We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.
Klicka kemiska har undersökts för användning i många biomaterial program, inklusive drug delivery, tissue engineering och cellodling. I speciella, ljusmedierad klick reaktioner, såsom fotoinitierad tiol-en och tiol-yn reaktioner, råd spatiotemporal kontroll över materialegenskaper och tillåta utformningen av system med en hög grad av användarvänlighet riktad egendom kontroll. Tillverkning och modifiering av hydrogel-baserade biomaterial med hjälp av precisions ges av ljus och mångsidigheten som erbjuds av dessa tiol-X photoclick kemiska är av växande intresse, i synnerhet för odling av celler inom väl definierade, biomimetiska mikromiljöer. Här beskriver vi metoder för photoencapsulation av celler och efterföljande photopatterning av biokemiska signaler inom hydrogel matriser med hjälp av mångsidiga och modulbyggstenar polymeriseras av en tiol-en photoclick reaktion. Närmare bestämt är en metod presenteras för samarbetenstructing hydrogeler från allyloxikarbonyl (Alloc) -functionalized peptidtvärbindningar och vidhängande peptiddelar och tiol-funktionaliserade poly (etylenglykol) (PEG) som snabbt polymeriserar i närvaro av litium acylphosphinate fotoinitiator och cytocompatible doser av lång våglängd ultraviolett (UV) ljus. Facile tekniker för att visualisera photopatterning och kvantifiera koncentrationen av peptider tillsatta beskrivs. Dessutom är metoder som fastställts för inkapslings celler, speciellt humana mesenkymala stamceller, och bestämma deras livskraft och aktivitet. Medan bildande och initiala mönstring av tiol-Alloc hydrogeler Här visas dessa tekniker i stort sett kan tillämpas på ett antal andra lätta och radikal-initierade materialsystem (t.ex., tiol-norbornen, tiol-akrylat) att generera mönstrade substrat.
Klicka kemiska används alltmer i utformningen av material för många biomedicinska tillämpningar, inklusive drug delivery, vävnadsteknik, och kontrollerad cellodling, på grund av deras selektiva, effektiva och ofta cytocompatible reaktiviteter. 1-3 Photoclick kemi som använder ljus för att utlösa eller initiera reaktioner (t ex, azid-alkyn, 4 tiol-en, 5 och tetrazol-alken 6) är av särskilt intresse för bildning eller modifiering av biomaterial. Snabb takt under milda förhållanden och kontroll över när och var de sker med ljus gör dessa reaktioner väl lämpade för användarstyrd kontroll av biomaterial egenskaper i närvaro av celler. 7,8 I synnerhet har tiol-en photoclick kemiska använts att generera hydrogel-baserade biomaterial med robusta mekaniska egenskaper 5,9 och för inkapsling av en bred variation av celltyper, inklusive, men ingent begränsat till, humana mesenkymala stamceller (hMSCs), fibroblaster, kondrocyter och pankreasceller, med löfte för cellodling och leverans. 10,11 Vidare har dessa kemiska använts för den rumsliga mönstring av biokemiska signaler för att efterlikna de viktigaste aspekterna av infödda cellmikromiljöer och underlätta lämpliga cell-matrix interaktioner, inklusive adhesion, differentiering och invasion. 3,12
För byggandet av tiol-en hydrogeler med ljus, peptider som innehåller cysteiner (tiol) vanligen reageras med polymerer funktionaliserade med akrylater eller norbornener ( "ene") för snabb, fotoinitierad polymerisation under cytocompatible förhållanden. 13 Expanderande denna verktygslåda, försökte vi etablera metoder för hydrogel formation med nya mångsidiga och tillgängliga byggstenar som krävs minimal syntetisk bearbetning eller kommersiellt tillgängliga mot deras breda användning som syntetiska extracellulära matriser.14 Specifikt peptider modifierats med allyloxikarbonyl (Alloc) -skyddade lysiner: en för hängande, integrinbindande grupper för att främja celladhesion [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] eller två för icke-nedbrytbara eller cell nedbrytbara tvärbindningar [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G eller KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc respektive]. Rade med dessa sekvenser, var förhållanden upprättas för snabb reaktion (1-5 min) med fyra-armad tiol-modifierade poly (etylenglykol) (PEG4SH) med användning cytocompatible doser av lång våglängd UV-ljus (10 mW / cm 2 vid 365 nm) och fotoinitiatorn litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterande hydrogelerna var stabil under cellodlingsbetingelser för veckor. För att möjliggöra cell driven nedbrytning och ombyggnad, var en enzymatiskt klyvbar peptid inkorporerad i gelén tvärbindningar (dvs GPQGIWGQ), 15 och en modell primär cell, humana mesenkymala stamceller (hMSCs), fortsatt mycket lönsamt efter inkapsling och During kultur inom dessa matriser. Vidare har peptider har rumsligt mönstrade i dessa material, och hMSCs förbli livskraftig och metaboliskt aktiva i photopatterning förhållanden. Alternativa hängande peptidsekvenser, som inte visas här (t.ex., IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), kan också införlivas i matriserna för att sondera ytterligare cellinteraktioner med den omgivande mikromiljö. Dessa resultat är lovande för tillämpning av dessa hydrogel-baserade material för tredimensionell (3D) cellodling och leverans för att studera och direkta cell-matris-interaktioner för en mängd olika celltyper.
