Abstract
クリック化学は、薬物送達、組織工学、細胞培養物を含む多くの生体材料用途において使用するために研究されてきました。特に、このような光開始チオール - エンおよびチオールYNE反応のような光媒介クリック反応は、材料特性以上の時空間的な制御を与えると、ユーザ指向特性制御度の高いシステムの設計を可能にします。光とこれらのチオール-Xのphotoclick化学反応によって提供される汎用性によってもたらされる精度を使用してハイドロゲルベースの生体材料の作製と修正は、特に明確に定義された、生体模倣微小環境内の細胞の培養のために、成長して注目されています。ここでは、細胞およびチオール - エンphotoclick反応により重合汎用性とモジュラービルディングブロックを使用して、ヒドロゲルマトリックス内の生化学的手がかりのその後の光パターニングの光封入するための方法を説明します。具体的には、アプローチは共同のために提示されていますアリルオキシカルボニルからnstructingヒドロゲル（のAlloc）-functionalizedペプチド架橋及びペンダントペプチド部分と迅速リチウムacylphosphinate光開始剤と長波長紫外線（UV）光の細胞適合性用量の存在下で重合チオール官能化ポリ（エチレングリコール）（PEG）。光パターンを視覚化し、追加のペプチドの濃度を定量するための簡便な技術が記載されています。さらに、方法は、細胞、特にヒト間葉系幹細胞をカプセル化するために確立され、そしてそれらの生存能力および活性を決定しています。チオールALLOCヒドロゲルの形成および初期のパターニングは、ここで示されているが、これらの技術は広く、パターン化基板を生成する他の光とラジカル開始材料系（ 例えば 、チオール-ノルボルネン、チオール-アクリレート）の数に適用されてもよいです。
Introduction
化学的性質がますます薬物送達、組織工学、および制御された細胞培養、それらの選択のために、効率的で、多くの場合、細胞適合性反応性を含む多くの生物医学的用途のための材料の設計に使用されている。光を利用1-3 Photoclick化学をトリガするためにクリックしますか、反応（ 例えば 、アジド、アルキン、4チオール-エン、5及びテトラゾール-アルケン6）生体材料の形成または改変するために特に重要である開始します。温和な条件といつ、どこで、彼らは光で場所を取るの制御下に急速な速度の細胞の存在下での生体材料特性のユーザー主導の制御のためのこれらの反応はよく適合させる。具体的には7,8-、チオール-エンphotoclick化学物質が使用されてきましたない堅牢な機械的性質5,9とを含むが、細胞型の多様なカプセル化のためのヒドロゲル系生体材料を生成しますまた、これらの化学物質は、の重要な局面を模倣するために、生化学的手がかりの空間的なパターニングのために使用されているT細胞培養および送達のための約束で、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）、線維芽細胞、軟骨細胞、および膵臓細胞に制限。10,11天然の細胞の微小環境との密着性、分化、および浸潤などの適切な細胞-マトリックス相互作用を促進。3,12
光とのチオール-エンヒドロゲルの構築のために、システイン（チオール）を含むペプチドは、一般的に細胞適合性の条件下で迅速な、光開始重合のためのアクリレート又はノルボルネン（ 'エン'）で官能化ポリマーと反応させる。13このツールボックスを展開する、我々が確立することを求めて最小限の合成処理を必要または合成細胞外マトリックスとしての幅広い使用に向けて市販されていた新しい多機能でアクセス可能なビルディング・ブロックとヒドロゲル形成のための方法。[非分解性または細胞分解性架橋のためKを（細胞接着[K（アロケーション）GWGRGDS = Pep1Alloc]または2を促進するためのペンダントのための1、インテグリン結合グループ：14具体的には、ペプチドは、（のAlloc）アリルオキシカルボニルで変更されたがリジンを-保護しましたALLOC）RGKGRKGK（アロケーション）GまたはKK（ALLOC）GGPQGIWGQGK（アロケーション）K = Pep2Alloc、それぞれ]。これらの配列を用いて、条件が長波長UV光（365 nmでの10ミリワット/ cm 2）での細胞適合性の用量を使用して、4つのアームチオール変性ポリ（エチレングリコール）（PEG4SH）と急速反応（1~5分）のために確立されたと光開始剤、リチウムフェニル-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate（LAP）。得られたヒドロゲルは、週間の細胞培養条件下で安定でした。電池駆動型の分解と再構築を有効にするには、酵素的に切断可能なペプチドは、ゲルの架橋（ すなわち 、GPQGIWGQ）、15モデルの一次細胞、ヒト間葉系幹細胞（hMSC）内に組み込まれた、ドゥリンカプセル化と後に非常に実行可能なままでしたこれらのマトリックス内グラム文化。さらに、ペプチドは、空間的に、これらの材料の中にパターン化されており、およびhMSCのは、光パターニングの条件の下で生存可能で代謝的に活性なままです。 （ 例えば 、IKVAV、YIGSR、GFOGER）ここには示されていない代替のペンダントペプチド配列もまた、周囲の微小環境との追加の細胞相互作用を調べるためにマトリックス内に組み込まれてもよいです。これらの結果は、種々の細胞型のために研究するための三次元（3D）細胞培養および送達のためのこれらのヒドロゲル系材料の適用及び直接細胞 - マトリックス相互作用のために有望です。
ここで、方法は、細胞をphotoencapsulateし、提案されたヒドロゲル系内その後photopattern生化学的手がかり（ 図1）に提示されています。これらphotopatternsを観察し、定量化するための技術も実証されています。特に、i）は modificaを決定するために、エルマンアッセイの定量的および定性的使用パターニングされた基板と、蛍光性ペプチド（AF488Pep1Alloc）のii）の相補的な定性的な使用中の遊離チオールの化は、3次元でこれらのパターンを観察しました。さらに、アッセイは、生存率（生/死生存率/細胞毒性染色）および代謝活性を決定するために（MTS; 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル） -2H-テトラゾリウム）ユーザはヒドロゲルマトリックス内の異なる細胞株について光封入及び光パターニング条件の細胞適合性を決定することができるように提示されています。プロトコルが容易な光ベースphotoclickヒドロゲルシステムについて示されているが、この技術は、細胞の存在下で光封入し、光パターンのための多数の他のラジカル開始ヒドロゲルシステムに適用することができます。
Protocol
ヒドロゲル形成用材料の調製
- ペンダント（Pep1Alloc、AF488Pep1Alloc）を合成し、標準的な固相ペプチド合成（SPPS）技術および末端基の修飾（PEG4SH）のための3つの工程手順によってチオール官能化ポリマーによるペプチド（Pep2Alloc）を架橋する。14,16あるいは、PEG4SH（M購入商業的にn個 〜20 kDaの）、Pep1Alloc、およびPep2Alloc。
- ドラフト内で（1.2.1-1.2.11）の合成手順を実行します。14,17以下の2段階反応により光重合開始剤（LAP）を合成し、化学物質を取り扱う際は注意してください（保護手袋、衣服、眼鏡を着用） 。 LAPはまた、商業的に購入することができます。
- オーブンで乾燥した全てのガラス製品（> 2時間、80℃）。
- 空の単口丸底フラスコ（100ミリリットル）に攪拌棒を追加し、セプタムでカバーしています。
- リングスタンドとクランプと磁気撹拌ホットプレートの上にフラスコを固定します。
- 私隔壁を通して針（18 G）をnsertし、大気に開放外端を残します。不活性ガスラインに取り付けられた第2の針を挿入します。不活性ガスライン（ 例えば 、アルゴンまたは窒素）を開き、10〜15分間、フラスコをパージします。
注：システムは、連続的に反応を通じて、不活性ガス、アルゴンや窒素でパージされます。 - 隔膜を貫通する針と注射器を使用して、フラスコに1.5グラム（〜1.4ミリリットル）のジメチルphenylphosphonite（注意）転送します。攪拌プレート（中速）をオンにして、内容がフラスコの側面上に飛散しないように注意してください。
- 1.6g加える（〜1.46 ml）の2,4,6-トリメチルベンゾイルクロリド（注意）隔壁を貫通する針と注射器を用いて、ジメチルphenylphosphoniteを含有するフラスコに滴下。
- 光から保護し、アルゴンまたは窒素下で18時間撹拌するホイルで反応容器をカバーしています。
- 次の日は、、、フラスコの高さを上げるスターラー上油浴を配置します慎重に油浴中にフラスコを下げるND。磁気攪拌を維持しながら、50℃にお風呂、フラスコを加熱します。
- 2-ブタノン50ml中に3.05グラムの臭化リチウムを溶解します。オイルバスからフラスコを持ち上げ、簡単にフラスコに注ぐためのセプタムを取り外し、丸底フラスコに臭化リチウム溶液を添加。
- 、：（セプタムはまだアルゴンラインおよび通気するための針につながる針を持つことになります。注意）バック加熱した油浴にフラスコを下げ、そして反応を10分間進行させる隔膜で再びフラスコを密封します。固体沈殿物を形成します。
- 10分後、アルゴンオフに熱からフラスコを取り外し、混合物は、感光性開始剤が製造されているように、光から保護するために箔で覆われた4時間（休息することを可能にする。通気針場所に保管してください。
- 適切なフィルターペーパーを敷いたガラスフリット漏斗または漏斗に製品を注ぎます。 rに2-ブタノン50mLですすぎ、ろ液3回未反応の臭化リチウムをemove。
- ドライ（最初のベンチトップにした後、真空デシケーター中）およびD 2 O中での1 H NMRにより、製品を分析1.8〜1.9（6H、s）は、2.1~2.2（3H、s）は、6.7から6.8（2H、s）は、7.3〜7.4（2H、m）は、7.4から7.5（1H、m）は、7.5で特徴的なピーク-7.7（2H、M）14,17
- ヒドロゲル（ 表1）を作るために準備する必要があり、各原液（PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc、LAP）の体積および濃度を計算するためにスプレッドシートを使用してください。すべての反応基は、重合の間に消費されるように、非パターンゲルを作成するには、その[SH] = [のAlloc]を確認してください。ゲルのフォトパターニングが計画されている場合は、Pep1Allocと後で反応のための化学量論に基づいて、ゲル形成中のチオール官能基を過剰量（ 例えば 、0.2〜5 mMの、[SH]> [のAlloc]）が挙げられます。
NOTE：ゲル（5分以内）急速な重合を確実にするために5重量％（wt％）PEG4SH超えるを含むべきです。しかし、より低い重量％の範囲アプリケーションはより低い弾性率（ 例えば 、<0.5 kPaの）とのヒドロゲルのために呼び出す場合sが探求することができます。重合がチェックされ、これらの低質量％の組成物のために応じて調整する必要があります。同様に、Pep1Alloc濃度は、チオール官能化ペプチドについての文献に報告されているように、異なるアプリケーション（ 例えば 、0.2〜5 mM）のために調整されてもよい。18-21 LAPの濃度が0.067重量％（2.2ミリモル）以下、説明したように、のように周りに推奨されますより高い濃度は、細胞生存率を減少させることができます。 - 表1の計算に基づいて、細胞培養用の無菌条件下でPep1Alloc、Pep2Alloc、PEG4SH、およびLAPのストック溶液を準備します。
- Pep1AllocとPep2Allocために、個別のペプチド合成からPep1AllocとPep2Allocの全質量を秤量し、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（PS）および0.5 / mlのファンギゾン（FZ）を含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解します。準備原液の範囲の典型的な濃度ペプチドの20-100 mg / mlです。使用するまで-20℃で軟組織のアプリケーションに関連する最終的な弾性率（ヤング率〜0.5から5キロパスカル）を有するゲル。22,23小分けとストアを達成するために、これらの株式を混ぜます。
- PEG4SHのために、滅菌マイクロチューブにPEG4SHを計量し、PBS + PS + FZに溶解します。 250から430 mg / mlでから、この原液の範囲の典型的な濃度（重量20〜30％のPEG4SH）。
- LAPのために、滅菌マイクロチューブにLAPを計量し、7.5mg / mlの濃度にPBS + PS + FZに溶解します。
注：PEG4SHとLAPの新鮮なソリューションを準備するには、一貫性の重合時間を確保するためにあらゆるカプセル化またはゲル実験のために推奨されます。
- ヒドロゲルを形成するための滅菌シリンジヒント金型を準備します。
- 慎重にカミソリの刃を使用して、1ミリリットル注射器のオフ先端をカットし、その後注射器シャフトからプランジャを取り外します。
