеток.
Терапевтический Armamentarium для IBD значительно расширилась за последние два десятилетия. К тому же введение анти TNF-α терапии, которые эффективны как в UC и CD и имеют приемлемые профили побочные эффекты и , новые и специфические антитела , направленные интегрины недавно были введены в клиническую практику 34-37. Несколько других перспективных агентов в настоящее время оценивают по их терапевтической эффективности в IBD 38-40. Тем не менее, до клинического применения у людей, эффективность и безопасность этих потенциальных методов лечения должна быть доказана в исследованиях на животных. DSS-индуцированным колитом , является одним из наиболее часто используемых мышиных моделях колита, из - за его высокой воспроизводимостью и низкой стоимостью 23. Кроме того, эта модель может альтак быть применены к генетически измененных мышей штаммов 41. В то время как системные маркеры, например, CRP, сильно варьируют в животных моделях, гистологическое оценка толстой кишки представляет собой наиболее правильный подход к оценке тяжести заболевания 42,43. Тем не менее, количественная оценка гистологического воспаления в соответствии с системами оценки сильно зависит от исследователя знаний и опыта. Автоматизированная оценка и подсчета очков по объективным параметрам , как это возможно с DHM преодолевает эти ограничения, и , кроме того , также экономит время, избегая необходимости окрашивания 19. Кроме того, DHM может быть использован для изучения хирургических ободочной образцов, а также образцы слизистой оболочки, полученные во время эндоскопического исследования.
Эпителиальной регенерации и заживления ран, является основным механизмом в течение нескольких патологического процесса, включая желудочно-изъязвления или анастомоза утечки. В то время как существуют перспективные подходы для оценки эпителиальной заживления ран в VIvo 44, эти методы требуют сложных инструментов экспертизы и в настоящее время не получили широкого распространения. Таким образом, в настоящее время эпителиальной заживление обычно расследуются скретч анализов в пробирке 9. Эти анализы позволяют действительную экспертизу закрытия раны , но , как правило , в первую очередь требуют окрашивания клеток, которые затем предотвращает повторную оценку 10,45. Кроме того, нет данных сотовой связи изменений не могут быть приобретены параллельно с этой экспериментальной установки. Тем не менее, эта информация может иметь важное значение , так как оно может быть использовано для различения между апоптозом и некрозом 46 и для оценки пролиферации и миграции клеток 46. Таким образом, возможность определить толщину клеток, сухую массу или плотность тканей одновременно с мониторингом закрытия раны путем DHM экспертизы имеет большое значение в исследовании слизистых оболочек.
Цели лечения для пациентов с воспалительной болезнью кишечника человека постоянно менялись на протяжении последних десятилетий <SUP> 47. В то время как первоначально контроль воспаления рассматривалось как первостепенное значение, позднее стероид свободной ремиссий и теперь исцеление слизистых оболочек являются основными задачами лечения 48. Недавно было высказано предположение , что гистологическое ремиссия может даже превосходить слизистым заживлению покое 49. Тем не менее, в то время как существует несколько гистологических счетные системы , доступные для человеческого IBD, вариабельность между наблюдателями остается на высоком уровне 50. Таким образом, существует необходимость в стандартизированном подходе для оценки гистологических образцов ободочной кишки. DHM может способствовать достижению этой цели и должны быть дополнительно оценены в проспективном клиническом исследовании пациентов с воспалительной болезнью кишечника человека.
В экспериментальной методике, представленной образцы подсвечиваются и визуализируют с помощью высоко когерентный лазерный свет. Таким образом, разрешение в DHM в основном ограничивается световыми эффектами рассеяния и дифракции, вызванное смещением освещения образца, толстые образцы, пыль илидругие примеси, такие как конденсированная вода в оптическом тракте. Для достижения высокой точных данных измерений от количественных изображений контраста DHM фазы, тщательной подготовки и согласования установки DHM и образца являются наиболее важными шагами в протоколе. Тщательно очистить оптические элементы изображений, в частности, объектив микроскопа конденсатора и микроскоп, необходимые для снижения уровня шума. Кроме того, образец слайдов носителя, чашки Петри дном и крышкой, а также использовали культуральной среды клеток должна быть свободна от примесей в виде частиц. Это достигается путем тщательного очистки всех компонентов и адекватную фильтрацию применяемых жидкостей.
Более подробные поиск и устранение неисправностей советы следующим образом: если цифровая голограмма и / или количественные фазовые изображения DHM расчлененного тканей являются шумными, носитель из стекла и крышка скольжения могут быть загрязнены пылью. Если да, то очистить носитель стекла и покровного стекла с алкоголем (например, чистый этанол). Если толстыйНесс рассеченной ткани слишком велика (> 10 мкм) и, таким образом, приводит к рассеянию света, попробуйте использовать более тонкие срезы ткани. В случае, когда освещение лазерным светом не однородно распределенным, выравнивать освещение объекта через конденсатор микроскопов. Если конденсируют воду на дне стеклянной крышкой индуцирует эффекты рассеяния, проверить температуру камеры нагрева и влажности в помещении. В случае, если плотность клеток слишком высока или роста клеток в более чем одном слое, снижают плотность клеток в процессе подготовки раневого анализов. И, наконец, в качестве DHM основан на принципе интерферометрии, метод чувствителен к воздействию вибрации или других механических возмущений, которые изменяются в зависимости от индивидуальной лабораторных условиях. Тем не менее, такие воздействия, как правило, могут быть сведены к минимуму с помощью надлежащим образом выбранных времени экспозиции (как правило, в диапазоне миллисекунды или ниже) для записи голографии во время подготовки экспериментальной установки.
В итоге, Наши результаты показывают , что DHM имеет значительные преимущества по сравнению с светлого поля и фазового контраста существующих методов визуализации , таких как микроскопия Зернике фазового контраста и ДИК благодаря своей способности количественно оценить гистологическое воспаление в естественных условиях экс почти автоматизированным способом. Кроме того DHM позволяет без наклеек непрерывной мультимодального оценки эпителиальной заживления ран в пробирке с свернутом взаимодействием с образцами. Это открывает путь к автоматизированным гистологического исследования с точки зрения '' цифровой патологии '' и дальнейших расширенных исследований для изучения трансляционной потенциал DHM на пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника. Кроме того, DHM предлагает роман в пробирке возможности для количественного изучения миграции клеток, морфологии и пролиферации.
Перевод DHM в клиническую практику имеет потенциал для улучшения диагностики IBD. Поскольку DHM позволяет количественно оценить различные степени воспаления кишечника черезфизические параметры, такие как изменения плотности, объективной и более точной оценки заболевания в смысле "цифровой патологии" представляется возможным. Объективная оценка может иметь важное влияние на клиническом лечении пациентов с IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| DMEM/Ham's F12 | PAA Laboratories - Pasching - Austria | E15-813 | |
| EGF | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| Mitomycin C | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 | |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 | |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 | |
| Equipment | |||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 | |
| Digital holographic microscope | |||
| Component | Model | Company | |
| Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany | |
| Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany | |
| Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany | |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
- Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
- Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144 (2011).
- Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
- Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
- Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
- Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
- Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
- Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
- Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
- Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317 (2014).
- Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976 (2015).
- Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017 (2011).
- Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210 (2015).
- Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
- Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
- Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
- Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
- Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
- Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B.
- Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
- Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
- Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
- Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
- Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
- Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
- Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
- Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
- Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912 (2012).
- Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
- Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
- Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
- Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).