Häri metoder photoencapsulate celler och därefter photopattern biokemiska signaler inom det föreslagna hydrogelen systemet presenteras (Figur 1). Tekniker för att observera och kvantifiera dessa photopatterns också demonstreras: särskilt att i) den kvantitativa och kvalitativa användning av Ellmans analys bestämmer Modificaning av fria tioler inom mönstrade substrat och ii) den komplementära kvalitativ användning av fluorescerande peptider (AF488Pep1Alloc) att följa dessa mönster i tre dimensioner. Vidare, för att analyser bestämma viabilitet (Live / Dead viabilitet / cytotoxicitet-färgning) och metabolisk aktivitet (MTS; 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboximetoxifenyl) -2- (4-sulfofenyl) 2H-tetrazolium) presenteras så att användare kan bestämma cytocompatibility av photoencapsulation och photopatterning villkor för olika cellinjer inom hydrogel matriser. Medan protokollet kan påvisas vid facile ljusbaserad photoclick hydrogel system kan teknikerna tillämpas på ett stort antal andra radikal-initierade hydrogel system för photoencapsulation och photopatterning i närvaro av celler.
Förfarandet som presenteras här visar tekniker för att photoencapsulate celler i hydrogeler bildas av tiol-en klick kemi och därefter photopattern gelerna med biokemiska signaler. Användningen av ljus att initialt bilda hydrogeler möjliggör homogen blandning och suspension av celler i polymerlösningen före polymerisation. Snabb polymerisation "låser" gelén i form av den definierade formen och kapslar upphängda celler i hydrogel nätverket. Geler även kan gjutas in i talrika former (t.ex. glasskivor eller sprutspetsarna) beroende på den önskade slutliga tillämpningen. Till exempel kan celler inkapslade för 3D kultur i hydrogeler fästa till glasskivor är särskilt användbara för avbildningstillämpningar som ljusdämpning är begränsad inom ett tunt prov. Sprutformar kan användas för snabb inkapsling av celler, vilket gör att ett större antal prover som framställas i en kort tid (jämfört med glasskivas) som kan användas för experiment som kräver ett stort antal celler, såsom flödescytometri eller qPCR. Därefter dessa geler kan sedan mönstras med biokemiska signaler för att framkalla önskade cellulära svar såsom differentiering eller invasion. 30,31
Analyser för livskraft och metabolisk aktivitet indikerar överlevnad av celler för materialsystemet och mönstring villkor presenteras. Observera att metabol aktivitet övervakades till dag 3 i icke-nedbrytbara geler (RGKGRK peptid tvärbindning) för att bedöma de initiala effekterna av polymerisationsbetingelser och mönstringsvillkor på cellfunktionen. Dessutom kan en membranintegritet analys (Live / Dead viabilitet / cytotoxicitet färgning) av hMSCs vid 1 och 6 dagar efter inkapsling i geler formulerade med en nedbrytbar peptidtvärbindning (GPQGIWGQ) stöder att cellerna förblir livskraftiga och spridas på en vecka i kultur. Livskraft ytterligare cellinjer har rapporterats för photopatterning förhållanden 32 som liknar demanvänds här och kan utvärderas för den beskrivna hydrogelen systemet med Live / Dead färgning och metabola aktivitetsanalyser. Även om vi inte har observerat problem med cellviabiliteten med hjälp av denna materialsystem och tillhörande förfaranden (4.2 och 4.3), kan vissa celltyper vara känsliga för fria radikaler och / eller ljusexponering. I detta fall kan användare överväga att använda icke-fotoinitierad materialsystem, såsom azid-alkyn, 12 FXIII, 31 eller Diels Alder-baserade hydrogel bildningskemi. 33
Facile tekniker för att detektera och kvantifiera mönstring av biokemiska signaler inom geler också presenteras (3,1 och 3,2). Ellmans analys är av särskilt intresse eftersom de reagens är kommersiellt tillgängliga och inga extra syntetisk behandlingssteg eller mer dyra reagens (t.ex. fluorescensmärkt peptid) som krävs. Ellmans analys kan användas för att exakt bestämma den modifiering av fria tioler med biokemiska signaler enligt different photopatterning förhållanden samt att snabbt visualisera mönster. För att kvantifiera peptid inkorporering, tiol funktionella gruppen koncentration före och efter mönstring, som ett kvantitativt mått på peptid införlivande är direkt bedöms med Ellmans analys. Även om denna typ av kvantifiering kan göras med fluorescensmärkta peptider, kräver 34 avbildning baserad kvantifiering mer tidskrävande hanterings- och analysstegen (t.ex. syntes av en fluorescensmärkt peptid och generering av en kalibreringskurva för att relatera fluorescens till peptidkoncentration användning av bildanalys). För avbildning peptid inkorporering kan Ellman reagens appliceras direkt på prov och omedelbart visualiseras. Medan begränsat till x- och y-plan för mönster visualisering, kan tekniken användas som ett enkelt, rutinmetod för att bestämma om matriser innehållande fria tiolgrupper har mönstrad. Det är viktigt att notera att Ellmans analys är inte considered cytocompatible, så även om det kan användas för att observera och kvantifiera photopatterns, kan det inte ske i närvaro av celler. För avbildning mönster i tre dimensioner och i närvaro av celler, konjugering av fluorescerande peptider inom hydrogel matriser fortfarande en kraftfull och allmänt använd metod. Upplösning av mönster kan utvärderas i x-, y-, och z-plan med hjälp av konfokalmikroskopi, och denna metod är cytocompatible så att celler inom mönstrade regioner eller icke-mönstrade regioner kan identifieras. Sammantaget Ellmans analys och bildbaserade tekniker är kompletterande verktyg för forskare att bedöma både kvantitativt och kvalitativt photopatterning av biokemiska signaler inom materialsystem.