- 15分のANを70％エタノールで注射器シャフトやプランジャを沈めます無菌の細胞培養フード中のd場所（30分間）乾燥させます。過剰のエタノール滴がシリンジシャフトの内部に残っている場合は、それらを押し出すためにプランジャーを使用しています。
- ヒドロゲルを形成するための滅菌ガラススライド金型を準備します。
- ガラススライドに（2の倍数）とゴムガスケットソーク（0.254ミリメートルの厚さを、シムとして使用する2小片を、ディスクの長方形を打ち抜き、または四角枠状）70％エタノール中で15分間、および無菌細胞培養フード内の場所乾燥する。
- スライド表面にゲルの上部の付着を防止するために、製造業者の指示につき付着防止コーティングを有する滅菌スライドの被覆半分（4スライドがある場合、例えば 、2スライドを、抗接着剤でコーティングされます）。これらのガラススライド金型の上面となります。
- 注射器またはガラススライド金型用のランプを調整します。
注：これらの実験のために、外部フィルタアダプタアセンブリ及び365nmの外部フィルタを有する水銀アークランプを使用しました。その他のランプ他者によって報告され、長波長UV光の適切な強度を生成するのに使用されてもよい。24-27- すべてのサンプルにわたって比較的均一な光強度を確保するために、液体で満たされたライトガイドの先端にコリメータレンズを取り付けます。必要に応じて、目的のサンプルをカバーするスポットサイズを達成するために、サンプル（複数可）からの光ガイドの距離を調整します。
- （垂直位置にシリンジ金型を保持するために）マイクロチューブホルダーにカットシリンジ金型を置きます。サンプルが開催されるシリンジ先端の高さで放射計を持って、365 nmで10 mWの/ cm 2の光強度を達成するために、シャッター（％オープン）を調整します。後で使用するために調整した設定を記録します。
- 無菌の表面の上部にガラススライド金型を置きます（ 例えば 、バイオセーフティキャビネット内のピペットチップボックスの上部）。ガラススライド金型の高さで放射計検出器を持ち、10メートルの光強度を達成するために、シャッター（％オープン）を調整365nmのW / cm 2です。後で使用するために調整した設定を記録します。
2.ハイドロゲル形成と光パターン
- 非パターン化ハイドロゲルの調製。
注：ヒドロゲルは、細胞培養の用途で使用される場合、プロトコルのこの時点で、後続のすべてのステップは、無菌のキャビネットまたはフードに無菌条件下で行うべきです。- （ 表1の例を参照）、スプレッドシートの計算によるとPEG4SH、Pep2Alloc、Pep1Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZのストック溶液を混ぜます。溶液を混合さえも確実にするために積極的に得られたゲル前駆体溶液をピペット。
- 滅菌、切断された注射器の先端にゲル前駆体溶液（PEG /ペップ/ LAP / PBS）の10-20μLをピペットで注射器の先端に成形厚いヒドロゲルを準備します。注射器ごとに単一のゲルを作成し、ボリュームと注射器の直径に基づいて、厚さ約0.5〜1.5ミリメートル。
注：より大きなボリュームは探求に基づくことができます上限は、細胞培養中に/からカプセル化された細胞に光パターンおよび/または栄養素/廃棄物中にPep1Allocための拡散限界に基づいて存在する可能性が希望のゲルサイズ。 - 非コーティングされたガラススライドのエッジの周りにゴムパッキン（0.254-mm厚）を配置することによって、ガラススライド金型で薄いヒドロゲルを準備します。ピペット5-10μLゲル前駆体溶液は、非被覆ガラススライド上に（単一または複数5~10μlのゲルは、単一のスライド上に溶液の一つ以上のドットをピペッティングすることによって作製することができる）、および抗接着剤でコーティングされたスライドガラスを置きゲル溶液の上に（より大きいゲルは、ガラススライドのサイズまで、最終的な用途に応じて行うことができます）。安定化させるための小さなバインダークリップでガラススライドを固定します。
- 場所金型ランプの下で、ステップ1.7.2での測定値に基づいて、シリンジ先端金型やガラススライド金型用ゲル表面では10mW / cm 2とを達成するために、ランプ強度（ 例えば 、％シャッターオープン）を設定し、それぞれ1.7.3、。
- ゲルの完全な重合を可能にするために、1〜5分間の光を適用します。内弾性率と完全に重合したヒドロゲルを製造するために、下部PEG4SH含量（5~8重量％、3~5分）でのゲルのためのより高いPEG4SHコンテンツ（8重量％以上、1分）より長いとゲルについて、より短い重合時間を使用軟組織の範囲（0.5〜5キロパスカル）。
- 場所は、滅菌非処理48ウェルプレートにシリンジ先端金型からゲル、および無菌皿にガラススライドを配置します。
- 以下に詳述するように計画された実験に基づいて、細胞培養培地または適切な緩衝液（ 例えば 、PBS + PS + FZ、エルマン反応緩衝液）で3×15分を洗い流します。
- パターン化ハイドロゲルの調製。
- Pep1Allocとの後の反応のための遊離チオール（0.2〜5 mm）を残して、スプレッドシートの計算によるとPEG4SH、Pep2Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZのストック溶液を混ぜます。溶液を混合しても確実にするために積極的に前駆体溶液をピペットで。
- ステップ2.1.6に2.1.2でレイアウトとして厚く、薄いヒドロゲルを準備します。
注：前の光パターンに増殖培地中でゲルを置かないでください。遊離チオールは、増殖培地中で種によって消費することができる（ 例えば 、ジスルフィドチオール含有タンパク質との形成）および追加の処理ステップのないゲルのパターニングを許可しません（ 例えば 、ジスルフィド結合の還元）。 - Pep1Allocの溶液を調製する（最終濃度〜3-20 mg / mlで）および2.2ミリモルのLAP。
- Pep1Alloc / LAP溶液で予め形成されたゲルを覆い、37℃で1時間インキュベートします。
- 過剰Pep1Alloc / LAPのソリューションを削除します。ゲルは、シリンジ先端に成形した場合には、慎重に、彼らはパターニングのための滅菌ガラススライドにインキュベートされた48ウェルプレートからゲルを転送するためにスパチュラを使用しています。
- syringe-ガラススライド成形ゲルの上に直接所望のパターンを有するフォトマスクを配置します。マスクの印刷部分が最適PATTためのゲルに触れていることを確認してくださいERN忠実度（ すなわち 、マスクが右読み、ダウン乳剤側でなければなりません）。場所サンプルランプ下でスライドガラス（ステップ1.7.3）のために使用されるランプ設定で1分間照射します。
- パターニング、滅菌48ウェル非組織培養処理プレートに代えシリンジ成形ゲルを、滅菌皿にガラススライドに付着されている場所スライドガラス成形ゲルました。
- 計画された実験に基づいて、細胞培養培地または適切な緩衝液（ 例えば 、PBS + PS + FZ、エルマン反応緩衝液）で3×15分を洗い流します。
3.可視化と光パターニングの定量
- 光パターンヒドロゲル中に遊離チオールを検出および定量化するために、エルマンアッセイ。
- 以下に説明するように、エルマン反応緩衝液、システイン作業溶液、標準、およびエルマン試薬を準備します。
- エルマン反応緩衝液については2.4グラムのリン酸ナトリウム二塩基性（のNa 2 HPOを溶解4）200mLのDIH 2 O（0.1 MのNa 2 HPO 4、1mMのEDTA）中に74.4 mgのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）。水酸化ナトリウム（NaOH）またはリン酸（H 3 PO 4）の溶液で7.5〜8のpHを調整します。
- システイン作業溶液について、15ミリリットルの反応緩衝液（2mMのシステイン）に5.27 mgのシステインを溶解します。
- システイン規格については、2、1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25、および0 mMのシステインの最終濃度になるように反応緩衝液中のシステイン作業溶液を希釈します。
- エルマン試薬については、4 mgを1ミリリットルの反応緩衝液中のエルマン試薬を溶解させます。超音波処理は、完全にエルマン試薬を溶解します。
- エルマンアッセイ（ 図2）を有するゲル中の遊離チオールの濃度を定量化します。
注：「シン」5μlのヒドロゲル、ガラススライドの間成形は、以下の手順で説明し、エルマン試薬tの迅速な拡散を可能にするために推奨されていますゲルhrough（ すなわち 、それは試薬に厚いゲルを通って拡散するのにより長い時間がかかります）。- Q.、体積膨潤率に基づいて、「薄い」5μlのゲル（VのS）の膨潤ゲルの体積を決定します
- シリンジ金型を使用して、3つの20μlの「厚い」ゲルを作ります。エルマン反応緩衝液に入れゲル24時間、その後は（平衡腫れ質量、M S）を量ります。ゲルを凍結乾燥し、続いて（乾燥質量、M D）を重量を量ります。
- Qによって比28膨潤体積を計算し、厚いゲルのための測定された質量を用いて、= 1 +ρ ポリマー /ρ 溶剤 （M S / M D -1）ρ ポリマー = 1.07グラム/ cm 3のPEGのため、29ρ 溶剤 = 1.0グラム/ cm 3のPBS / H 2 Oのために
- （ここで、5μlの「薄い」ゲルは、典型的にはUであるエルマンアッセイに使用されるゲルの理論上の乾燥質量を計算しますSED）、個々のコンポーネントPEG4SH、Pep1Alloc、およびPep2Alloc（M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc）の質量を合計することによって。 M PEG4SHによって計算されるように、例えば、10重量％のPEG4SHを含む5μlのゲルは、約0.000535グラムのPEGが含まれています= 0.005センチ3×1.07グラム/ cmの3×0.10。 Pep1AllocとPep2Alloc質量はこれらの水溶液のためのρ≈は1.0g / cm 3とを想定して 、溶液中の重量％に基づいて、同様に（値のスプレッドシートを参照）を算出することができます。
注：ゲルはまた、代わりに理論的な乾燥質量を計算する乾燥し、秤量することができます。しかし、一貫して、薄い、5μlのゲルの乾燥質量を測定するために挑戦することができます。 - 予測乾燥質量と「厚い」ゲルから決定さQ値に基づいて、「薄い」ゲル（ステップ3.1.2.1.1での式）について予測腫れ質量M Sを計算します 。そのρ≈1.0グラム/ cmの前提としてい
注：上記の方法は、「薄い」5μlのゲルは計量のために転送することが困難であるように腫れてゲルについてV sを決めるため、お勧めします。
- セクション2.2（5μlの体積）で説明したようにパターニングのための薄いヒドロゲルを形成します。具体的には、過剰の遊離チオールを有するゲルと光でゲル全体を露出させるフラッディングする明確なカバーガラスを使用してPep1Allocとこれらの試料の「パターン」の半分を行う（ 例えば 、過剰なチオールと6合計ゲル：3修正されていない非'patterned 'および3' '）パターン化。
注：このアッセイでは、「パターン化」ゲルは、フォトマスクなしで光に洪水にさらされています。この方法は、全体のゲル試料で消費遊離チオールの数を決定し、ペプチドを修飾することができる方法を効率的に遊離チオールを実証するために使用されます。この情報から、フォトマスクを用いてパターニングする間に消費遊離チオールの数は、ゲルの厚さとパターン領域（光に露光された領域）に基づいて予測することができます。 - 場所「パターン化」と非'patterned「ゲル48ウェルプレートのウェルにし、発生する膨潤ゲルと均衡のうち、未反応種の拡散を可能にするために、エルマン反応緩衝液で3×15分をすすぎます。
- V sの反応緩衝液では20μlと倍数であるように、すすぎゲルに余分なエルマン反応バッファーを追加します。予測V Sが 15μlである場合たとえば、5μlの反応バッファー（20μl）を追加し、予測されたV Sは、30μlのであれば、10μlの反応緩衝液（40μl）を追加します。
- 前のステップがV S +余分な反応Bを有する場合、 すなわち、（前のステップで使用される量に応じて、20μLの倍数で96ウェルプレートの（ゲルを含有しない）、個々のウェルにシステイン基準をピペット= 40μlのuffer、個々の空のウェルに各標準の40μlを添加します）。
- 反応バッファー（; 例えば 、20μlあるいはステップ3.1.2.5での40μlのための367.2μlのための183.6 180μlの反応緩衝液+ 3.6μlのエルマン試薬の倍数）でエルマン試薬を希釈します。
- 標準液およびサンプルを含むウェルに希釈されたエルマン試薬を追加します。 20μlのサンプルについて、各ウェルに183.6μlの溶液を加えます。 40μlのサンプル（またはサンプルの大きさに基づいて、それに応じてスケール）のために希釈されたエルマン試薬のダブルこの量。
- 溶液の色が黄色の2-ニトロ-5-チオベンゾエートジアニオン（TNBの十分な拡散を確保するために目視検査によってゲルの色と一致するまでインキュベートまたは場所で1時間30分間、シェーカー上で（室温）、またはゲルから、遊離チオールとのエルマン試薬の反応により生成されました2-）、。
- サンプルおよびsから溶液100μlを取りますtandardsとは、96ウェルプレートのウェルに配置します。
- プレートリーダーで405 nmの吸光度を読みます。
- データを処理するために、標準曲線（ステップ3.1.1.3からのサンプル）（濃度対吸光度）をプロットし、線形関数にフィット。線形関数を使用して、「希釈ゲル」溶液（ゲル+反応バッファー）中の遊離チオールの濃度は、吸光度の読み取り値に基づいて計算することができます。最後に、アカウントに反応バッファーで「希釈」を取って、反応緩衝ないゲル中の遊離チオール濃度を決定します。 （15μlのゲルを5μlの反応緩衝液で希釈した場合、例えば 、20/15を掛けます）。
- Q.、体積膨潤率に基づいて、「薄い」5μlのゲル（VのS）の膨潤ゲルの体積を決定します
- エルマン試薬（ 図3A）とphotopatternsの可視化。
- 1時間エルマン反応緩衝液中Pep1Allocでパターニング薄いヒドロゲルを浸します。
- 優しく組織とヒドロゲルのエッジの周り拭いて過剰反応バッファーを削除します。
- 直接ゲルの表面にピペットエルマン試薬。すぐにカラーカメラの光10倍で顕微鏡や実体顕微鏡の画像。
注：可視化パターンがゲル全体に拡散し、非パターン領域におけるチオールとの反応時にエルマン試薬の切断によって生成黄色のTNB 2-イオンとして5分以内に消費しますので、ゲルはすぐに画像化されなければなりません。非パターン領域は肉眼でかすかに黄色に見えます。優れた分解能と小さいパターン、倍率（ 例えば 、顕微鏡の使用）のために必要とされます。
- 以下に説明するように、エルマン反応緩衝液、システイン作業溶液、標準、およびエルマン試薬を準備します。
- 蛍光ペプチド（ 図3B）とPhotopatternsの可視化。
- 高い解像度または3次元でパターンを可視化するために、ステップ2.2でゲルにAF488-修正Pep1Alloc（または類似の蛍光性ペプチド）をphotopattern。
- 蛍光顕微鏡の画像。共焦点顕微鏡は、z-STを取るためにここで使用することができますゲルのACK画像パターンはx軸、y軸、およびz平面で観察することができるようにします。
注：蛍光では、ゲルは、AF488のフルオロフォアと最大蛍光の安定性を確保するために、光から保護されなければなりません。 （4℃、ホイルで包んで容器に店）光から保護した場合に蛍光性ペプチドはかなり安定しているので、ゲルはすぐに画像化される必要はありません。
ヒドロゲルおよびフォトパターン4.細胞のカプセル化
- 収集とカプセル化のための細胞を調製します。
- 標準的な滅菌哺乳動物細胞培養の手順に従い、プレートから目的の細胞をトリプシン処理し、収集します。剥離が発生した後、増殖培地でトリプシンをクエンチ（ 例えば 、T-75フラスコ、5ミリリットルのトリプシン、5mlの培地でクエンチし、合計15ミリリットルのための5ミリリットル培地でプレートを洗浄）。
注：トリプシン処理時間は、細胞型の間で異なるが、一般的に5〜15分の間で発生する可能性があります。代替セルdetachmenT剤（ 例えば 、ベルセン）は、所望であれば、細胞を収集するために使用されてもよいです。 - バルクの細胞懸濁液（90〜110×gで、5分間）遠心分離しながら、血球計または他の細胞計数装置を用いてトリプシン処理細胞懸濁液のアリコートからの細胞（100の最小または製造業者のプロトコール）を数えます。最初のトリプシン処理細胞懸濁液があまりに希薄された場合に最小限のPBSの体積または成長培地と再数の遠心分離後、細胞ペレットを再懸濁します。
- （重合前に）ゲル溶液と混合したときに5,000細胞/μlのがありますように、マイクロ遠心チューブに各ゲル状態のためのPBSの最小容量のセルとのアリコート部分を再サスペンド。
注：標準の細胞アリコートを300,000-500,000細胞を含み、5,000細胞/μLで3~5×20μlのゲルのために使用することができるゲル/細胞懸濁液の60〜100μLを作るのに十分です。より高いまたはより低い細胞密度は、細胞の量に応じて、カプセル化のために使用することができます細胞 - マトリックス接触対それぞれ、所望の、及びアプリケーションごとに決定されるべきです。 - 遠心分離細胞/ PBSアリコート（90〜110×gで、5分）。
- 慎重に右のカプセル化の前に、マイクロ遠心チューブに細胞ペレットからPBSを吸引除去します。
注：細胞は、剪断力に対して敏感である場合は、2回目の遠心分離工程（ 例えば 、血球計）をカウントし、続いて各ゲル状態のために必要な部分にトリプシン処理細胞懸濁液（トリプシン+培地+細胞）を等分することによって除去することができます。これらのアリコート（90~110×gで、5分間）を1回遠心分離し、トリプシン+媒体は、カプセル化のために、細胞ペレットを残して、吸引されます。
- 標準的な滅菌哺乳動物細胞培養の手順に従い、プレートから目的の細胞をトリプシン処理し、収集します。剥離が発生した後、増殖培地でトリプシンをクエンチ（ 例えば 、T-75フラスコ、5ミリリットルのトリプシン、5mlの培地でクエンチし、合計15ミリリットルのための5ミリリットル培地でプレートを洗浄）。
- 非パターン化ヒドロゲルでカプセル化細胞。
- すぐにPBSを吸引した後、/μlの5,000個の細胞の最終濃度になるように、スプレッドシートで計算されるようPEG4SH、Pep2Alloc、Pep1Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZでペレット化した細胞を懸濁。
- カビやDESCRなどのハイドロゲルを重合ステップでibedは2.1.6に2.1.2。
注：スライドガラス金型内のセルをカプセル化すると、細胞死をもたらすことができるゲルを、せん断防止するために、トップスライド後重合を除去する際に、注意が必要。金型からのゲルの除去を助けるために、スライド金型は、それが簡単にトップのスライドを削除すること、ガスケットおよびヒドロゲルを濡らすために、重合後に滅菌PBSまたは増殖培地中に配置することができます。完全この剪断を防止するための方法は、注射器金型を使用することです。 - 未反応の種と過剰LAPを除去するために、ゲルを、増殖培地中で3×10分を洗い流します。
- さらなる分析のための所望の時点まで37℃で成長培地中でゲルをインキュベートし、5％CO 2。培地48時間ごと、またはアプリケーション（特定の細胞型とメディアのための例えば 、典型的な給紙間隔）のような決定を補充。
- 細胞の存在下で細胞と光パターンをカプセル化します。
- すぐにPBSを吸引した後、/μlの5,000個の細胞の最終濃度になるように、スプレッドシートで計算されるようPEG4SH、Pep2Alloc、LAP、およびPBS + PS + FZでペレット化した細胞を懸濁。 Pep1Allocとの後の反応のための遊離のチオール（ 例えば 、2 mM）の適切な濃度のままにしておきます。
- ステップ2.2.8に2.2.2で説明したように、金型は、重合、およびパターンのヒドロゲル。
- 未反応の種と過剰LAPを除去するために、パターニングした後、増殖培地中ですすぎゲルは、3×10分。
- さらなる分析のための所望の時点まで37℃で成長培地中でゲルをインキュベートし、5％CO 2。培地48時間ごとまたはアプリケーションのように決定を補充。
5.カプセル化された細胞の生存率および代謝活性の決定
- カプセル化された細胞生存率（ 図4A）を決定するためにライブ/デッド細胞毒性アッセイを実行します。
- グラムからの媒体の拡散を可能にするために、PBSで3×15分をゲルから成長培地を削除し、すすぎELS。
- 雪解け生/死細胞毒性アッセイ溶液（エチジウムホモダイマー1及びカルセインAM）。
- 1ミリリットル滅菌PBSに4 mMのカルセインAMソリューションの2mMのエチジウムホモダイマー1及び0.5μlと2μLを加えます。完全な混合を確実にするために渦。
- 48ウェルプレートの各シリンジ型ゲルを300μlの染色溶液を追加し、または滅菌シャーレ中のガラススライド上にゲルの表面をカバーするのに十分な、そして45分間インキュベートします。
- 余分な染色液を削除し、（PBSで3×15分）ゲルから余分な染料を除去するためにすすぎ。
- 10Xおよび525分の488 nmのEX /エムでの共焦点顕微鏡（zスタック画像）またはzスタック機能を備えたエピ蛍光顕微鏡上の画像。 Z-スタックを投影し、生（細胞体全体緑色）および死（赤核）画像化ソフトウェアを有する細胞の数を計数することにより生存細胞の数を定量化します。
- 細胞活性後のカプセル化（Figuを決定するために、代謝活性のアッセイを行います）図4（b）再。
- アッセイの前に24時間は、新鮮な増殖培地でカプセル化された細胞を養います。
注：コントロール（バックグラウンドの読み）として（無細胞とのゲルまたはゲルを含まない）いくつかの余分なウェルに培地を追加します。 - 興味のある時点で、MTS試薬溶液を解凍。
注：時間をかけて代謝活性を測定するために、初期の時点で（12〜24時間後、カプセル化）後の時点と比較するための基準として推奨されています。 - 各ウェル（100μlの成長培地あたり20μl）をへのMTS試薬を追加します。
- 製造者の指示に従って、37℃で1-4時間、5％CO 2のためのサンプルをインキュベートします。
注：細胞はMTSを減少させ、ゲルからホルマザン生成物の拡散を可能にするためのインキュベーション時間で十分であるべきです。したがって、このような注射器の先端ゲルなどの厚いゲルは、十分なMTS削減と拡散のために、より長いインキュベーション時間（〜4時間）を必要とするかもしれません。 - MTS /ミディアムを減少ピペットで100μlのプレートリーダー上で490nmで96ウェルプレートおよびレコード吸光度の清浄なウェルに。
- ベースライン吸光度の値を生成するために、サンプルの吸光度値から、細胞なしのウェルのバックグラウンド吸光度を差し引きます。
- アッセイの前に24時間は、新鮮な増殖培地でカプセル化された細胞を養います。
Representative Results
セットアップ手順は、図1に示されている細胞およびカプセル化された細胞を含むその後photopatternゲルphotoencapsulateし、ストック溶液を調製するための例は、10重量％のゲルは、表1に提供されて形成する。 表1を用いて、単量体の量（PEG4SHをヒドロゲルを重合するのに必要なPep2Alloc、±Pep1Alloc）および光重合開始剤（LAP）を算出します。これらの計算に基づいて、PEG4SH、Pep1Alloc、Pep2Alloc、およびLAPの原液は、それぞれ、ゲルを形成し、フォトパターニングのためPep1Allocととせず（ 図1A）を用意し、混合されています。続いて、細胞をプレートから採取し、計数し、カプセル化（ 図1B）のために適切な量で遠心分離します。細胞ペレットは、ゲル形成溶液（PBS中のペプチド/ポリマー/ LAP）に再懸濁され、そして細胞/モノマー混合物は、ガラスまたはシリンジモルに転送されますDS。細胞は（10ミリワット/ 365nmのcm 2の1-5分）（ 図1C）、光の印加時にヒドロゲル内にカプセル化されています。 （ 図1D）をフォトパターニングするために、ゲルを重合マトリックス中にペプチドおよび開始剤の拡散を可能にする、1時間30分間、30分間Pep1Alloc及びLAPに浸漬されています。これらのペプチドを含んだゲルは、所望のパターンを有するフォトマスクで覆い、マトリックス内遊離チオールにペプチドを結合するために光の第2用量（1分）にさらされています。ペンダントテザーにのみ共有結合適切な細胞-マトリックス相互作用を促進し、in vitroで細胞機能と運命をプロービングに向けた天然の細胞の微小環境の重要な機械的および生化学的特性を模倣する、光に露出した領域にゲルにリンクされています。
エルマンアッセイはphotopatte内のゲル修正およびペプチドの取り込みを定量化するための容易かつ安価な方法を提供し、rned基板。パターン化および非パターンゲル（ペプチドの改変の有無にかかわらず、すなわち 、ゲル）をエルマン反応緩衝液後重合中に浸漬されています。次に、システイン標準バッファに浸したゲルは、48ウェルプレートに入れ、エルマン試薬（左図2A）とインキュベートします。 1時間30分後、試料のアリコートを、96ウェルプレートの個々のウェルに入れ、吸光度を405nmで記録されています。システイン標準の較正曲線（ 図2A、右）は（吸光度線形フィット、濃度対）にプロットされ、そしてゲル中の遊離チオールの量は、それらの希釈係数に基づいて決定することができます。 10重量％のゲルの種々の重合及び光パターン条件のために、これらの遊離チオール濃度は、 図2Bに示されています。 Pep1Allocなし1または5分間重合ゲル（青いバー、I = 1分およびII = 5分）トンを示す、統計的に同様の遊離チオール濃度を有します帽子急速な反応が起こり、ゲル化は1分（両側t検定、p> 0.05）以内に完了する。このように、光（2-5分）への追加の暴露は、官能基の更なる変換にはなりません。 Pep1Allocなしで1分間重合ゲルは、30〜90分間（3 mg / mlで）およびLAP（2.2ミリモル）（緑色のバー、II = 30分とIV = 90分）Pep1Allocに浸漬し、光の第2の用量に曝露しました1分間。遊離チオールの減少（1分の条件に対して60から80パーセント）は、これらの条件下でペンダント手がかりとゲルの効率的な変更を示します。より高い変更が望まれる場合、Pep1Alloc溶液の濃度は、多くのペプチド溶液は、変換を制限し得る希釈中の遊離チオールへPep1Allocのアクセスとして使用することができる増加しました。例えば、我々は、20 mg / mlで遊離チオールのPep1Allocプロデュース> 90％の変換までの濃度のことを見出しました。
ユニーク、ペプチドのパターンは、ヒドロゲル月に追加しました急速にエルマン試薬（5分下の図3A）で画像化します。しかし、パターンの可視化は、ゲルを通して黄色のTNB の2-ジアニオンの拡散に起因した時間（5分より大きい）の上に失われます。撮像分解能を向上させ、三次元（X軸、Y軸、Z面）に、細胞の存在下でパターンを観察するため、蛍光性ペプチドの付加（AF488Pep1Alloc）が利用されてもよいです。 図3Bの x軸では、共焦点顕微鏡で撮影した画像スタックのy軸およびz突起はパターン解像度（ミクロンスケール）を実証し、示されています。
約（94±2）％と（94±1）分解性ゲル内に封入されたhMSCの％は、（Pep2Alloc = GPQG↓WGQ）少数の死細胞（赤核に、それぞれ、生存したままで（緑色細胞体）1と6日封止後）（ 図4A）を観察しました。さらに、hMSCのは、拡散は（6日後のカプセル化で観察されます
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図1：マクロマー及び光開始剤のヒドロゲル内のセルをカプセル化し、その後の生化学的手がかりと光パターンのセットアップ （A）ストック溶液を調製し、（PEG4SH =バックボーン、Pep2Alloc =架橋、Pep1Alloc =ペンダント接着部分（RGDS）、LAP =光開始剤混合）。 （B）細胞をカプセル化するために収集されます。 （C）細胞（それぞれ、PEG4SH / Pep2Alloc / LAPまたはPEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP）なしまたはインテグリン結合ペプチドとマクロマーソリューションと混合され、光への曝露時に封入されています。 ゲル形成の間に過剰なチオール基を含む（D）ゲル（ここで、2mMの過剰のチオールを用いて形成PEG4SH / Pep2Alloc / LAPが）、単一のAlloc基（Pep1Alloc、 例えば、で官能化ペプチドのその後の添加によって生化学的手がかりを用いてパターニングすることができますRGDS、IKVAV、 等 ）は、細胞接着を促進するためゲルの特定の領域内です。ここでは、蛍光標識されたRGDSを有するゲルのパターニングが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2： 定量的なエルマンアッセイのセットアップとその結果をパターン化ハイドロゲルの変形を評価するための （A）ゲルおよびシステイン基準はエルマン試薬で48ウェルプレート中でインキュベートします。線形標準曲線は、ゲル試料中のシステイン濃度を決定するためにプロットされています。 II = 5分重合; III = 30分のインキュベーションPep1Allocと;（B）過剰遊離チオールは、ペンダントのalloc-ペプチド（I = 1分間の重合をパターニング時にゲル形成中のヒドロゲル内に組み込まれ、消費されたIV = 90分のインキュベーションのwi第Pep1Alloc; IIIおよびIVの両方）を重合し、1分間光でパターン。示されたデータは、（n = 3）は標準誤差を示すエラーバーで平均値を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： エルマンアッセイおよび蛍光画像がフォトパターンヒドロゲルを可視化する （A）エルマン試薬は迅速にx方向におけるパターン（ライン）とy平面（黄色=パターン化されていない領域、スケールバー= 1 mm）を検出するために使用され得ます。 （B）蛍光ペプチドは、x軸、y軸、およびz平面（; 200ミクロンのスケールバー; 10X水浸漬対物; EX /エム525分の488 nmのグリーン=パターン領域）のパターンを観察するために使用されてもよいです。large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 生存率と非分解光パターンヒドロゲル内の細胞の代謝活性 （A）は実施例の共焦点zスタック（Z-投影; 10X水浸漬対物レンズ）、生存の（緑; EX /エム525分の488 nm）を死にました。 hMSCは（赤; EX /エム580分の543 nm）は、ヒドロゲル内にカプセル化後24時間カプセル化（スケールバー= 200μm）で。 6日のカプセル化（挿入画像、スケールバー=50μm）をした後、これらのヒドロゲルの中に広がった細胞。 （; II = 5分重合I = 1分重合）とパターニング条件（III = Pep1Allocで30分間のインキュベーション（B）細胞は、1と3日（それぞれ明るさと暗さのバー、）種々の重合のためのポストカプセル化は、代謝的に活性であります; IV = 90分incubationはPep1Allocと。両方の）重合し、1分間光でパターン。示されたデータは、（n = 3）は標準誤差を示すエラーバーで平均値を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1： ハイドロゲルを作製するためのストック溶液の体積を計算するための例のセットアップ青強調されているスプレッドシート内の細胞は、ユーザ定義のパラメータを示しています。他の量は、これらの設定に基づいて計算されます。ゲルを作るために、各ストック溶液の最終的なボリュームがオレンジ色で強調表示されます。白血球は、ユーザ定義のパラメータに基づいて最終的な体積を計算するために使用される数式を含みます。 2.2ミリモルのLAPの濃度が0.067重量％に相当することに注意してください。
Discussion
ここで紹介する手順は、チオール - エンクリックケミストリーによって形成されたヒドロゲル内のセルをphotoencapsulateする技術を実証し、その後、生化学的手がかりを有するゲルをphotopattern。最初にヒドロゲルを形成するための光の使用は、重合に先立って、ポリマー溶液内で均一に混合し、細胞の懸濁液を可能にします。急速な重合 'ロック'が定義されて金型の形状におけるゲルおよびハイドロゲルネットワーク内で懸濁した細胞をカプセル化します。ゲルはまた、所望の最終用途に応じて多数の異なる形状（ 例えば 、ガラススライドまたはシリンジ先端）に成形することができます。光減衰は、薄い試料に制限されるように、例えば、ガラススライドに取り付けられたヒドロゲルで3D培養のためにカプセル化された細胞が撮像用途のために特に有用です。シリンジ型をスライドガラスに比べて（サンプルの多くを短時間で製造することを可能にする、細胞の急速なカプセル化のために使用することができます複数の）そのようなフローサイトメトリーまたはqPCRのような多数の細胞を必要とする実験のために使用することができます。その後、これらのゲルは、その後、分化または浸潤のような所望の細胞応答を誘発するために、生化学的手がかりを用いてパターニングすることができる。30,31
