Abstract
클릭 화학은 약물 전달체, 조직 공학, 세포 배양 등 다양한 생체 물질 애플리케이션에 사용하기 위해 연구되었다. 이러한 광 개시 티올 - 엔 - 티올 반응 yne 같은 특정 광 매개 클릭 반응에서는, 소재 특성 통해 시공간 제어 수득 사용자 지향 특성 제어의 높은 수준의 시스템 설계를 허용한다. 제조 및 광 이들 티올 photoclick X의 화학적 성질에 의해 제공되는 기능성에 의해 제공되는 정밀도를 이용하여 겔 - 기반 생체 재료의 변형이 특히 잘 정의 된, 생체 모방 미세 환경 내 세포의 배양을 위해, 관심이 높아지고있다. 여기, 우리는 세포와 티올 엔의 photoclick 반응에 의해 중합 다양한 모듈 형 빌딩 블록을 사용하여 하이드로 겔 매트릭스 내에서 생화학 적 단서 후속 포토 패터닝의 photoencapsulation 방법을 설명합니다. 특히, 방법은 공동으로 제공된다알릴에서 nstructing 하이드로 겔 (Alloc를) -functionalized 펩티드 가교 펜던트 펩티드 잔기 빠르게 리튬 acylphosphinate 광개시제 및 장파장 자외선 (UV) 광의 cytocompatible 투여의 존재 하에서 중합 티올 - 관능 화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG). 손쉬운 기술은 포토 패터닝을 시각화하고 설명하는 추가 된 펩타이드의 농도를 정량화한다. 또한, 방법은, 캡슐화 세포 특이 적 인간 중간 엽 줄기 세포의 확립 및 생존력과 활성을 측정한다. 형성 및 티올 ALLOC 하이드로 겔의 초기 패터닝 여기에 도시되어 있지만, 이들 기술은 크게 패터닝 기판을 생성하기 위해 다른 광 라디칼 개시 재료 시스템 (예를 들어, 티올 넨, 티올 레이트)의 개수에 적용될 수있다.
Introduction
클릭 화학은 점점 더 자신의 선택, 효율적으로, 그리고 자주 cytocompatible 반응성으로 인해, 약물 전달, 조직 공학, 제어 세포 배양 등 다양한 생물 의학 응용, 재료의 설계에 사용됩니다. 트리거 빛을 활용 1-3 Photoclick 화학 또는 반응을 개시 (예를 들면, 아 지드 - 알킨, 4- 티올 - 엔, 5, 테트라 졸 알켄 6)는 생체 물질의 형성 또는 수정을 위해 특히 중요하다. 그들은 빛을 발생하는 세포의 존재 생체 재료 특성의 사용자가 직접 제어에 적합. 특히 7, 8 이러한 반응을 온화한 조건과 때의 통제하에 빠른 속도는, 티올 - 엔의 photoclick 화학 물질이 사용되어왔다 없는 견고한 기계적 성질 5,9 함께 포함하지만, 세포 유형의 다양한 밀봉 용 겔 - 기반 생체 물질을 생성또한, 이러한 화학이 주요 측면을 모방하는 생화학 적 단서의 공간적 패턴에 사용 된 t 세포 배양 및 전달을위한 약속, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포), 섬유 아세포, 연골 세포, 췌장 세포, 제한. 10, 11 원시 세포 미세 환경 및 부착, 분화 및 침입는 해당 셀 매트릭스 상호 작용을 촉진한다. 3,12
일반적으로 cytocompatible 조건에서 빠른, 광 개시 중합 아크릴 레이트 또는 노보 넨 ( '엔')으로 작용 중합체와 반응시킨다. 빛 티올 엔 하이드로 겔, 시스테인 (티올)를 포함하는 펩티드의 건설 (13)이 도구 상자를 확장, 우리는 설정하고자 최소한의 합성 처리를 요구 또는 합성 세포 외 매트릭스 그들의 광범위한 사용을 향해 상업적으로 사용할 수 있었던 새로운 다목적 접근 빌딩 블록과 하이드로 겔 형성 방법에 관한 것이다.[비 분해성 또는 세포 분해 가교를 위해 K를 (세포 부착 [K (ALLOC) GWGRGDS = Pep1Alloc] 또는 둘을 촉진하기 펜던트 하나, 인테그린 결합 그룹 : 14 구체적으로는, 펩티드 (Alloc를) 알릴으로 수정 된이 라이신을 -protected ALLOC) RGKGRKGK (ALLOC) G 또는 KK (ALLOC) GGPQGIWGQGK (ALLOC) K = Pep2Alloc, 각각]. 이러한 순서로, 조건은 네 개의 암 티올 - 개질 된 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG4SH) 장파장 자외선 (365 nm에서 10 mW의 / cm 2)의 cytocompatible 용량 사용에 신속한 반응 (1-5 분) 확립 된 광개시제 리튬 페닐 -2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate (LAP). 그 결과 하이드로 겔은 주에 대한 세포 배양 조건에서 안정. 셀 기반의 분해 및 리모델링을 활성화하기 위해, 효소 분해성 펩티드 겔 가교 (즉, GPQGIWGQ), (15) 및 모델 차 전지, 인간 중간 엽 줄기 세포 (중배엽 줄기 세포) 내에 설립되어, 두린 캡슐화 및 후 매우 실용적 남아이 행렬에서 g 문화. 또한, 펩티드는 공간적으로 이러한 물질 내에서 패턴 화되어 있고, 중배엽 줄기 세포는 생존과 포토 패터닝 조건에서 대사 활성 상태로 유지됩니다. 다른 펜던트 펩티드 서열이 여기에 도시되지 않은 (예 IKVAV는 YIGSR, GFOGER 등)도 주위의 미세 환경과 추가적인 세포 상호 작용을 조사하기 위해 매트릭스 내에 통합 될 수있다. 이러한 결과는 다양한 종류의 세포에 대한 연구에 3 차원 (3D) 세포 배양 및 전달 이러한 하이드로 겔 계 물질의 도포 직접적인 세포 - 매트릭스 상호 작용을위한 유망한.
여기서, 방법은 세포를 photoencapsulate하고 제안 된 하이드로 겔 시스템 내에서 연속적으로 photopattern 생화학 적 단서 (그림 1)되게됩니다. 관찰하고 이러한 photopatterns을 정량화하는 기술이 입증되어 특히, ⅰ) 엘만 (Ellman) 분석의 양적, 질적 사용이 modifica를 결정하기 위해패턴 화 된 기판과 형광 펩타이드 (AF488Pep1Alloc)의 ⅱ) 보완 질적 사용 내에서 무료 티올의 기 세 가지 차원에서 이러한 패턴을 관찰합니다. 또한, 생존력 분석법 (생균 / 죽은 생존력 / 세포 독성 염색) 및 대사 활성을 측정하기 (MTS 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 설포 페닐) 사용자가 하이드로 겔 매트릭스 내의 다른 세포주 photoencapsulation 및 포토 패터닝 cytocompatibility 조건을 결정할 수 있도록 -2H-졸륨)가 제시된다. 프로토콜이 용이 한 광 기반 photoclick 하이드로 젤 시스템 시연되고 있지만, 기술은 세포의 존재 photoencapsulation 포토 패터닝 및 수많은 다른 라디칼 - 개시 하이드로 시스템에 적용될 수있다.
Protocol
하이드로 겔 형성 용 재료 1. 준비
- 표준 고체상 펩타이드 합성 (SPPS) 말 단기 수정 (PEG4SH) 세 단계 절차에 의해 기술 및 티올 - 관능 성 중합체로 펜던트 (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) 및 가교 펩타이드 (Pep2Alloc)를 합성. (14, 16)를 선택적으로, PEG4SH를 구입 (M을 상업적 N ~ 20 kDa의), Pep1Alloc 및 Pep2Alloc.
- 흄 후드 (1.2.1-1.2.11)를 합성 단계를 수행합니다. 14,17 아래에서 설명하는 두 단계 반응에 의해 광개시제 (LAP)를 합성 화학 물질을 취급 할 때주의하십시오 (보호 장갑, 의류, 그리고 안경을 착용) . LAP은 상업적으로 구입하실 수 있습니다.
- 오븐에서 건조 모든 유리 제품 (> 2 시간, 80 ° C).
- 격막과 빈 단일 구 둥근 바닥 플라스크 (100 ㎖) 및 커버에 교반 막대를 추가합니다.
- 링 스탠드와 클램프와 자기 교반 핫 플레이트 위에 플라스크를 고정합니다.
- 나는격막을 통해 바늘 (18 G)를 nsert과 대기에 개방 바깥 쪽 끝을 둡니다. 불활성 가스 라인에 부착 된 두 번째 바늘을 삽입합니다. 불활성 가스 라인 (예를 들어, 아르곤 또는 질소)을 열고 10 ~ 15 분 동안 플라스크를 제거.
주 : 시스템은 연속적으로 반응 내내 불활성 기체 아르곤 또는 질소로 퍼징한다. - 바늘과 주사기를 사용하여 플라스크 전환 1.5 g (~ 1.4 mL) 중 디메틸 phenylphosphonite (주의), 격벽을 관통한다. 스터 판 (중간 속도)의 전원을 켜고 내용이 플라스크의 측면에 스플래시하지 않도록주의하십시오.
- 격벽을 관통하는 바늘과 주사기를 사용하여, 플라스크 함유 디메틸 phenylphosphonite 1.6 g (~ 1.46 ml) 중 2,4,6- 트리메틸 벤조일 클로라이드 (주) 적가.
- 빛으로부터 보호하고, 아르곤 또는 질소 하에서 18 시간 동안 교반 호일 반응 용기 커버.
- 다음 날,하는을 플라스크의 높이를 올릴 교반기에 오일 조를 배치조심스럽게 오일 욕에 플라스크를 낮출 ND. 자기 교반을 유지하면서 50 ° C로 욕조와 플라스크를 가열한다.
- 2- 부타 논 50 ml의 3.05 g의 브롬화 리튬을 녹인다. 오일 조에서 플라스크를 올리고 짧게 플라스크에 부어 할 수있는 격벽을 제거, 둥근 바닥 플라스크에 리튬 브로마이드 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- : (격막 여전히 아르곤 라인 및 배출하는 바늘에 이르는 바늘 것주의) 위로 가열 한 오일 욕에 플라스크를 낮추고, 반응은 10 분 동안 진행하는 것을 허용 격벽 다시 플라스크를 밀봉. 고체 침전물을 형성 할 것이다.
- 10 분 후, 아르곤 해제 열에서 플라스크를 제거하고 혼합물이 빛에 민감한 초기 생산 한 바와 같이 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮여 4 시간 (휴식 할 수 있습니다. 벤트 바늘 장소에 보관하십시오.
- 유리 프릿 깔대기에 부어 생성물을하거나 적절한 여과지로 늘어선 깔때기. R 2 부타 논 50ml로 3 회 씻어 여액미 반응 브롬화 리튬을 가져 가십시오.
- 드라이 (첫 번째 벤치 탑에서 다음 진공 데시 케이 터에서)과 D 2 O 1 H NMR에 의해 제품을 분석 1.8-1.9 (6H, S), 2.1-2.2 (3H,들), 6.7-6.8 (2H,들), 7.3-7.4 (2H, m), 7.4-7.5 (1H, m), 7.5에서 특징적인 피크 -7.7 (2H, m). 14,17
- 하이드로 겔 (표 1)를 만들기 위해 준비해야하는 각 원액 (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP)의 양과 농도를 계산하는 스프레드 시트를 사용합니다. 모든 반응기는 중합시 소비되도록 비 패턴 젤을하려면 해당 [SH] = [Alloc를]를 확인합니다. 겔의 포토 패터닝가 계획되면 Pep1Alloc와 이상 반응의 화학량 론에 기초하여 겔 형성시 티올 작용기 과량 (예를 들어, 0.2 내지 5 mm의 [SH]> [Alloc를])를 포함한다.
참고 : 젤 (5 분 이내) 빠른 중합을 보장하기 위해 PEG4SH을 (중량 %)보다 5 중량 %를 포함해야합니다. 그러나, 낮은 중량 % 범위응용 프로그램이 낮은 계수 (예를 들어, <0.5 kPa의)와 하이드로 겔을 요구하는 경우들 탐구 할 수있다; 중합 확인하고 이러한 낮은 중량 % 조성물에 대해 적절하게 조정해야합니다. 마찬가지로 Pep1Alloc 농도는 티올 - 관능 펩티드 문헌에보고 된 바와 같이 다른 애플리케이션 (예를 들면, 0.2 내지 5 mM)을 조정할 수있다. 18-21 LAP 농도가 0.067 중량 % (2.2 mM)을 이하 설명 된 바와 같이, 같은 주위 권장 더 높은 농도는 세포 생존을 감소시킬 수있다. - 표 1의 계산에 기초하여 세포 배양을위한 무균 조건 하에서 Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH 및 LAP의 재고 솔루션을 준비합니다.
- Pep1Alloc 및 Pep2Alloc 들어 개별적 펩티드 합성에서 Pep1Alloc 및 Pep2Alloc의 총 질량 무게와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PS) 및 0.5 μg의 / ㎖ fungizone (FZ)를 함유하는 멸균 포스페이트 완충 염수 (PBS)에 용해. 준비 재고 솔루션 범위의 전형적인 농도펩티드 20 내지 100 ㎎ / ㎖에서. 사용할 때까지 -20 ° C에서 연부 조직 응용 프로그램에 대한 관련 최종 계수 (영률 ~ 0.5 kPa의)와 젤. 22, 23 나누어지는 및 저장을 달성하기 위해이 주식을 섞는다.
- PEG4SH를 들어, 멸균 microcentrifuge 관에 PEG4SH 무게와 PBS + PS + FZ에 용해. 250-430 ㎎ / ㎖에서이 원액 범위의 전형적인 농도 (중량 20 ~ 30 %의 PEG4SH).
- LAP 들어 무균 마이크로 원심 튜브에 LAP의 무게를 7.5 mg / ml의 최종 농도로 PBS + PS + FZ에 녹인다.
참고 : PEG4SH 및 LAP의 새로운 솔루션을 준비 일관성 중합 시간을 보장하기 위해 모든 캡슐 또는 겔 실험을 권장합니다.
- 히드로 겔을 형성하기위한 멸균 주사기 팁 금형을 준비합니다.
- 조심스럽게 면도날을 사용하여 1 ml를 주사기의 오프 팁을 절감하고 이후에 주사기 샤프트에서 플런저를 제거합니다.
- 15 분 70 % 에탄올에서 주사기 플런저 샤프트 잠수함무균 세포 배양 후드에서 D 장소 (30 분) 건조. 에탄올을 초과 방울 주사기 샤프트 내부에 남아있는 경우, 그들을 밖으로 밀어 플런저를 사용합니다.
- 멸균 유리 히드로 겔을 형성하기위한 금형을 밀어 준비합니다.
- 유리 슬라이드를 (2 배수) 및 고무 가스켓 적시 (0.254 mm의 두께를, 심으로 사용이 작은 조각을 디스크와 사각형 펀칭, 또는 사각형 프레임 모양) 70 % 에탄올에 15 분 동안, 무균 세포 배양 후드 장소 말리다.
- 제조자의 지시에 따라 부착 방지 코팅 살균 슬라이드 코트 절반 활 주면 (4 슬라이드가있는 경우 예를 들면,이 슬라이드 반 접착제를 도포 함)에 겔의 상부의 부착을 방지 할 수있다. 이들은 유리 슬라이드 금형의 상부로서 기능한다.
- 주사기 또는 유리 슬라이드 금형 램프를 보정합니다.
주 :이 실험에서, 외부 필터 어댑터 조립체 365 nm의 외부 필터 수은 아크 램프를 사용 하였다. 기타 램프다른보고 한 장파장 자외선의 적절한 강도를 생산 S이 사용될 수있다. 24-27- 모든 샘플에 걸쳐 비교적에도 빛의 강도를 보장하기 위해 액체 - 충전 도광판의 단부에 콜리 메이팅 렌즈를 부착. 필요한 경우, 관심의 샘플을 포함하는 스폿 사이즈를 달성하기 위해 샘플 (S)으로부터의 광 가이드의 거리를 조정한다.
- 미세 원심 튜브 홀더 컷 주사기 금형 배치 (수직 위치에서 주사기 금형을 보유하기 위해). 샘플이 개최되는 주사기 팁의 높이에 복사계를 잡고 365 nm에서 10 mW의 / ㎠의 광 강도를 달성하기 위해 셔터 (% 개방)을 조정합니다. 나중에 사용하기 위해 조정 된 설정을 기록합니다.
- 멸균 표면의 상단에 유리 슬라이드 금형을 배치 (예를 들어, 바이오 안전성 캐비닛 내에서 피펫 팁 상자의 맨 위). 유리 슬라이드 금형의 높이 복사계 검출기를 잡고 10m의 광 강도를 달성하기 위해, 셔터 (% 개방)를 조정365 nm에서 W / cm 2. 나중에 사용하기 위해 조정 된 설정을 기록합니다.
2. 하이드로 겔 형성과 포토 패터닝
- 비 패턴 히드로 겔의 제조.
주 : 히드로 겔은 세포 배양 용도로 사용되는 경우, 프로토콜이 시점에서, 모든 후속 단계는 멸균 캐비넷 또는 후드 멸균 조건 하에서 수행되어야한다.- 스프레드 시트 계산 (표 1 예 참조)에 따라 PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, 그리고 PBS + PS + FZ의 재고 솔루션을 섞는다. 용액의 혼합에도되도록 격렬 얻어진 겔 전구체 용액을 피펫.
- 멸균, 컷 주사기의 끝 부분에 겔 전구체 용액 (PEG / 펩 / LAP / PBS)의 10 ~ 20 μl를 피펫 팅에 의해 주사기 팁 성형 두께 하이드로 겔을 준비합니다. 주사기 당 하나의 겔을 약 0.5 ~ 1.5 mm 두꺼운 볼륨과 주사기 직경에 따라.
참고 : 큰 볼륨은 탐구에 기초 할 수있다상한이 중 Pep1Alloc에 대한 확산 제한에 따라있을 수 있습니다 원하는 겔 크기 포토 패터닝 및 / 또는 영양 / 캡슐화 된 세포 /에 폐기물 세포 배양시. - 비 코팅 유리 슬라이드의 가장자리 주위에 고무 패킹 (0.254-mm 두께)를 배치하여 유리 슬라이드 금형 얇은 하이드로 겔을 준비한다. 피펫 5-10 μL 겔 전구체 용액을 비 코팅 유리 슬라이드로 (단일 또는 다중 5-10 μL 겔은 하나의 슬라이드 상에 용액의 하나 이상의 도트를 피펫 팅에 의해 제조 될 수있다), 항 접착제로 코팅 된 유리 슬라이드를 배치 겔 용액의 상부에 (큰 젤, 유리 슬라이드의 크기까지의 최종 용도에 따라 제조 될 수있다). 안정 작은 바인더 클립으로 유리 슬라이드를 고정합니다.
- 램프 아래에 배치 형 램프 세기를 설정 (예를 들어, % 셔터 개방)의 단계 1.7.2에서 측정에 기초 주사기 팁 금형 또는 유리 슬라이드 금형 겔 표면의 경우 10mW / ㎠를 달성하고각각 1.7.3.
- 젤의 완전한 중합을 할 수 있도록 1 ~ 5 분 동안 빛을 적용합니다. 내의 계수와 완전히 중합 된 하이드로 겔을 제조하기 위해 낮은 PEG4SH 함량 (5-8 중량 %, 3 ~ 5 분)와 겔 높게 PEG4SH 함량 (8 중량 % 이상, 1 분) 이상으로 겔에 대한 짧은 중합 시간을 사용 연부 조직의 범위 (0.5 kPa의).
- 멸균 접시에 멸균 처리하지 않은 48 웰 플레이트에 주사기 팁 금형에서 장소 젤, 장소 유리 슬라이드.
- 세포 배양 배지 또는 적절한 버퍼 3 × 15 분을 씻어 (예를 들어, PBS + PS + FZ, 엘만 (Ellman) 반응 버퍼) 아래에 설명 된대로, 계획된 실험을 기반으로.
- 무늬 히드로 겔의 제조.
- Pep1Alloc와 이상 반응에 대한 무료 티올 (0.2-5 mm)를 떠나, 스프레드 시트 계산에 따라 PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, 그리고 PBS + PS + FZ의 재고 솔루션을 섞는다. 용액의 혼합에도되도록 격렬 전구체 용액을 피펫.
- 2.1.6에 단계 2.1.2에서 레이아웃으로 두껍고 얇은 하이드로 겔을 준비합니다.
참고 : 이전 포토 패터닝에 성장 매체에 젤을 올려 놓지 마십시오. 자유 티올 성장 배지의 종류에 의해 소비 될 수있다 (예를 들면, 티올 디설파이드 함유 단백질과 형성) 및 추가 처리 단계를 거치지 않고 겔의 패터닝을 허용하지 않을 것이다 (예를 들어, 이황화 결합의 감소). - Pep1Alloc의 솔루션을 준비합니다 (최종 농도 ~ 3-20 ㎎ / ㎖) 및 2.2 MM의 LAP.
- Pep1Alloc / LAP 솔루션을 미리 형성된 젤을 덮고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
- 초과 Pep1Alloc / LAP 솔루션을 제거합니다. 겔이 주사기 팁으로 성형 된 경우,주의 깊게들이 패터닝 멸균 유리 슬라이드에 배양되어있는 48 웰 플레이트에서 겔을 전송 주걱을 사용한다.
- syringe- 유리 슬라이드 성형 젤 위에 직접 원하는 패턴으로 포토 마스크를 놓습니다. 마스크의 인쇄 부분이 최적 PATT 용 겔 접촉하는지 확인ERN 충실도 (즉, 마스크 바로 읽고 아래 유제면이어야한다). 램프 아래에 배치 샘플은 유리 슬라이드 (단계 1.7.3)에 사용되는 램프 설정으로 1 분 동안 조사.
- 패터닝 후, 장소 멸균, 48 웰이 아닌 조직 문화 처리 플레이트에 젤 주사기 성형, 장소 유리 멸균 접시에 유리 슬라이드에 부착 젤 슬라이드 성형.
- 세포 배양 배지 또는 적당한 완충액으로 3 회 15 분간 린스 (예, PBS + PS + FZ, 엘만 (Ellman) 반응 완충액) 실험 계획에 기초.
3. 떠올리 및 포토 패터닝의 정량화
- 엘만 (Ellman) 분석은 Photopatterned 히드로 겔의 정량화 무료 티올을 감지하고 있습니다.
- 엘만 (Ellman) 반응 버퍼, 시스테인 작업 솔루션, 표준, 아래에 설명 된대로 엘만 (Ellman) 시약을 준비합니다.
- 엘만 (Ellman) 반응 버퍼 2.4 g 인산 나트륨 (NA 2 HPO 용해4) 및 74.4 mg을 200 ml의 dIH 2 O (0.1 M 나 2 HPO 4, 1 mM의 EDTA)에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA). 수산화 나트륨 (NaOH를) 또는 인산 (H 3 PO 4)의 솔루션을 7.5-8에 pH를 조정합니다.
- 시스테인 작업 솔루션의 경우, 15 ml의 반응 버퍼 (2 MM의 시스테인)에서 5.27 mg의 시스테인을 용해.
- 시스테인 표준, 2, 1.5, 1.25, 1, 0.75, 0.5, 0.25 및 0 mM의 시스테인의 최종 농도로 반응 완충액 시스테인 작업 용액을 희석.
- 엘만 (Ellman) 시약 1 ml의 반응 완충액 4 mg을 엘만 (Ellman) 시약을 용해. 초음파 처리는 완전히 엘만 (Ellman) 시약을 용해한다.
- 엘만 (Ellman) 분석 (그림 2)와 젤 무료 티올의 농도를 정량화.
참고 : '씬'5 ㎕의 하이드로 겔, 유리 슬라이드 사이에 성형은, 아래의 절차에 설명 엘만 (Ellman) 시약 t의 빠른 확산을 허용하는 것이 좋습니다겔 hrough (즉, 상기 시약을 두꺼운 겔을 통해 확산보다 긴 시간이 걸린다).- 비 팽윤 체적에 기초하여 '얇은'5 μL 겔 (V 용 S)의 팽윤 겔의 부피를 결정 Q.
- 주사기 금형을 사용하여 세 20 μl의 '두께'젤을 확인합니다. 엘만 (Ellman) 반응 버퍼에 배치 겔 24 시간 동안 연속적는 (평형 부어 질량, M S)을 무게. 젤을 동결 건조 및 이후 (건조 질량 M의 D)를 무게.
- Q에 의해 비율 28 팽윤 부피를 계산, 두꺼운 젤에 대한 측정 된 질량을 사용 = 1 + ρ 폴리머 / ρ 용매 (M S / M D-1) ρ 폴리머 = 1.07 g / cm 3 PEG를 들어, 29 ρ 용매 = 1.0 g / cm 3 PBS / H 2 O에 대한
- 겔의 이론적 건조 질량은 엘만 (Ellman) 정량법 (여기에 사용되는 계산 5 μL '얇은'겔 u는 전형적SED), 개별 구성 요소의 대중 PEG4SH, Pep1Alloc 및 Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc)를 합산하여. M PEG4SH 의해 계산 된 예를 들어, 10 중량 %를 함유하는 PEG4SH 5 μL 겔은 약 0.000535 g PEG를 포함 = 0.005 cm 3 × 1.07 g / cm 3 × 0.10. Pep1Alloc 및 Pep2Alloc 질량 이러한 수용액에 대한 ρ ≈ 1.0 g / cm 3 가정 용액 중량 %에 기초하여 유사한 방식으로 (값 스프레드 참조)에서 계산 될 수있다.
참고 : 젤은 또한 건조 대신 이론적 건조 질량을 계산하는 무게 될 수있다. 그러나 일관 얇은 5 μL 겔의 건조 질량을 측정하기 어려울 수도있다. - 예측 건조 질량 및 '두꺼운'겔 (단계 3.1.2.1.1의 식)을 '얇은'젤 예측 팽윤 질량 M S를 계산으로부터 결정되는 Q 값에 기초하여. 그 ρ ≈ 1.0 g / cm 가정
참고 : 위의 방법은 '얇은'5 μL 젤로 부어 젤을위한 V s을 (를) 결정하는 것이 좋습니다는 계량 전송하기가 어렵다.
- 2.2 (5 μL 볼륨)에 설명 된대로 패터닝 얇은 하이드로 겔을 형성한다. 특히, 초과 무료 티올와 젤과 빛으로 전체 겔을 노출 홍수 명확한 커버 슬립을 사용하여 Pep1Alloc 이러한 샘플의 '패턴'반을 (예를 들어, 초과 티올 6 총 젤 : 3 수정되지 않은 비 'patterned '3' ) '패턴.
참고 :이 분석을 위해, 젤은 포토 마스크없이 빛에 노출 홍수있는 '패턴'. 이 방법은 전체 겔 샘플에서 소비 자유 티올의 총 수를 결정하고, 펩티드로 변형 될 수있는 방법을 효율적으로 자유 티올을 입증하기 위해 사용된다. 이 정보에서,포토 마스크의 패터닝 동안에 소모 자유 티올의 수는 겔 두께와 패턴 영역 (노광 영역)에 기초하여 예측 될 수있다. - 찾는 '패턴'을 48- 웰 플레이트의 웰에서 '겔 비 'patterned 및 발생하는 팽윤 겔 평형에서 반응 종의 확산을 허용하도록 엘만 (Ellman) 반응 완충액 3 × 15 분을 헹군다.
- V의 반응과 버퍼 20 μL의 배수가되도록 세정 젤에 추가 엘만 (Ellman) 반응 버퍼를 추가합니다. 예를 들어, 예측 V (S)가 15 μL 인 경우, 5 ㎕의 반응 완충액 (20 μL)을 첨가하고, 상기 예측 V (S)가 30 μL 인 경우, 10 μL 반응 완충액 (40 μL)을 추가한다.
- 이전 단계 (즉, 이전 단계는 V를 S 있었다면 + 추가 반응 B에 사용되는 양에 따라 20 μL의 배수로 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 시스테인 규격 (함유하지 않는 겔) 피펫uffer = 40 μL은) 개별 빈 우물에 각 표준의 40 μl를 추가합니다.
- 반응 버퍼 (; 예를 들어, 20 μL 또는 단계 3.1.2.5 40 μl를위한 367.2 ㎕를위한 183.6 180 ㎕의 반응 버퍼 + 3.6 μL 엘만 (Ellman) 시약의 배수)에서 엘만 (Ellman) 시약을 희석.
- 표준 및 샘플을 포함하는 웰에 희석 엘만 (Ellman) 시약을 추가합니다. 20 μL 샘플의 경우, 각 웰에 183.6 μL 솔루션을 추가 할 수 있습니다. (그에 따라 샘플의 크기에 따라 또는 확장) 40 μl의 샘플에 대한 희석 엘만 (Ellman) 시약의 두 번이 금액.
- (TNB 부화 또는 1 시간 및 (실온)에서 30 분 동안 진탕 기 상에 위치 시키거나, 용액의 색상은 육안에 의해 겔의 색과 일치 할 때까지 옐로우 2- 니트로 -5- thiobenzoate가 음이온의 충분한 확산을 위해 겔에서 무료 티올과 엘만 (Ellman) 시약의 반응으로 생성되는 2).
- 샘플들에서 용액 100 μl를 타고tandards 및 96 웰 플레이트의 우물에 배치합니다.
- 접시 리더에서 405 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
- 데이터를 처리하기 위해, 표준 곡선 (단계 3.1.1.3에서 샘플) (농도 대 흡광도) 플롯 및 선형 함수를 장착한다. 선형 함수의 '희석 겔'용액 (겔 + 반응 완충액)에 자유 티올의 농도를 사용하여 흡광도의 측정에 기초하여 계산 될 수있다. 마지막으로, 계정에 반응 버퍼와 '희석'을 복용 반응 버퍼없이 젤의 무료 티올 농도를 결정한다. (15 μL 겔 5 ㎕의 반응 완충액으로 희석 된 경우 예를 들어, 15분의 20을 곱).
- 비 팽윤 체적에 기초하여 '얇은'5 μL 겔 (V 용 S)의 팽윤 겔의 부피를 결정 Q.
- 엘만 (Ellman) 시약 (그림 3A)와 photopatterns의 시각화.
- 1 시간 동안 엘만 (Ellman) 반응 버퍼에 Pep1Alloc로 패턴 얇은 하이드로 겔을 만끽 해보세요.
- 부드럽게 조직과 하이드로 겔의 가장자리 주위를 닦아 과잉 반응 버퍼를 제거합니다.
- 직접 겔의 표면에 피펫 엘만 (Ellman) 시약. 즉시 컬러 카메라와 조명 10 배의 현미경이나 실체에 대한 이미지입니다.
주 : 시각화 패턴 겔 걸쳐 확산 비 패턴 영역 티올과의 반응시 엘만 (Ellman) 시약의 분해에 의해 생성 된 황색 TNB 2- 이온으로 5 분 이내에 방출되므로 젤 즉시 이미징되어야한다. 비 패턴 영역은 육안으로 희미하게 황색 표시; 더 나은 해상도와 작은 패턴, 배율 (예를 들어, 현미경의 사용)이 필요합니다.
- 엘만 (Ellman) 반응 버퍼, 시스테인 작업 솔루션, 표준, 아래에 설명 된대로 엘만 (Ellman) 시약을 준비합니다.
- 형광 펩타이드와 Photopatterns (그림 3B)의 시각화.
- 더 높은 해상도 또는 3 차원 패턴을 시각화를 들어, 단계 2.2에서 젤에 AF488 수정 Pep1Alloc (또는 유사한 형광 펩타이드)를 photopattern.
- 형광 현미경 이미지. 공 초점 현미경은 Z-일을하려면 여기를 사용할 수있다ACK 패턴이 Y 축, X 축에서 관찰 될 수 있도록 겔의 이미지 및 Z 플레인.
주 : 형광 겔은 AF488의 형광 물질과 형광 극대의 안정성을 보장하기 위해 빛으로부터 보호되어야한다. (4 ° C에서 호일에 싸서 용기에 저장) 빛으로부터 보호하는 경우 형광 펩타이드가 매우 안정적이기 때문에 젤은 즉시 이미지화 할 필요가 없습니다.
히드로 겔 및 포토 패터닝 4. 세포 캡슐화
- 수집 및 캡슐화에 대한 세포를 준비합니다.
- 표준 멸균 포유 동물 세포 배양 절차에 따라,를 Trypsinize 및 플레이트에서 관심의 세포를 수집합니다. 박리가 발생한 후 성장 매체와 트립신을 끄다의 (a T-75 플라스크, 5 ㎖의 트립신을 위해, 예를 들어, 총 15 ml의 5 ml의 매체 접시를 씻어, 5 ml의 배지로 소멸).
참고 : 트립신 시간은 세포 유형 사이에 차이가 있지만, 일반적으로 5에서 15 분 사이에 발생할 수 있습니다. 다른 세포 detachment 화제 (예, 벌 센과)은 원한다면 세포를 수집하기 위해 사용될 수있다. - 대량 세포 현탁액 (90~110 XG, 5 분)을 원심 분리하면서 혈구 또는 다른 세포 계수 장치를 사용하여 트립신 세포 현탁액의 분취 량의 (a (100)의 최소 또는 제조사의 프로토콜에 따라)를 셀 카운트. 초기 트립신 세포 현탁액 너무 묽은 경우 최소한의 PBS 부피 또는 성장 배지 재 카운트에서 원심 분리 후 세포 펠렛을 다시 일시.
- (전 중합) 겔 용액을 혼합 할 때 5,000 세포 / μL가되도록 마이크로 원심 튜브에 각각 겔 조건 PBS의 최소 부피의 세포 및 분취 부분을 다시 일시.
주의 : 전형적인 세포 분취 액 300,000-500,000 셀을 포함하고 5,000 세포 / μL 3-5 × 20 μL 겔에 사용될 수 겔 / 세포 현탁액 60-100 μL를 만들기에 충분하다. 더 높거나 더 낮은 세포 밀도가 세포 - 세포의 양에 따라, 캡슐화에 사용될 수있다대 세포 - 매트릭스 접촉은 각각 원하는, 그리고 각각의 용도에 대해서 확인해야한다. - 원심 분리기 세포 / PBS 씩 (90-110 XG, 5 분).
- 조심스럽게 오른쪽 캡슐화 전에 microcentrifuge 관에서 세포 펠렛에서 PBS를 대기음.
주 : 세포 전단력에 민감한 경우, 초 원심 분리 단계는 (예를 들어, 혈구) 카운트이어서 각 겔 상태에 필요한 부분으로 트립신 세포 현탁액 (트립신 + 미디어 + 세포) aliquotting에 의해 제거 될 수있다. 이 분취 량 (90-110 XG, 5 분) 한 번 원심 분리하고 트립신 + 미디어는 캡슐화를위한 세포 펠렛을 떠나, 오프 흡입됩니다.
- 표준 멸균 포유 동물 세포 배양 절차에 따라,를 Trypsinize 및 플레이트에서 관심의 세포를 수집합니다. 박리가 발생한 후 성장 매체와 트립신을 끄다의 (a T-75 플라스크, 5 ㎖의 트립신을 위해, 예를 들어, 총 15 ml의 5 ml의 매체 접시를 씻어, 5 ml의 배지로 소멸).
- 비 패턴 히드로 겔의 캡슐화 세포.
- 즉시 PBS를 흡입 한 후, / μL 5,000 세포의 최종 농도 스프레드 시트의 계산 PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, 그리고 PBS + PS + FZ에서 펠렛 세포를 일시 중지합니다.
- 금형 및 DESCR 같은 하이드로 겔을 중합단계 ibed은 2.1.6에 2.1.2.
참고 : 유리 슬라이드 형의 세포를 캡슐화 할 때 세포 사망을 초래할 수있는 젤, 전단 방지하기 위해 상단 슬라이드 후 중합을 제거 할 때주의를 기울여야합니다. 금형으로부터 겔의 분리를 돕기 위해, 슬라이드 금형은 쉽게 가기 슬라이드를 제거 할 수있어, 개스킷 및 습윤 겔을 중합 후에 무균 PBS 또는 성장 매체에 배치 될 수있다. 전단이 완전히 방지하는 방법은 주사기 금형의 사용을 통해서이다. - 성장 매체에 린스 겔은 3 × 10 분 미 반응 종과 초과 LAP를 제거합니다.
- 추가 분석을 위해 원하는 시점까지 CO 2, 37 ℃에서 성장 배지에서 인큐베이션 겔, 5 %. 매체마다 48 시간 또는 응용 프로그램 (특정 세포 유형과 매체에 대한 예를 들어, 일반적인 수유 간격)에 대해 같은 결정을 보충.
- 세포의 존재에 셀 및 포토 패터닝을 캡슐화.
- 즉시 PBS를 흡입 한 후,/ μL 5000 세포의 최종 농도로 스프레드 시트 계산 PEG4SH, Pep2Alloc, LAP 및 PBS + PS + FZ에서 세포 펠렛을 정지. Pep1Alloc와 이상 반응에 대한 무료 티올 (예를 들어, 2 mM)을 적절한 농도를 남겨주세요.
- 단계 2.2.8에 2.2.2에 설명 된대로 금형, 중합 및 패턴 하이드로 겔.
- 미 반응 종과 초과 LAP을 제거하는 패터닝 후 성장 매체에 린스 겔은 3 × 10 분.
- 추가 분석을 위해 원하는 시점까지 CO 2, 37 ℃에서 성장 배지에서 인큐베이션 겔, 5 %. 매체마다 48 시간 또는 응용 프로그램과 같은 결정을 보충.
5. 캡슐화 된 세포의 생존 및 대사 활동을 결정
- 캡슐화 된 세포 생존 (그림 4A)를 파악하기 위해 / 라이브 죽은 세포 독성 분석을 수행합니다.
- g에서 매체의 확산을 허용하는 PBS로 3 회 15 분 겔로부터 성장 배지를 제거하고 린스ELS.
- 해동 라이브 / 죽은 세포 독성 분석 솔루션 (에티 디움 호모 다이머-1과 칼 세인의 AM).
- 1 ml의 멸균 PBS로 4 mM의 칼 세인의 AM 솔루션의 2 MM의 에티 디움 호모 다이머-1과 0.5 μL의 2 μl를 추가합니다. 소용돌이는 완전한 혼합을 보장합니다.
- 48- 웰 플레이트에서 각각의 주사기 형 겔을 300 ㎕의 염색 용액을 추가하거나 멸균 접시에 유리 슬라이드에 겔의 표면을 커버하기에 충분하고, 45 분 동안 배양한다.
- 과잉 염색 액을 제거하고 젤 (PBS와 3 X 15 분)에서 여분의 염료를 제거하는 린스.
- 10X 및 525분의 488 nm의 예 / 엠에서 공 초점 현미경 (Z 스택 이미지) 또는 z 스택 기능을 가진 에피 형광 현미경의 이미지입니다. Z 축 스택 돌출 라이브 (셀 전신 녹색), 데드 (적색 핵) 이미징 소프트웨어로 세포 수를 계수하여 생존 세포 수를 정량화.
- (세포 활성 후 밀봉을 결정 Figu을 대사 활성 분석을 수행하여) (b) 재.
- 24 시간 신선한 성장 배지로 사료 캡슐화 세포를 분석하기 전에.
참고 : 몇 가지 추가 우물 제어 (배경 판독)으로 (아무 세포에는 젤이나 젤을 포함하지 않는)에 매체를 추가합니다. - 관심의 시점에서, MTS 시약 용액을 해동.
주 : 시간에 따른 대사 활성을 측정하기 위하여, 초기 시점은 (12-24 시간 후 - 밀봉) 이후의 시간 포인트에 비교를위한 기준으로서 추천된다. - 각 웰 (100 ㎕의 성장 매체 당 20 μL)에 MTS 시약을 추가합니다.
- 제조업체의 지침에 따라, 37 ° C에서 1-4 시간 5 % CO 2에 대한 샘플을 품어.
주 : MTS 세포를 감소시키고, 겔에서 포르 마잔 생성물의 확산을 허용하기 위해 배양 시간이 충분해야한다. 따라서, 이러한 주사기 팁 젤과 같은 두꺼운 겔은 충분한 MTS 감소 및 확산을위한 이상 배양 시간 (~ 4의 시간)을 필요로 할 수있다. - 감소 MTS / 매체 100 μl를 피펫접시 리더에서 490 nm에서 96 웰 플레이트와 기록 흡광도의 깨끗한 우물에.
- 베이스 라인의 흡광도 값을 생성하도록 샘플의 흡광도 값으로부터 세포가없는 웰의 배경 흡광도를 뺀다.
- 24 시간 신선한 성장 배지로 사료 캡슐화 세포를 분석하기 전에.
Representative Results
설치 및 절차는도 1에 도시되어 세포와 캡슐화 된 세포를 포함하는 후속 photopattern 겔 photoencapsulate하고, 스톡 용액을 제조 한 예는 10 중량 % 겔은 표 1에 제공된다 형성 하였다. 표 1을 사용하여, 단량체의 양 (PEG4SH을 , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) 및 하이드로 겔을 중합하는 데 필요한 광개시제 (LAP)을 계산한다. 이러한 계산을 바탕으로, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc 및 LAP의 재고 솔루션을 준비하고 함께하고 형성하는 각각 (그림 1A)를 젤, 포토 패터닝을위한 Pep1Alloc없이 혼합. 그 후, 세포를 플레이트에서 수집 계산하고, 캡슐화 (그림 1B) 적절한 양으로 원심 분리된다. 세포 펠렛은 겔 형성 용액 (PBS 펩티드 / 폴리머 / LAP)에서 재현 탁하고, 세포 / 단량체 혼합물은 유리 주사기 몰 전사DS. 세포들은 빛의인가시 하이드로 겔 내에서 (도 1C) (10 mW의 / cm 365 nm에서 2 ~ 5 분)으로 캡슐화된다. (도 1D)을 포토 패터닝 들어 겔 중합 매트릭스 내로 펩티드 및 개시제의 확산을 허용하고, 1 시간 30 분, 30 분 Pep1Alloc 및 LAP에 침지된다. 이 펩티드 함유 겔은 원하는 패턴을 포토 마스크로 덮여 매트릭스 내에서 무료 티올에 펩티드 공역 빛 (1 분)의 두 번째 투여 량에 노출되어있다. 펜던트 사슬은 공유 적절한 세포 - 매트릭스 상호 작용을 촉진하고 체외에서 세포 기능과 운명을 프로빙 방향으로 원시 세포 미세 환경의 주요 기계적 및 생화학 적 특성을 흉내 낸, 빛에 노출 된 지역에서 젤에 연결되어 있습니다.
엘만 (Ellman) 분석은 photopatte 내에서 겔 수정 및 펩타이드 결합을 정량화 할 수있는 손쉬운하고 저렴한 방법을 제공rned 기판. 패턴 및 비 패턴 젤 (즉, 또는 펩티드 수정하지 않고 젤) 엘만 (Ellman) 반응 버퍼 후 중합에 배어있다. 다음으로, 시스테인 표준 및 버퍼에 담가 겔 48 웰 플레이트에 넣고 엘만 (Ellman) 시약 (왼쪽 그림 2A)와 함께 배양한다. 1 시간 30 분 후 샘플의 분취 량을 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 배치하고, 흡광도를 405 nm에서 기록된다. 시스테인으로부터 표준 검량선 (도 2a, 오른쪽) (흡광도 선형 피팅 농도 VS) 플롯하고, 겔의 자유 티올의 금액은 희석 인자에 기초하여 결정될 수있다. 10 중량 %의 겔의 여러 중합 조건에 포토 패터닝이 유리 티올 농도는도 2b에 도시되어있다. (파란색 막대, I = 1 분, II = 5 분) Pep1Alloc없이 1 또는 5 분 동안 중합 젤은 t을 나타내는 통계적으로 유사한 무료 티올 농도가모자 빠른 반응이 발생하고 겔화 1 분 (양측 t 검정, P> 0.05) 내에 완료됩니다. 따라서, 빛에 추가 노출 (2-5분)는 작용기의 추가 전환 발생하지 않습니다. Pep1Alloc없이 1 분간 중합 젤 (30)과 90 분 (3 ㎎ / ㎖) 및 LAP (2.2 mM)을 (녹색 바, II = 30 분, IV = 90 분) Pep1Alloc 적신 빛의 두 번째 투여 량에 노출 1 분. 무료 티올의 감소 (1 분 조건에 대한 60-80%)는 이러한 조건 하에서 펜던트 단서와 젤의 효율적인 변경을 나타냅니다. 높은 변형이 필요한 경우, Pep1Alloc 용액의 증가 된 농도의 펩티드 용액 전환을 제한 할 수있다 희석 이상의 무연 티올로 Pep1Alloc 접근성로서 사용될 수있다; 예를 들어, 우리는 / ㎖ Pep1Alloc 20 mg의 최대 농도는 무료 티올의> 90 % 변환을 생산하는 것으로 나타났습니다.
유일 펩티드의 패턴은 하이드로 겔에 첨가 할 수있다빠르게 엘만 (Ellman) 시약 (5 분 아래 그림 3A)으로 이미지화 될 수있다. 그러나, 패턴의 시각화 시간 (이상 5 분) 겔을 통해 노란색 TNB 2가 음이온의 확산으로 인해 이상 손실됩니다. 영상 해상도 개선 입체적 (X 축, Y 축, Z 평면)과 세포의 존재의 패턴을 관찰, 형광 펩티드 첨가 (AF488Pep1Alloc)가 이용 될 수있다. 그림 (b)의 x 축에서 y 축과 공 초점 현미경으로 촬영 한 이미지 스택의 Z-돌기 패턴 해상도 (μm의 규모)를 보여주는 표시됩니다.
약 (94 ± 2) %와 분해 젤 (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) 내에서 캡슐화 된 중배엽 줄기 세포의 (94 ± 1) %는 빨간색 핵 (몇 죽은 세포로 각각 1, 육일 캡슐화 한 후 실행 가능한 (녹색 세포 기관을) 유지 ) 관찰 (도 4A). 또한, hMSC 포스트 캡슐화 육일 (에서 관찰된다 확산
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그림 1 :. 하이드로 겔 내에서 세포를 캡슐화 이후 생화학 큐와 함께 포토 패터닝을위한 설정 (A) 거대 단량체 및 광개시제의 재고 솔루션이 준비되어 혼합 (PEG4SH = 백본, Pep2Alloc = 가교, Pep1Alloc = 펜던트 접착 부분 (RGDS), LAP = 광개시제 ). (B) 세포 캡슐화를 위해 수집됩니다. (C) 세포 (각각 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP 또는 PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP)없이 또는 인테그린 결합 펩티드와 로머 솔루션을 혼합하고, 빛에 노출시 캡슐화됩니다. 겔 형성시에 과잉의 티올기를 함유하는 (D) 겔 (여기서, 2 mM의 과량의 티올 형성 PEG4SH / Pep2Alloc / LAP가) 즉 단일 ALLOC 기 (Pep1Alloc로 기능화 펩티드의 후속 첨가하여 생화학 큐 패터닝 될 수 있고, RGDS, IKVAV 등)에 세포 부착을 촉진하기겔의 특정 지역 내에서. 여기, 형광 표지 RGDS와 젤의 패턴이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 엘만 (Ellman) 정량 분석법 설정 및 결과 패턴 하이드로 겔의 변형을 평가 (A) 겔 및 시스테인 표준은 엘만 (Ellman) 시약과 함께 48 웰 플레이트에서 배양 하였다. 선형 표준 곡선이 겔 샘플에서 시스테인 농도를 결정하기 위해 도시된다. II = 5 분 중합; III = 30 분 배양 Pep1Alloc와 (B) 초과 무료 티올은 펜던트 ALLOC 펩타이드 (I = 1 분 중합와 패턴에 따라 겔 형성하는 동안 하이드로 겔 내에서 통합되어 소비 IV = 90 분 배양 위스콘신 제 Pep1Alloc; III 및 IV 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. 엘만 (Ellman) 분석 및 형광 이미지 photopatterned 하이드로 겔을 시각화 (A) 엘만 (Ellman) 시약을 신속 X-의 패턴 (라인) 및 Y 평면 (황색 = 비 패턴 영역 눈금 막대 = 1mm)을 탐지하는데 이용 될 수있다. (B) 형광 펩티드 Y 축, X 축에 패턴을 관찰하기 위해 사용될 수있다, Z 평면 (녹색 패턴 영역 = 200 ㎛의 스케일 바, 10X 물 침지 목적, 예 / 엠 525분의 488 ㎚).large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 4 : 생존 및 비 분해성 photopatterned 하이드로 겔 내에서 세포의 신진 대사 활동 (A) 예 촛점 Z - 스택 (Z 프로젝션, 10 배 물 침지 목적) 실행 가능한 (녹색, 예 / 엠 525분의 488 ㎚) 및 죽은 중배엽 줄기 세포 (빨강, 예 / 엠 580분의 543 nm의)는 하이드로 겔 내에서 캡슐화 24 시간 후 캡슐화 (스케일 바 = 200 μm의). 육일 캡슐화 (삽입 이미지, 스케일 바 = 50 μm의) 후 이러한 하이드로 겔 내에서 확산 세포. (; II = 5 분 중합 I = 1 분 중합) 및 패터닝 조건 (III = Pep1Alloc 30 분 배양 (B) 세포는 1 3 일 (각각 어둠과 빛 바,) 다양한 중합 후 캡슐화는 대사 활성 ; IV = 90 분 incubatioN Pep1Alloc와; 모두) 중합 1 분 동안 빛 패턴. 표시 데이터 (3 N =) 표준 오차를 나타내는 오차 막대로 평균을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 예 설정이 하이드로 겔을 만들기위한 재고 솔루션의 볼륨을 계산하는 파란색 강조 스프레드 시트 내에서 셀 사용자 정의 매개 변수를 표시하는 단계;. 다른 수량은 이러한 설정을 기반으로 계산됩니다. 겔을 만들기 위해 각각의 원액에 대한 최종 볼륨이 주황색으로 강조 표시됩니다. 백혈구는 사용자 정의 파라미터들에 기초하여 최종 부피를 계산하는 데 사용되는 화학식을 포함한다. 2.2 MM의 LAP의 농도가 0.067 중량 %에 해당합니다.
Discussion
여기에 제시된 절차는 티올 - 엔의 클릭 화학에 의해 형성된 하이드로 겔 내에서 세포를 photoencapsulate하는 기술에 대해 설명하고 이후 생화학 적 단서와 젤을 photopattern. 처음 하이드로 겔을 형성하는 광을 이용하여 중합 전에 중합체 용액 내에서 균일하게 혼합하고, 세포 현탁액을 허용한다. 신속한 중합 "잠금"정의 된 몰드의 형상의 겔 및 하이드로 겔 네트워크 내에서 세포를 현탁 캡슐화한다. 젤은 원하는 최종 용도에 따라 여러 가지 형상 (예를 들면, 유리 슬라이드 나 주사기 팁)으로 성형 될 수있다. 광 감쇠가 얇은 시료 내에 한정되어 예를 들어, 유리 슬라이드에 부착 된 하이드로 겔의 3 차원 배양에 캡슐화 된 세포 이미징 애플리케이션에 특히 유용하다. 주사기 금형 단시간에 제조 할 수 많은 샘플을 허용 세포의 빠른 밀봉 사용될 수있다 (유리 슬라이드에 비해이러한 세포 계측법 또는 qPCR에 따라 유동 세포의 다수의 요구 실험에 사용할 수있는 (S)). 그 후,이 젤은 그러한 분화 또는 침공으로 원하는 세포 반응을 유도하는 생화학 적 단서로 패턴 화 될 수있다. (30, 31)
생존 및 대사 활성에 대한 분석은 주어진 자료 시스템 셀 패터닝 상태의 생존을 나타낸다. 신진 대사 활동이 세포 기능에 중합 및 패터닝 조건의 초기 효과를 평가하기 위해 비 분해성 젤에서 3 일까지 (RGKGRK 펩티드 가교)를 모니터링 하였다합니다. 또한, 분해 펩타이드 가교 (GPQGIWGQ) 배합 젤의 후 캡슐은 세포 생존과 문화에 1 주 확산 남아 지원 1, 6 일째 중배엽 줄기 세포의 막 무결성 분석 (라이브 / 죽은 생존 / 세포 독성 염색). 추가 세포주의 생존은 32 것과 유사한 포토 패터닝 조건보고되었다여기에 사용되는 실시간 / 죽은 염색 및 대사 활성 분석을 사용하여 설명 된 하이드로 겔 시스템을 평가할 수있다. 우리는이 재료 시스템과 관련된 프로 시저 (4.2 및 4.3)을 사용하여 세포 생존 문제가 관찰되지 않은 반면, 일부 세포 유형은 유리 라디칼 및 / 또는 광 노출에 민감 할 수있다. 이 경우, 사용자는 아 지드 - 알킨 12 FXIII 31 또는 딜스 - 알더 계 하이드로 겔 형성 화학 비 광 개시 물질 시스템을 쓸 수있다. (33)
손쉬운 기술은 감지하고도 (3.1 및 3.2)을 제시 겔 내에서 생화학 적 단서의 패턴을 정량화한다. 시약은 상업적으로 입수 가능하고 별도의 합성 공정 단계 또는 더 비싼 시약 (예를 들어, 형광 표지 된 펩티드)가 필요 없기 때문에 엘만 (Ellman) 분석법이 특히 중요하다. 엘만 (Ellman) 분석을 정확하게 differe 아래 생화학 단서 자유 티올의 변경을 결정하기 위해 사용될 수있다NT 조건을 포토 패터닝뿐만 아니라 신속하게 패턴을 시각화. 펩티드 결합의 양적 측정으로서, 펩티드 결합 전과 후의 패터닝 티올 관능기 농도를 정량화 직접 엘만 (Ellman) 분석법으로 평가된다. 정량이 유형의 형광 표지 된 펩티드를 사용하여 수행 할 수 있지만, 34 촬상 계 정량 이상의 시간이 걸리는 처리 및 분석 단계가 필요 (예를 들어, 검량선의 형광 표지 된 펩티드 및 생성의 합성 펩티드 농도 형광 관계를 맺기 위해서는 ) 이미지 분석을 사용. 촬상 펩티드 혼입, 엘만 (Ellman) 시약에 직접 샘플에 도포하고 즉시 구상 할 수있다. X 축 및 패턴 시각화, Y 평면에 한정되는 반면,이 기술은 유리 티올기를 함유하는 기질이 패터닝되어있는 경우를 결정하기 위해 간단한 통상적 인 방법으로 사용될 수있다. 은 엘만 (Ellman) 분석법 C 아니라는 것을 유의해야onsidered cytocompatible는 photopatterns 관찰하고 정량화하는데 이용 될 수 있도록하면서, 그것은 세포의 존재하에 수행 할 수 없다. 입체적으로 세포의 존재 패턴을 이미징, 하이드로 겔 매트릭스 내의 형광 펩티드의 결합은 강력하고 널리 사용되는 방법 남아있다. 패턴의 해상도는 Y 축, X 축에서 평가 될 수 있고, Z 평면 공 촛점 현미경을 사용하고, 패터닝 된 영역 또는 비 패턴 영역 내의 셀들이 식별 될 수 있도록이 방법 cytocompatible이다. 함께 찍은, 엘만 (Ellman) 분석 및 이미징 기반 기술은 연구자들이 모두 양적 및 질적 자료 시스템 내에서 생화학 적 단서의 포토 패터닝을 평가하기위한 보완적인 도구입니다.
Photoclick 또는 더 넓게 광 개시는 세포의 존재 하에서 하이드로 겔의 형성을위한 화학 및 수정이 많다. 여기에 제시된 성형, 캡슐화, 패터닝 기술은 액세스 제한되지 않습니다전술 한 재료 시스템으로 제한없는 및 그러한 티올 알킨 35 지드 - 알킨, 4 및 기타 티올 - 엔 화학 (예, 티올 넨) 10,13뿐만 아니라와 같은 다른 광 - 기반의 화학 물질에 적용 할 수있다 예컨대, 이르가 큐어 2959, 에오신 Y, 및 캄 포르 퀴논 등의 다른 광개시제. 사용자가 프로 시저 매개 변수를 조정해야 할 수도 있습니다 (예를 들어, 배양 시간, 중합 시간, 세포 밀도는) 조건이 다른 시스템에 대한 cytocompatible 남아 있는지 확인합니다. 패터닝 처리는 하이드로 겔 (2.2.3-2.2.5)로 ALLOC 변성 펩티드 (들)의 확산을 필요로하기 때문에,이 프로세스는 인테그린 - 결합 부분 (예를 들면, 펩타이드 또는 세포 외 기질 단백질의 첨가에 가장 유용 할 수있다 네트워크에 대한 리간드의 부착은 셀 전체 인테그린 활성화에 의해 견인력의 생성에 필요한 하이드로 겔에 단편). 36 주, 생체에 대한 그 수도솔루션 또는 고정 (예를 들면, 성장 인자 또는 사이토 카인)에 유사 활성화, 하이드로 겔에 부분 확산 (~ 1 시간)의 배양 단계는 패터닝 결과를 나선상 이벤트를 신호로 이어질 수 있습니다. 다른 방법은 패터닝 성장 인자 고정화 또는 로컬 격리 확립되었다. 37-39는 또한 패턴 해상도는 노광에 대한 제어에 의해 결정된다. 여기서, 포토 마스크 겔 깊이 통과하여 X 및 Y 평면에 패턴 작성을 허용; 그러나, 겔 내의 생화학 큐 패터닝을보다 공간 제어는 X 방향의 패턴, Y- 및 Z- 평면을 생성하기위한 두 개의 광자 공 초점 현미경의 사용과 같은 방사의 다른 방법으로 달성 될 수있다. 34,40 마지막으로,이 과정에서 사용되는 재료 시스템이 초기에만 생화학 단서로 변형되는 동안, 직교 photoclick 화학은 알테를 허용하도록 사용될 수 있음에 유의해야여기에 제시된 시간에 매트릭스 속성에서 식량. (12) 절차와 기술은 잘 정의 및 시공간으로 제어 특성을 가진 합성 매트릭스를 생성하기위한 현재의 접근 방식에 다양성을 추가 할 수 있습니다. 특히,이 과정에서 사용되는 시약 및 물질의 상업적 유용성은 제어 된 세포 배양에서의 애플리케이션을 위해 하이드로 겔 기반 바이오 물질의 이용에 관심이 연구자의 넓은 범위에서 유용 할 것이다.
Acknowledgments
이 작품은 약 발견과 (각각 P20GM104316 및 P30의 GM110758-01) 국민 건강의 국립 연구소에서 장군 의학 연구소에서 제도 개발 수상에 의해 자금 고급 생체 적합 물질, 퓨 자선 트러스트에서 델라웨어 코 브레 프로그램에 의해 지원되었다 (00026178), 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 상 (DMR-1253906)에 버로우즈 웰컴 기금 (1,006,787), 델라웨어 대학의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) IGERT SBE2 프로그램 (L. Sawicki 씨에 교제). 저자는 공 초점 현미경에 대한 교육과 액세스를 위해 델라웨어 대학의 델라웨어 생명 공학 연구소 BioImaging 센터 감사, 미스 캐서린 윌 에이 비디오 촬영하는 동안 도움 씨 마태 복음 Rehmann 관대 골수, 교수 크리스토퍼 J에서 분리 된 중배엽 줄기 세포를 제공하는 자동 플레이트 리더를 사용합니다. Kloxin 씨 스티븐 마 관대하게 제공하는 포토 마스크, 그리고 교수 윌프레드 첸.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Peptides | Various Vendors | ---- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
| 4-arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
| 2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
| Flask, Round Bottom, 100 ml | Chemglass | CG-1506-05 | |
| 80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
| Magnetic Stir Bars | Various Vendors | ---- | |
| Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | ---- | |
| Vacuum Dessicator | Various Vendors | ---- | |
| Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
| Microcentrifuge tubes | Various Vendors | ---- | 1.5 or 2 ml sizes, sterile. |
| BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
| Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
| Photomasks | Advance Reproductions Corporation | ---- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
| DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
| Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
| Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
| CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Various Vendors | ---- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
| Multiwell Plate Reader | Various Vendors | ---- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
| Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | ---- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
| Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | ---- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
| Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | ---- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
| ImageJ | NIH | ---- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |
References
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