Photoclick, eller mer allmänt fotoinitierad, kemiska för bildandet och modifiering av hydrogeler i närvaro av celler är många. Form, inkapsling, och mönstring tekniker som presenteras här är inte limsad till det beskrivna materialsystem och kan tillämpas på alternativa ljusbaserade kemier, såsom tiol-alkyn, 35 azid-alkyn, 4 och andra tiol-en kemier (t.ex., tiol-norbornen), 10,13 samt med olika fotoinitiatorer, såsom Irgacure 2959, Eosin Y och kamferkinon. Observera, kan användare behöva justera procedurparametrar (t.ex. inkubationstider, polymerisationstider, celltäthet) för att se till att villkoren förblir cytocompatible för dessa andra system. Eftersom mönstringsprocessen kräver diffusion av alloc-modifierad peptid (er) i hydrogelen (2.2.3-2.2.5), kan denna process visa sig vara mycket användbara för tillsats av integrin-bindande delar (t.ex. peptider eller extracellulärt matrisprotein fragment) till hydrogelen, där det krävs fastsättning av liganden till nät för generering av dragkrafter från cellen och full integrin-aktivering. 36 Not, för biomolekyler som kanvara lika aktiva i lösning eller vid immobilisering (t.ex., tillväxtfaktorer eller cytokiner) kan inkuberingssteget för del diffusion (~ 1 timme) i hydrogelen leda till signalering händelser som convolute mönstring resultat. Andra metoder har fastställts för tillväxtfaktor immobilisering eller lokal sekvestrering för deras mönstring. 37-39 Dessutom är mönsterupplösning dikteras av kontroll över ljusexponering. Här, fotomasker tillåter skapande av mönster genom gelén djup och i x- och y-plan; emellertid kan större rymd kontroll över mönstring av biokemiska signaler inom geler uppnås med alternativa metoder för bestrålning, såsom användning av en två-foton-konfokalt mikroskop för att generera mönster i X-, Y-, och Z-plan. 34,40 Slutligen är det viktigt att notera att medan materialet systemet utnyttjas inom detta förfarande är endast initialt modifierad med biokemiska signaler, kunde ortogonala photoclick kemier användas för att medge alteransoner i matris egenskaper över tiden. 12 Förfarandet och tekniker som presenteras här lägga mångfald till nuvarande metoder för att skapa syntetiska matriser med väl definierade och spatiotemporally kontrollerade egenskaper. I synnerhet kommer den kommersiella tillgängligheten av reagenser och material som används inom detta förfarande vara till nytta för ett stort antal forskare som är intresserade av att använda hydrogel-baserade biomaterial för användning inom kontrollerad cellkultur.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Delaware Cobre program i Drug Discovery och i avancerade Biomaterials finansieras av institutionell utveckling Awards från National Institute of Generals medicinska vetenskaper vid National Institutes of Health (P20GM104316 och P30 GM110758-01, respektive), de Pew Charitable Trusts (00026178), en National Science Foundation Karriär Award (DMR-1.253.906), Burroughs Wellcome Fund (1.006.787) och National Science Foundation IGERT SBE2 programmet vid University of Delaware (gemenskap L. Sawicki). Författarna tackar Delaware Biotechnology Institute Bioimaging Center vid University of Delaware för utbildning och tillgång till konfokalmikroskopi, Ms Katherine Wiley för assistans under videoinspelning, Mr Matthew Rehmann för generöst ge hMSCs isolerade från benmärg, professor Christopher J . Kloxin och Mr Stephen Ma för generöst ger fotomasker, och Prof. Wilfred Chen för användning av den automatiserade plattläsare. </p>
Custom Peptides | Various Vendors | —- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
4arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
Flask, Round Bottom, 100 mL | Chemglass | CG-1506-05 | |
80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
Magnetic Stir Bars | Various Vendors | —- | |
Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | —- | |
Vacuum Dessicator | Various Vendors | —- | |
Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
Microcentrifuge tubes | Various Vendors | —- | 1.5 or 2 mL sizes, sterile. |
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
Photomasks | Advance Reproductions Corporation | —- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
Centrifuge | Various Vendors | —- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
Multiwell Plate Reader | Various Vendors | —- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | —- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | —- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | —- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
ImageJ | NIH | —- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |