Abstract
Die Inzidenz von entzündlicher Darmerkrankung, dh, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Die Ätiologie von IBD unbekannt bleibt und aktuelle Therapiestrategien sind auf der unspezifischen Unterdrückung des Immunsystems beruhen. Die Entwicklung von Behandlungen, die speziell Darmentzündung und epitheliale Wundheilung Ziel deutlich Management von CED verbessern könnte, dies erfordert jedoch eine genaue Erfassung von entzündlichen Veränderungen. Derzeit werden Wirkstoffkandidaten in der Regel unter Verwendung von Tiermodellen in vivo ausgewertet oder mit Zellkultur - Techniken in vitro. Die histologische Untersuchung erfordert in der Regel die Zellen oder Gewebe von Interesse gefärbt werden, was die Probeneigenschaften verändern können und darüber hinaus die Interpretation der Ergebnisse kann durch Ermittler Expertise variieren. Digitale holografische Mikroskopie (DHM), basierend auf der Erfassung der optischen Weglänge Verzögerung ermöglichtfleckenfreie quantitative Phasenkontrast-Bildgebung. Dadurch können die Ergebnisse direkt mit absolute biophysikalischen Parametern korreliert. Wir zeigen, wie Messung von Veränderungen in der Gewebedichte mit DHM, bezogen auf Brechungsindex-Messung kann entzündlichen Veränderungen zu quantifizieren, ohne Färbung, in verschiedenen Schichten von Kolon-Gewebeproben von Mäusen und Menschen mit Colitis. Darüber hinaus zeigen wir eine kontinuierliche multimodalen markierungsfreie Überwachung von epithelialen Wundheilung in vitro möglich DHM durch die einfache automatische Bestimmung des verwundeten Bereich und gleichzeitige Bestimmung der morphologischen Parameter wie Trockenmasse und Schichtdicke von wandernden Zellen verwendet wird . Abschließend stellt DHM einen wertvollen, neuen und quantitative Werkzeug für die Beurteilung der Darmentzündung mit absoluten Werten für Parameter möglich, vereinfachte Quantifizierung von epithelialen Wundheilung in vitro und damit hohe Potential für eine Translationsdiagnose u hatse.
Introduction
Entzündlicher Darmerkrankung (IBD), dh, ulzerative Kolitis (UC) und Morbus Crohn (CD) sind idiopathische entzündliche Erkrankungen des Magen - Darm - Trakt 1. Forschung in die darunter liegende Pathophysiologie von IBD und der Bewertung potentieller neuer Medikamente oder neuartige diagnostische Ansätze ist besonders von Bedeutung. Sowohl in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung von IBD - Patienten hat sich die Darmschleimhaut ein Fokus der Aufmerksamkeit 2,3 geworden. Die Schleimhaut stellt eine anatomische Grenze, an der die Wechselwirkung zwischen kommensalen Bakterien, Epithelzellen und verschiedenen zellulären Komponenten des intestinalen Immunsystems gut orchestriert Homöostase 4,5. Jedoch bei CED - Patienten, unkontrollierte und persistent Darmentzündung führt Schäden, nachweisbar als Ulzerationen oder Stenose der Schleimhaut, die schließlich in Abbau der epithelialen Barrierefunktion gipfeln kann, die sich eine lokale Entzündung 6 verschlimmert.
Kürzlich digitale holografische Mikroskopie (DHM), eine Variante des quantitativen Phasenmikroskopie 14 als nützliches Werkzeug für die Bewertung der epithelialen Wundheilung in vitro und in vivo 15 identifiziert wurde. DHM ermöglicht Beurteilung der Gewebedichte durch optische Weglänge Verzögerungsmessung (OPD) , die Aussichten neuer Krebsdiagnose 16-18 und Quantifizierung von Entzündungen im Zusammenhang mit Veränderungen des Gewebes 19. Darüber hinaus ermöglicht DHM Überwachung der Dynamik der Zellmorphologie durch die Bestimmung der Zelldicke, Zell bedeckt Oberfläche und intrazellulären (Protein) Inhalt Menge
Hier zeigen wir die Verwendung von DHM in einem murinen Modell der Darmentzündung und auch DHM gelten für Analyse von menschlichen Geweben Proben für die quantitative Überwachung der Wundheilung als markierungsfreien in vitro - Assay. Zunächst bewerten wir entzündliche Veränderungen verschiedener Kolonwand-Schichten in colitic Mäusen und Gewebeschnitten von Menschen mit IBD. Nach der Beschreibung des DHM quantitative Phasenbildgebungsverfahren, bieten wir detaillierte Anweisungen für die Mikroskopkomponenten verwenden, die Herstellung von Gewebeschnitten und auch die Auswertung der gewonnenen quantitativen Phasenbilder beschreiben.
Als nächstes zeigen wir, dass DHM UTI sein kannlized für die kontinuierliche Überwachung multimodaler von epithelialen Wundheilung in vitro und beschreiben die Analyse von zellulären Eigenschaften wie Zellschichtdicke, Trockenmasse und Zellvolumen geben Einblick in die Droge induziert und physiologische Zellveränderungen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden von der regionalen Ethikkommission (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, LANUV, Deutschland) nach deutschem Tierschutzgesetz genehmigt. Die Ethikkommission der Universität Münster genehmigt die Verwendung von menschlichen Geweben für histologische und Mikroskop-Analyse.
1. Tiere und Materialien
- Verwenden weibliche oder männliche Mäuse des erforderlichen DSS-empfindlichen Stamm, der 20 bis 25 g wiegen, und Haus nach den örtlichen Tierpflegegesetzgebung. Bieten Sie spezielle Futter für Nager und autoklaviert Wasser ad libitum trinken.
- Akute Kolitis induzieren DSS durch die Verabreichung von 3% w / v Dextransulfat - Natrium (DSS, Molekulargewicht: 36,000-50,000 Da) in autoklavierten Leitungswasser für 5 Tage.
HINWEIS: Die Wirksamkeit von DSS ist sehr variabel je nach Hersteller und Charge. Testen Sie Ihre Lieferanten bereitgestellten DSS zunächst für die Induktion der Aktivität der Erkrankung, für die daily Körpergewicht ist ein zuverlässiger und objektiver Indikator. - Für die histologische Beurteilung von Kolon Gewebeproben, einschläfern Mäuse durch CO 2 Insufflation (oder wie von nationalen und institutionellen Richtlinien festgelegt) am Ende des Experiments.
2. Versuchsaufbau für DSS-Kolitis und In-vitro - Assays Wundheilung
- Zellkultur und Etablierung der Wundheilung Assays.
- Wachsen Caco-2 - Zellen in einem 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 -Umgebung bei 37 ° C. Verwenden RPMI-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Seed Caco-2 - Zellen in einer Dichte von 4 x 10 5 Zellen / cm 2 auf 35 mm Petrischalen mit hoher Kultureinsatz (siehe 4A).
HINWEIS: Der Einsatz erzeugt zwei Zelle abgedeckten Bereiche, die den verwundeten Bereich freien Raum mit einer definierten Zelle getrennt repräsentieren analysiert werden. - Ändern Medium zwei Tage nach seedinG. Führen durch erste Restmedium mit Zelltrümmer Ansaugen durch einen automatischen Pipette gründlich mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und fügen Sie frisches RPMI-Medium oder Serum-beraubt Medium.
- Kulturzellen für 24 h in serum entzogen Medium (0,1% FBS) ergänzt mit 20 ng EGF / ml Serum oder 2 ug Mitomycin c / ml Serum Veränderungen in Heilungsverhalten Wunde zu erkennen. Hinzufügen normalen RPMI Medium zu steuern Zellen für 24 Std.
- Nach 24 Stunden der Kultur, zu entfernen und Kultureinsätze zu verwerfen, wie in Schritt 3.4 und führen DHM beschrieben.
- Induktion von akuter DSS Kolitis
- Man löst 3 g DSS in 100 ml Wasser autoklaviert 3% zu erhalten (w / v) DSS-Lösung. Geben Sie diese Lösung anstelle von Wasser an Mäuse ad libitum für 7 Tage zu trinken. Berechnen 5 ml DSS-Lösung pro Maus / Tag. Geben Sie autoklavierten Wasser ohne DSS für Kontrollmäuse ad libitum.
- Herstellung von kryostatischen Abschnitte murinen und humanen Kolon
- Euthanize Mäuse durch CO 2 Insufflation am Ende des Experiments.
- Präparieren Sie den Bauch der Tiere durch Laparotomie 23. Entfernen Sie die gesamte Kolon vorsichtig mit einer Pinzette und schneiden Sie das Ileum und rektale Ende chirurgische Schere. Schneiden Sie den Doppelpunkt mit einer Schere in Längsrichtung vom Blinddarm zum rektalen Ende und öffnen Sie den Dickdarm. Entfernen Sie alle Kot von der Probe durch Waschen mit PBS 24 gefolgt mit einer Pinzette.
- Bereiten Sie Rouladen durch Walzen des gesamten Dickdarms mit einem Baumwoll oben in Längsrichtung von der Blinddarm zur rektalen Ende mit der Schleimhaut nach innen gebogen Knospe. Kolon-Proben in optimalen Schnitttemperatur (OAT) Verbindung Einbetten und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
- menschlichen Dickdarmgewebe aus chirurgischen Probe in eine optimale Schnitttemperatur OCT-Verbindung Einbetten und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
- Cut Abschnitte von 7 um Dicke des OCT-Verbindung eingebettete Proben mit Hilfe eines cryotomich kurz vor der Prüfung.
HINWEIS: Die optimale Probendicke hängt von der Ausdauer und die Streueigenschaften des Gewebetyp untersucht. Für die beschriebenen Experimente Colongewebe mit, Schichtdicke> 10 um verursachen erhebliche Zunahme des Lärms durch Lichtstreuung in quantitativer DHM Phasenkontrastaufnahmen, während die Proben mit einer Dicke von <5 & mgr; m zeigen ein höheres Risiko für Schäden verursachte Artefakte aus dem Kryo Schneidprozess. - Transferabschnitte auf einem Glasobjektträger-Schlitten.
3. Technische Ausrüstung, Software und Verfahren zur Erfassung und Auswertung der digitalen Hologramme
- Digitalen holografischen Mikroskops für quantitative Zell- und Gewebebildgebungs
- Verwenden Sie ein Off-Axis - Mach-Zehnder digitalen holografischen Mikroskopiesystem für Live - Cell - Imaging 25, wie in Abbildung 1 dargestellt. Stellen Sie sicher , dass das Mikroskop mit einem ausgestattet ist10X Mikroskopobjektiv, einem Mikroskoptisch mit einer Halterung für die Glasobjektträger gleitet und Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm, eine Heizkammer für quantitative Phasenabbildungs 25 physiologischer Temperatur bei 37 ° C und Software zu erhalten.
HINWEIS: Zum Beispiel, wie in Kemper et al 26 und Langehanenberg et al 27...
HINWEIS: Alternativ können Sie ein ähnliches System verwenden , die von der Durchführung Hellfeldmikroskopie und quantitative Phasen Abbildung von lebenden Zellen und seziert Gewebe gleitet fähig ist. - Saubere Mikroskopobjektiv und Kühler mit Linsenreinigungspapier und Reinigungsmittel (zB Ethanol) , wie vom Hersteller des Mikroskops empfohlen Staub oder andere Verunreinigungen zu entfernen.
- Starten Sie die Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop, wählen Sie "Hellfeld" Abbildungsmodus und Schalter "auf" Weißlichtbeleuchtung. Stellen Sie sicher, Köhler-Buchmalation der Probe durch das Mikroskophersteller empfohlenen wie während die Probe in dem Live-Abbildungsfenster der Bildaufnahme-Software Beobachten (alternativ ein Standardbild-Erfassungssoftware in diesem Schritt verwendet werden kann).
HINWEIS: Die Bildintensität im Sichtfeld und die Probenposition sollte nicht während der optischen Neuausrichtung mit dem Fokus Antrieb des Mikroskops werden sollte homogen verteilt bewegen. - Wählen Sie "DHM" Imaging-Modus schalten "off" Weißlicht-Beleuchtung und Schalter "auf" das Laserlicht. Prüfen, ob die Beleuchtung mit Laserlicht homogen ist (dh , dass die Lichtintensität wird in dem Live - Abbildungsfenster des Abbildungserfassungssoftware des DHM Mikroskop homogen verteilt) und zu beobachten , dass die off-axis Trägerinterferenzstreifenmuster erscheint mit ausreichendem Kontrast in der aufgenommenen Bilder (digital Hologramme).
- Verwenden Sie ein Off-Axis - Mach-Zehnder digitalen holografischen Mikroskopiesystem für Live - Cell - Imaging 25, wie in Abbildung 1 dargestellt. Stellen Sie sicher , dass das Mikroskop mit einem ausgestattet ist10X Mikroskopobjektiv, einem Mikroskoptisch mit einer Halterung für die Glasobjektträger gleitet und Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm, eine Heizkammer für quantitative Phasenabbildungs 25 physiologischer Temperatur bei 37 ° C und Software zu erhalten.
- Herstellung von Gefrierschnitten für die Bildgebungmit DHM
- Nehmen Sie die Probe (Kryostatschnitt auf einem Glasobjektträger, Stärke: 7 um, wie in 2.3 beschrieben) aus dem Gefrierfach. Tauen Sie die Probe für etwa 5 Minuten bei RT und Normalatmosphäre.
- Hinzufügen von 50 bis 100 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) als Medium, auf dem Gewebeschnitt Einbettung unter Verwendung einer Pipette, bis es vollständig mit Puffer bedeckt ist. Decken Sie die Probe mit einem sauberen Deckglas (Glasdicke 170 & mgr; m).
HINWEIS: Übertrocknung können wesentliche Veränderungen des Brechungsindex und Streueigenschaften der Probe zu induzieren. - Stellen Sie sicher, dass der Boden des Glasträger und Deckglas sind von Staub und anderen Verunreinigungen, die Lichtstreuung hervorrufen kann. Die Probe ist bereit für die Untersuchung mit Hellfeldmikroskopie und DHM.
- Quantitative Phase Abbildung von Gewebeschnitten mit DHM
- Schalten Sie das digitale holografische Mikroskop, wählen Sie die 10X Mikroskop-Objektiv für die Bildgebung. Starten Sie das image Erfassungs-Software des Mikroskops DHM und helle Datei-Bildgebungsmodus wählen.
- Legen Sie das Gewebe Träger nach 2) in dem Objektträger Halter beschrieben, mit dem Deckglas des Mikroskop-Objektivs gegenüber.
- Switch "auf" der Hellfeldbeleuchtung des DHM Mikroskop. Positionieren Sie die Probe mit dem Mikroskoptisch und sicherzustellen, dass die Gewebebereich von Interesse in der Live-Monitoring-Fenster sichtbar ist. Verbessern Sie die Schärfe des Bildes mit der Fokustrieb des Mikroskops.
HINWEIS: Neben der Bereich von Interesse ein Bereich des Schiebers ohne Gewebe sollte ebenfalls in dem Sichtfeld vorhanden sein. - Nehmen Sie ein Hellfeldbild der scharf fokussiert Probe mit der Bildaufnahme-Software.
- Wählen Sie "DHM" Imaging-Modus schalten "off" der Weißlicht-Beleuchtung und schalten "auf" der Laserlicht-Beleuchtung. Wählen Sie die "Belichtungszeit" zur Hologrammaufzeichnung unter 3 ms, verweisen darauf, dass hologrAFIK off-axis Interferenzstreifen erscheinen mit ausreichendem Kontrast in der Live-Imaging-Fenster der Imaging-Erfassungssoftware und erfassen ein digitales Hologramm.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3 - 3.3.5, bis eine ausreichende Anzahl von hellen Feldbilder und digitale Hologramme unterschiedlicher Probenbereiche aufgezeichnet wurden. Hologram Akquisition ist nun abgeschlossen.
- Herstellung der Wundheilung Assays für DHM Bildgebungs
- Einschalten der Petrischale Heizkammer des DHM Mikroskop etwa von 1 bis 3 h vor dem Beginn des Experiments zu stabilen Temperaturbedingungen während der DHM Messungen gewährleisten.
- Bereiten Werkbank mit der erforderlichen Ausrüstung (Petrischale für Wundheilungsassay in 2,3 beschrieben wird): Pipetten, Pinzette, Glasdeckel für Petrischale, 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) gepufferten Zellkulturmedium mit physiologischer Temperatur (37 ° C) für die Probenvorbereitung in steriler Umgebung.
HINWEIS: 3. - Entfernen Sie den Kunststoffdeckel aus der Petrischale und entfernen Sie die Zellkulturmedium mit einer Pipette. Entfernen Sie den Einsatz aus der Petrischale Boden mit einer Pinzette.
- Waschen Sie die Probe 1 - 2 mal mit 1 ml HEPES - gepufferter Zellkulturmedium , um tote Zellen und restliche Zellbestandteilen ( zum Beispiel Serum) in den Wundbereich zu entfernen. 2 ml HEPES-gepufferte Zellkulturmedium und die Kappe der Petrischale mit dem Glasdeckel.
- Stellen Sie sicher, dass der Glasdeckel und die Petrischale Boden von Staub und anderen Verunreinigungen gereinigt wurden. Probe ist für Zeitraffer Beobachtung mit DHM bereit.
- Kontinuierliche multimodal Überwachung der Wundheilung in vitro mit DHM
- Schalten Sie die Petrischale Heizraum des DHM Mikroskop etwa 1-3 Stunden vorzu Beginn des Experiments in den DHM Messungen stabile Temperaturbedingungen sicherzustellen.
- Switch "auf" der digitalen holografischen Mikroskops, wählen Sie die 10X Mikroskop-Objektiv für die Bildgebung. Starten Sie die Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop und wählen Sie "Hellfeld" Abbildungsmodus. Stellen Sie sicher, dass der Heizraum für die Petrischale wird eine physiologische Temperatur (37 ° C) betrieben wird.
- Legen Sie die Petrischale mit dem Wundheilungs Assay, hergestellt wie in 4) beschrieben, in den Heizraum des DHM Mikroskop.
- Wählen Sie die Hellfeldabbildung Modus und die Position der Probe mit dem Mikroskoptisch, während sie in der Live-Überwachungsfenster des Bildaufnahme-Software des Mikroskops DHM zu beobachten. Beachten Sie, dass der gewünschte Bereich der Probe scharf unter Weißlichtbeleuchtung scharf erscheint.
- Erfassen Hellfeldbilder verschiedener Bereiche der Probe (Wundbereich und die umliegenden Gebiete mit konfluenten Zellen) unter weißemLichtbeleuchtung mit der Bildaufnahme-Software und Dokumenten Aussehen, Zelldichte und Homogenität.
- Wählen Sie "Hellfeld" Abbildungsmodus des Mikroskops DHM. Wählen Sie eine geeignete Wundbereich unter Beleuchtung mit weißem Licht im Live-Monitoring-Fenster mit der Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop. Sicherstellen, dass die Wundfläche von toten Zellen frei ist und kein Serum bleibt, und stellen Sie sicher, dass beide Seiten eine einzige homogene Zellschicht, vorzugsweise mit geraden Grenzen.
- Nehmen Sie ein Weißlichtbild des ursprünglichen Wundbereich in Hellfeld-Bildaufnahmemodus mit der Bildaufnahme-Software des DHM Mikroskop.
- Schalten Sie "Aus" Weißlichtbeleuchtung, wählen Sie "DHM" -Modus und Schalter "auf" Laserbeleuchtung. Wählen Sie eine Belichtungszeit von weniger als 3 msec zur Hologrammaufzeichnung (beachte, dass die holographische außeraxialen Interferenzstreifen mit ausreichender Kontrast erscheinen in dem Live-Abbildungsfenster der Bildaufnahme-Software von ter DHM Mikroskop) und ein digitales Hologramm zu erfassen.
- Nehmen Sie ein Probe-Hologramm in DHM-Modus mit der Bildaufnahme-Software und zu rekonstruieren, eine quantitative Phasenbild mit der Rekonstruktionssoftware des DHM Mikroskop, um die Bildqualität zu überprüfen.
- Wählen Sie eine geeignete Zeitverzögerung (zB 3 bis 5 min) für Zeitraffer-Hologramm Erfassung mit dem Bildaufnahme - Software des Mikroskops DHM.
- Wählen Sie die Zeitraffer-Aufnahmemodus der Bildaufnahme-Software, in dem die Probe nur mit Laserlicht während Hologramm Erwerb beleuchtet wird.
- Starten Sie den Zeitraffer-DHM Beobachtung der Wundheilung Assays.
- Stoppen Sie die Zeitrafferaufnahme nach der vorgesehenen Zeit, wählen Sie Hellfeldabbildungsmodus und dokumentieren das endgültige Aussehen der Probe unter Weißlicht-Bildgebung.
- Rekonstruieren digitaler Hologramme von sezierten Gewebe und bestimmen den mittleren Brechungsindex als Parameter zu quantifizierenGewebedichte
- Rekonstruieren quantitative Phasenbildern aus den digitalen Hologramme sezierten Gewebe mit der Software des DHM Mikroskop, beispielsweise wie in Kemper et al. 26 und Langehanenberg et al. 27.
- Bestimmen Sie die mittlere Phasenkontrast Δφ in verschiedenen Gewebeschichten (Epithel, Submukosa, Stroma) in entsprechend ausgewählten Regionen von Interesse (ROIs) 19.
- Bestimmen, um den Brechungsindex des Einbettungsmediums durch ein Refraktometer oder alternativ durch einen entsprechenden Wert aus der Literatur verwendet wird. (Brechungsindexwerte für typische Einbettung Medien: n Wasser = 1,334 28, n Phosphat - gepufferte Salzlösung (PBS) = 1,337 29, n Zellkulturmedium = 1,337-1,339 29,30).
- Berechnen der Brechungsindizes der verschiedenen Gewebeschichten von der mittleren Phasenkontrastwerte 19
HINWEIS: In Gl. Λ 1 die Wellenlänge des Laserlichts (hier: λ = 532 nm), d die Dicke der sezierten Gewebe (hier: 7 & mgr; m) und n Medium ist der Brechungsindex des Einbettungsmediums (hier: n Medium = n PBS = 1,337, mit einem Abbe-Refraktometer bestimmt).
- Rekonstruieren und bewerten digitale Hologramme aus dem Zeitraffer-Wundheilungs Serie Beobachtung
- Rekonstruieren quantitative Phasenbilder aus der Zeitreihe Verstreichen Hologramm während der Wundheilung Beobachtung mit dem DHM Mikroskop - Software 26,27 erhalten.
- Normalisieren jeder Reihe von quantitativen Phasenbilder zu dem Bild mit maximaler Phasenkontrast.
- Die Fläche S c, die von den Zellen in den quantitativen DHM Phasenbilder durch Bildsegmentierung abgedeckt ist, die je sein kannmit der kostenlosen Software - Zelle Profiler gebildet (www.cellprofiler.org 31).
- Berechnen Sie die mittlere Phasenkontrast der Zellen Δφ Zelle im Bereich S c.
- Rufen Sie die Zelltrockenmasse DM von der durchschnittlichen Phasenkontrast Δφ Zelle im Bereich S c 15
(2)
HINWEIS: In der Gleichung 2 DM die Zelltrockenmasse bezeichnet, präsentiert S c die Fläche, die von den Zellen und α = 0,002 m 2 / kg besetzt ist. - Bestimmung der integralen Zellbrechungsindex n Zelle und der Brechungsindex des Zellkulturmediums n Medium. Bestimmen Sie n Zelle separat experimentell aus suspendierten Zellen , wie in 30 und messen n Medium mit einem Refraktometer beschrieben. Alternativ Literaturwerte für n - Zelle 30 und n Medium 29,30 verwenden.
- Berechnen Sie die mittlere Zelldicke d Zelle von λ, Δφ Zelle, n - Zelle und n Medium 26,32
(3)
HINWEIS: In Gl. 3 der Parameter d Zelle ist die durchschnittliche Zelldicke, λ bezeichnet die Lichtwellenlänge des Laserlichts bezeichnet Δφ Zelle die durchschnittliche Phasenkontrast, und n - Zelle und n Medium sind die integrale zellulären Brechungsindex und der Brechungsindex des umgebenden Mediums.
(2) 
(3) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typisches Setup für DHM Imaging für digitale holografische Mikroskopie (DHM)
Zur Durchführung Hellfeld - Bildgebung und quantitative DHM Phasenkontrast - Bildgebung angewendet wir ein inverses Mikroskop wie in Abbildung 1 B dargestellt. Das System wurde modifiziert , indem ein Modul DHM Anbringen, wie bereits 25 beschrieben. YAG - Laser λ = 532 nm) in Mach-Zehnder - Konfiguration (Figur 1 A): digitale Hologramme wurden durch Beleuchtung der Probe mit dem Licht eines frequenzverdoppelten Nd erzeugt. Seziert Gewebe wurden ex vivo auf Glasträger gleitet analysiert. Lebende Zellkulturen wurden in speziellen Petrischalen für die Beobachtung der Wundheilung beobachtet , wie gezeigt in Fig. 1 C. Die Proben wurden in Transmission Beleuchtung über ein 10X mi abzubildendenkop Objektiv (NA = 0,3) und eine Tubuslinse. Eine ladungsgekoppelte Einrichtung Kamera wurde verwendet, um die Interferenzmuster (digital außeraxiale Hologramme) durch Überlagerung des Musterbilds (Objektwelle) mit der leicht geneigten Referenzwelle erzeugt aufzuzeichnen. Die digital aufgenommenen Hologramme wurden rekonstruiert durch räumliche Phasenrekonstruktion in Verbindung mit dem optionalen holographische Autofokussierung 26,33 Verschiebung.
Beurteilung der Murine DSS-induzierter Kolitis durch DHM
Akute Kolitis wurde in Mäusen durch Verabreichung von 3% w / v Dextransulfat-Natrium (DSS) in Trinkwasser für 5 Tage induziert. Die Manifestation und Verlauf der Kolitis wurde durch Überwachung für progressive Gewichtsverlust in der DSS-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. (Abbildung 2 A angepasst von 19). Endoskopisch, mittelschwerer bis schwerer colitis beobachtet wurde , wie durch Verdicken der Kolonwand reflektiert, Veränderungen des Gefäßmuster (beispielsweise spontane Blutungen, roter Pfeil), Fibrin Exsudate (weißer Pfeil) und Granularität der Schleimhautoberfläche (2B). Herkömmliche histologische Auswertung von Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt Kolon Abschnitte deutliche Ödeme in der Kolonwand von DSS-behandelten offenbarten Verse Kontrolltiere, vorwiegend mit Sitz in der Submukosa (Abbildung 2 C grauer Pfeil). Entsprechende durch Gleichung 1 abgerufen quantitative DHM Phasenkontrastbilder und zugehörige Brechungsindex Karten, dargestellt auch die oben genannten Gewebeveränderungen. Zusätzlich ist der Brechungsindex, codiert zu 256 Graustufen angegeben Dichteunterschiede in der Gewebeschichten , einschließlich Epithel (weißer Pfeil) und Stroma (schwarzer Pfeil) in nativer, ungefärbten Gewebeproben (Abbildung 2 C). Der Brechungsindex wurde deutlich im Epithel reduziert, sowie in der Submukosa und Stroma der colitic Mäuse im Vergleich zu den gesunden Kontrollen (2 E). Zusätzlich ist eine signifikante Korrelation zwischen dem klinischen Parameter (relative Verlust des Körpergewichts) und der absoluten physikalischen Parameters (Brechungsindex) konnte beobachtet (R 2 = 0,64 linear, von 19 2 D, angepasst) werden.
Beurteilung von Morbus Crohn beim Menschen von DHM
Morbus Crohn ist oft durch bemerkenswerte entzündliche Veränderungen der Darmwand identifiziert, von gastrointestinalen Endoskopie nachgewiesen. Charakteristisch makroskopischen Merkmale umfassen Granularität der Schleimhautoberfläche, Längs Geschwüre mit Fibrin exudatIonen und spontane Blutungen (Abbildung 3 A) (auch als "Schneckenwege" bezeichnet). Die histologische Auswertung von HE-Färbung von Gewebeproben von Patienten mit aktiver CD offenbaren oft Kolonwand sowie submuköse Ödeme. Entsprechende durch Gleichung 1 auch entzündlich-vermittelte Verstärkung nachgewiesen abgerufen quantitative DHM Phasenkontrastbilder und damit verbundene Brechungsindex Karten / Schwellung der Kolonwand, hier im Epithel (Abbildung 3 B) gesehen. Weiterhin wurde der Brechungsindex als absoluter Parameter, ebenfalls signifikant in allen Wandschichten (Epithel, Stroma und submucosa) reduziert in Kolon - Gewebeproben von Patienten mit aktiver CD Versen diejenigen in Remission (Figur 3 C).
Multimodale Überwachung der Wundheilung In-vitro
Caco-2-Zellassays Wundheil wurden durchgeführt, eine besondere Petrischale unter Verwendung von Standardbedingungen zu liefern. Die Schale wird mit einem Kultureinsatz bilden zwei verschiedenen Kammern versehen, die durch einen Spalt von 500 um (4 A) getrennt sind. Zu simulieren verschiedenen physiologischen Umgebungen wurden die Zellen untersucht, entweder ohne Behandlung, stimuliert durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder mit Mitomycin c gehemmt. Das DHM Aufbau ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung der Wunde Prozess im Laufe der Zeit heilen, hier dargestellt durch repräsentative quantitative DHM Phasenkontrastbilder (codiert zu 256 Graustufen) nach 0, 22,5 und 45 Stunden nach dem Beginn des Experiments (Abbildung 4 B). Falsche farbcodierte 3D - Plots pseudo Entsprechende in Abbildung 5 zeigen die räumliche Entwicklung der Zellschichtdicke in drei dimensionen. Basierend auf der optischen Weglänge Verzögerung, die zelluläre Brechungsindex und der Gleichungen 2 und 3 ermöglicht DHM gleichzeitige dynamische Bewertung der Migration, Proliferation und die Morphologie durch zeitliche Überwachung von Zelleigenschaften wie Zelle abgedeckt Oberfläche, durchschnittliche Zelldicke und Zelltrockenmasse ( Figur 4 C). Zusammenfassend zeigen die Daten in Abbildung 4 , daß EGF Simulationsergebnisse in einer schnelleren Wanderung von Zellen in den Wundbereich, in einer erhöhten durchschnittlichen Zelldicke und in einem höheren Trockenmasse in dem Sichtfeld zu Kontrollzellen verglichen. Im Gegensatz dazu umfassen Mitomycin c gehemmten Zellen vermindert eine leicht Oberfläche als Kontrollzellen während des Verlaufs des Experiments und zeigen auch eine etwas geringere Trockenmasse zu erhöhen. Jedoch scheint die durchschnittliche Zelldicke verringert deutlich im Vergleich zu sowohl stimuliert und Kontrollzellen.
Abbildung 1. Off-Achse Verwendetes Einrichtung für digitale holografische Mikroskopie (DHM). Schematischer Aufbau des DHM - Workstation (A). Entsprechende Fotografie , die das Mikroskop - Setup (Monitor, Livebild und Steuerungssoftware (1), Off-Axis - Setup - Digital - Mikroskop (2), (B), der optische Weg des Mikroskops (grün gestrichelte Linie) und einer Probe (von rot angezeigt Pfeil, (C)). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Beurteilung der Murine DSS-induzierter Kolitis durch DHM. Der Verlauf der Kolitis wurde durch tägliche mir gefolgtasurement der relativen Körpergewicht und wiederholte endoskopische Follow-up-Untersuchung. Ein massiver Verlust der relativen Körpergewicht von Tag 4 nach dem Beginn der DSS Verwaltung (angepasst von 19) (A) wurde durch endoskopische Zeichen der etablierten Kolitis einschließlich fokale Ulzerationen und Schleimhaut Verwundbarkeit (B) begleitet. Die Analyse der herkömmlichen HE-gefärbten Kryostat-Abschnitte ergab submuköse Ödeme, Verdickung der Muscularis und einer ausgeprägten Schleimhaut Entzündungsinfiltrat in der Schleimhaut. Durch die Gleichung 1 (kodiert 256 Graustufen) bestätigte die ödematöse Veränderungen der Submukosa während des Entzündungsprozesses (weißer Pfeil zeigt an Epithel, grau Submukosa und schwarz Stroma) (C) abgerufen quantitative DHM Phasenkontrastbilder und zugehörige Brechungsindex Karten entspricht. Der relative Verlust an Körpergewicht (eine klinische Parameter) signifikant mit dem Brechungsindex ( mit einem absoluten physikalischen Parameter korreliert, R 2 linear = 0,64; (D), angepasst von 19), die deutlich im Epithel reduziert wurde, sowie in der Submukosa und Stroma der colitic Mäuse im Vergleich zu den gesunden Kontrollen (Mittelwert ± SEM, *** p <0,001;. E) Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur sehen.
Abbildung 3. Bewertung von Morbus Crohn beim Menschen durch DHM. Kolon - Gewebeproben von Patienten mit endoskopisch und histologisch Morbus Crohn bestätigt wurden untersucht (A). HE-Färbung angezeigt Verlängerung der Mukosakrypten und eine ausgeprägte Infiltrat von Entzündungszellen. Weiterhin wurde submuköse Ödeme und Erweiterung der Muscularis propria detektiert. Analyse corresponding durch Gleichung abgerufen quantitative DHM Phasenkontrastbilder und zugehörige Brechungsindex Karten (1) (codiert zu 256 Graustufen) zeigte auch ödematöse Veränderungen (hier durch einen weißen und schwarzen Stern gekennzeichnet) im Epithel (B). Deutliche Unterschiede in den mittleren Brechungsindex wurden in Proben von CD - Patienten mit aktiver Flare (clear Balken) oder den Erlass (schwarze Balken) nachgewiesen. Diese Unterschiede sind in jedem Gewebetyp gesehen (Mittelwert ± SEM, *** p <0,001; C). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Überwachung von epithelialen Wundheilung von White Lichtmikroskopie und DHM. Kultivierten Zellen wurden transferred in Petrischalen mit speziellen Einsätzen (roter Pfeil). Bevor Kultureinsätze entfernt worden waren, wurden die Zellen 24 h entweder mit EGF oder Mitomycin c behandelt, oder allein mit Medium behandelt (unstimulierte Kontrolle) (A). Nach dem Entfernen der Kultureinsätzen wurde die Wundheilung kontinuierlich durch Phasenkontrastbildgebung von DHM im Laufe der Zeit überwacht. Zell Umrisse klar erkannt werden konnte. Representative quantitative DHM Phasenkontrastbilder werden zu Beginn des Experiments gezeigt, nach 22,5 Stunden und am Ende der Messung nach 45 h (B). Panel (C) zeigt die entsprechenden zeitlichen Veränderungen in der Zelle bedeckte Oberfläche (S c), die durchschnittliche Zelldicke (d Zelle) und die Zelltrockenmasse (DM). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Illustration der Zellschichtmorphologie Änderungen durch falsche farbcodierte Pseudo 3 D Plots der Quantitative DHM Phasenkontrastaufnahmen. Repräsentative falsche farbcodierte Pseudo - 3D - Plots der quantitativen DHM Phasenkontrastbilder in 4B bei t = 0, nach 22,5 h und am Ende der Messung nach 45 h, illustrieren die räumliche Entwicklung der Dicke der Zellschichten für Steuerungs-, Mitomycin C gehemmt und EGF-stimulierten Zellen in 3D. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir zeigen , dass DHM genaue Beurteilung der histologischen Schäden in murinen Colitis - Modellen und menschlichen Kolon - Gewebeproben ex vivo zur Verfügung stellt. Darüber hinaus haben wir DHM kontinuierlich epithelialen überwachen heilenden Wunde gezeigt , während gleichzeitig multimodale Informationen zu zellulären Veränderungen bereitstellt. In DHM, ist die Rekonstruktion von digital aufgenommenen Hologrammen numerisch 32 durchgeführt. Daher kann im Vergleich zu Hellfeldmikroskopie, Zernike Phasenkontrast und Differentialinterferenzkontrast - Mikroskopie liefert DHM quantitative Phasenkontrast mit optionalen anschließenden numerischen Fokuskorrektur (Multi-Fokus - Bildgebung) 27. Quantitative Phasen Bildgebung beruht auf der Bestimmung der optischen Pfadlängenänderungen basieren und ist somit hoch, unabhängig von der Messvorrichtung verwendet. Dies erleichtert den Vergleich von Messdaten, die mit verschiedenen Instrumenten erworben werden. Darüber hinaus erfordert DHM nur geringe Lichtintensität für object-Beleuchtung. Dies ermöglicht eine minimal-invasive Analyse von ungefärbten seziert Gewebe und minimiert die Menge an Interaktion Probe erforderlich während der Langzeitzeitraffer Beobachtungen von lebenden Zellen.
Die therapeutische Rüstzeug für IBD hat sich in den letzten beiden Jahrzehnten deutlich erweitert. Neben der Einführung von Anti - TNF-α - Therapien, die wirksam sind sowohl UC und CD und akzeptable Nebenwirkungsprofile, neuartig und spezifische Antikörper - Targeting Integrine wurden kürzlich in die klinische Praxis eingeführt 34-37. Mehrere andere viel versprechende Mittel werden derzeit auf ihre therapeutische Wirksamkeit bei CED 38-40 bewertet. Jedoch vor der klinischen Anwendung beim Menschen ist die Wirksamkeit und Sicherheit dieser potentiellen Therapien in Tierversuchen nachgewiesen werden. Die DSS-induzierte Colitis ist eine der am häufigsten verwendeten murine Modelle ulcerosa, aufgrund seiner hohen Reproduzierbarkeit und niedrige Kosten 23. Darüber hinaus kann dieses Modell also zu genetisch veränderten Mäusen angewandt werden , um Stämme 41. Während systemische Marker, zB CRP, in Tiermodellen sehr variabel sind, stellt die histologische Bewertung des Dickdarms die gültigste Ansatz der Schwere der Erkrankung 42,43 zu beurteilen. Dennoch ist eine quantitative Auswertung der histologischen Entzündung nach Scoring-Systeme stark abhängig von Ermittler Know-how und Erfahrung. Automatische Bewertung und Scoring durch objektive Parameter wie möglich mit DHM überwindet diese Einschränkungen und darüber hinaus ist auch zeitsparend und vermeidet die Notwendigkeit für 19 Färbung. Darüber hinaus kann DHM verwendet werden chirurgische Kolon-Proben sowie Schleimhaut-Proben während der Endoskopie erhalten zu untersuchen.
Epithelregeneration und Wundheilung ist ein zentraler Mechanismus bei mehreren pathologischen Prozess einschließlich Magen-Darm-Geschwüren oder Anastomoseninsuffizienz. Zwar gibt es Ansätze sind vielversprechende epithelialen Wundheilung in v zu bewertenivo 44 Diese Techniken erfordern anspruchsvolle Prüfung Tools und sind derzeit nicht weit verbreitet. Daher derzeit Epithelheilung wird von Grund auf neu Assays in vitro 9 häufig untersucht. Diese Tests ermöglichen gültige Prüfung des Wundverschlusses , sondern erfordern in der Regel zunächst die Zellfärbung, die dann wiederholt verhindert Auswertung 10,45. Darüber hinaus können keine zelluläre Veränderung gewonnenen Daten mit diesem Versuchsaufbau parallel werden. Jedoch kann diese Information von großer Bedeutung sein , da es verwendet werden kann zwischen Apoptose und Nekrose 46 zur Differenzierung und Zellproliferation und -migration 46 zu beurteilen. Daher ist die Möglichkeit, Zelldicke, Trockenmasse oder Gewebedichte gleichzeitig mit der Überwachung der Wundverschluss durch DHM Untersuchung ist von hohem Wert in der Schleimhaut Forschung bestimmen.
Behandlungsziele für die menschliche IBD-Patienten haben ständig für die letzten Jahrzehnte Umstellen <sup> 47. Während zunächst wurde die Kontrolle der Entzündung betrachtet von vorrangiger Bedeutung sein, später steroidfreie Remission und jetzt die Heilung der Schleimhaut sind primäre Ziele der Behandlung 48. Vor kurzem wurde die Hypothese aufgestellt , dass die histologische Remission sogar überlegen sein können Heilung allein 49 der Schleimhaut. Während jedoch gibt es ein paar histologische Scoring - Systeme zur Verfügung für den menschlichen IBD sind, die Interobserver Variabilität bleibt hoch 50. Daher besteht ein Bedarf nach einem Standardansatz für die Bewertung von histologischen Proben Kolon. DHM kann zu diesem Ziel beitragen und weiter in einer prospektiven klinischen Studie mit menschlichen IBD-Patienten ausgewertet werden sollten.
In dem experimentellen Verfahren vorgestellt werden die Proben beleuchtet und abgebildet sehr kohärentes Laserlicht verwendet wird. Daher wird die Auflösung in DHM hauptsächlich durch Lichtstreuung und Beugungseffekte durch eine falsche Ausrichtung der Probenbeleuchtung, dicke Proben, Staub verursacht begrenzt oderandere Verunreinigungen wie kondensierte Wasser in dem optischen Weg. Um eine hochpräzise Messdaten von quantitativen DHM Phasenkontrastaufnahmen, eine sorgfältige Vorbereitung und Ausrichtung des DHM-Setup und der Probe zu erreichen, sind die wichtigsten Schritte in dem Protokoll. Gründlich optische Abbildungselemente zu reinigen, insbesondere die Mikroskopkondensor und Mikroskopobjektiv, sind erforderlich, um Rauschen zu minimieren. Auch Probenträger gleitet, Petrischale, Deckel und Boden sowie die verwendete Zellkulturmedium sollte von partikulären Verunreinigungen sein. Dies wird durch eine sorgfältige Reinigung aller Komponenten und eine ausreichende Filterung der eingesetzten Flüssigkeiten erreicht.
Weitere detaillierte Fehlersuche Tipps sind wie folgt: Wenn das digitale Hologramm und / oder die quantitative Phasen DHM Bilder von sezierten Gewebe laut sind, können mit Staub verunreinigt werden die Glasträger und Deckglas. Wenn ja, reinigen Sie den Glasträger und Deckglas mit Alkohol (zB reinem Ethanol). Wenn die dickeness von sezierten Gewebe zu groß ist (> 10 & mgr; m) und führt somit zu einer Lichtstreuung, versuchen dünner Gewebeschnitte verwenden. Für den Fall, dass die Beleuchtung mit Laserlicht wird der Objektbeleuchtung über die Mikroskope Kondensator nicht homogen verteilt, auszurichten. Wenn das Wasser auf dem Boden des Glasdeckels kondensiert induziert Streueffekte, überprüfen Sie die Temperatur der Heizkammer und Raumfeuchte. Falls die Zelldichte zu hoch oder das Zellwachstum in mehr als einer Schicht, während der Herstellung zu reduzieren Wundheilungs Assays der Zelldichte. Schließlich wird, wie DHM auf dem Prinzip der Interferometrie beruht, ist das Verfahren empfindlich gegenüber Vibrationen oder anderen mechanischen Störungen, die entsprechend den individuellen Laborumgebung variieren. Jedoch in der Regel solche Einflüsse können durch entsprechend gewählte Belichtungszeiten (typischerweise im Millisekundenbereich oder darunter) für die Holographie Aufzeichnung während der Herstellung des Versuchsaufbaus minimiert werden.
ZusammenfassendUnsere Ergebnisse zeigen , dass DHM große Vorteile gegenüber Hellfeld und bestehende Phasenkontrast - Mikroskopie - Techniken wie Zernike Phasenkontrast und DIC aufgrund seiner Fähigkeit zur quantitativen Beurteilung histologischen Entzündung ex vivo in einer fast automatisiert hält. Des Weiteren ermöglicht DHM markierungsfreie kontinuierliche multimodalen Auswertung von epithelialen Wundheilung in vitro mit minimiert die Interaktion mit den Proben. Dies ebnet den Weg für automatisierte histologische Untersuchung in Bezug auf die '' digitaler Pathologie '' und weiter ausgebaut Studien, die die translationale Potenzial von DHM bei Patienten mit IBD zu erkunden. Darüber hinaus bietet DHM neuartige In-vitro - Möglichkeiten quantitativ Zellmigration, Morphologie und Proliferation zu untersuchen.
Die Übersetzung von DHM in die klinische Praxis hat das Potenzial, IBD Diagnostik zu verbessern. Als DHM ermöglicht die Quantifizierung von verschiedenen Graden der Darmentzündung überphysikalischer Parameter wie Dichte ändert, eine objektive und eine genauere Beurteilung der Erkrankung im Sinne einer "digitalen Pathologie" scheint möglich. Die objektive Beurteilung kann einen wichtigen Einfluss auf die klinische Behandlung von IBD-Patienten haben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 | |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| DMEM/Ham's F12 | PAA Laboratories - Pasching - Austria | E15-813 | |
| EGF | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Falcon Tube 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 | |
| Isopentane (2-Methylbutane) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L | |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 | |
| Mitomycin C | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 | |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 | |
| Sodium Chloride 0.9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 | |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 | |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 | |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 | |
| Equipment | |||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 | |
| Digital holographic microscope | |||
| Component | Model | Company | |
| Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany | |
| Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany | |
| Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany | |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |
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