生存率および代謝活性のためのアッセイは、提示された資料システムとパターニングの条件のための細胞の生存率を示しています。代謝活性が細胞機能に対する重合及びパターニング条件の初期効果を評価するために、非分解性ゲル（RGKGRKペプチド架橋）で3日目までモニターしたことに注意してください。また、分解性ペプチドの架橋（GPQGIWGQ）を用いて製剤化ゲル中のポストカプセル化は、細胞が生存し、培養液中で1週間で広がって残ることをサポートしている1と6日目のhMSCの膜完全性アッセイ（生/死生存性/細胞毒性染色）。追加の細胞株の生存率と同様の条件32を光パターンについて報告されていますここで使用され、生/死染色および代謝活性アッセイを用いて説明したヒドロゲル系について評価することができます。我々は、この材料系と関連する手順（4.2および4.3）を使用して、細胞生存率の問題は観察されなかったが、いくつかの細胞種は、フリーラジカルおよび/または露光に敏感であってもよいです。この場合、ユーザーは、アジド-アルキン、12 FXIII、31またはディールス・アルダーベースのヒドロゲル形成の化学的性質などの非光開始材料系を使用して検討すること。33
ゲル内の生化学的手がかりのパターンを検出し、定量化する容易な技術はまた、（3.1と3.2）を提示されています。試薬は市販されており、余分な合成処理工程以上の高価な試薬（ 例えば 、蛍光標識ペプチド）が必要とされないので、エルマンアッセイは、特に重要です。エルマンアッセイが正確にdiffere下生化学的手がかりと遊離チオールの変更を決定することができますntの条件を光パターンだけでなく、急速にパターンを可視化します。パターニングの前と後のペプチドの取込み、チオール官能基の濃度を定量するために、ペプチドの取り込みの定量的尺度として、直接エルマンアッセイにより評価されます。定量化のこのタイプは、蛍光標識されたペプチドを用いて行うことができるが、34撮像系の定量は、より多くの時間がかかるハンドリング及び分析手順（ 例えば 、ペプチド濃度に蛍光を関連付ける較正曲線の蛍光標識ペプチドおよび生成の合成を必要とします）画像解析を使用して。撮像ペプチドの取り込みのために、エルマン試薬を直接試料に適用し、即座に視覚化することができます。パターンの可視化のためのxおよびy平面に制限しながら、この技術は、遊離チオール基を含有するマトリックスがパターニングされているかどうかを決定するために、単純なルーチンの方法として使用することができます。エルマンアッセイをcではないことに注意することが重要ですそれはphotopatternsを観察し、定量化するために使用することができるが、それは細胞の存在下で行うことができないので、細胞適合性onsidered。三次元で、細胞の存在下でのパターニングを撮像するため、ヒドロゲルマトリックス内の蛍光性ペプチドの結合は強力で広く使用されるアプローチのままです。パターンの解像度は、y軸、x軸に評価することができ、Z平面共焦点顕微鏡を使用して、パターニング領域または非パターン領域内の細胞を同定することができるように、この方法は、細胞適合性です。まとめると、エルマンアッセイおよびイメージングベースの技術は、研究者は材料系内の両方の定量的および定性的生化学的手がかりの光パターンを評価するための補完的なツールです。
Photoclick、またはより広く光開始は、細胞の存在下でヒドロゲルの形成と修正のための化学物質は多数あります。ここに提示成形、カプセル化、およびパターニング技術は、LIMではありません説明材料系へitedとは、チオール-アルキン、35アジド-アルキン、4および他のチオール-エン化学的性質（ 例えば 、チオール-ノルボルネン）、10,13と同様のように代替光ベースの化学薬品に適用することができますこのようなイルガキュア2959、エオシンY、およびカンファーキノンなどの異なる光開始剤、。 、ユーザーがプロシージャのパラメータを調整する必要があります（ 例えば 、インキュベーション時間、重合時間、細胞密度は）条件が、これらの他のシステムのための細胞適合性のままであることを確認します。パターニング工程は、ヒドロゲル（2.2.3-2.2.5）にALLOC修飾ペプチドの拡散を必要とするので、この方法は、インテグリン結合部分（ 例えば 、ペプチドまたは細胞外マトリックスタンパク質の添加のために最も有用であろうネットワークへのリガンドの結合は、細胞と完全なインテグリン活性化による牽引力の生成に必要とされるヒドロゲル、にフラグメント）。36注意、生体分子のためのものかもしれません溶液中または固定化（ 例えば 、成長因子またはサイトカイン）の際にも同様にアクティブで、ヒドロゲルへの部分拡散（〜1時間）のためのインキュベーション工程は、パターニング結果を畳み込むシグナル伝達事象につながる可能性があります。他の方法は、そのパターニングのための成長因子の固定化やローカル隔離のために確立されている。37-39はさらに、パターン解像度は、露光量の制御によって決定されます。ここでは、フォトマスクは、ゲルの深さを通って、x軸とy平面内でパターンを作成できます。しかしながら、ゲル内の生化学的手がかりのパターニングをより空間的制御は、x方向におけるパターン、y軸、およびZ-面を生成するために二光子共焦点顕微鏡を使用するように照射する別の方法で達成することができる。34,40最後に、この手順内で利用される材料システムのみ最初に生化学的合図で修飾されている間、直交photoclick化学は、アルテを可能にするために使用することができることに注目することが重要です時間をかけて行列のプロパティで配給。12ここで紹介する手順および技術は、明確に定義されたと時空間制御特性を有する合成行列を作成するための現在のアプローチに多様性を追加します。特に、この手順内で使用される試薬および材料の商業的利用可能性は、制御された細胞培養液中のアプリケーションのためのハイドロゲルベースの生体材料の使用に興味を持つ研究者の広い範囲に有用であろう。
Acknowledgments
この作品は、創薬および国立衛生研究所で将軍医科学研究所（P20GM104316とP30のGM110758-01、それぞれ）から組織開発賞、ピュー慈善財団が資金を提供高度な生体材料にデラウェアCOBREプログラムによってサポートされていました（00026178）、全米科学財団のキャリア賞（DMR-1253906）、バローズウェルカム基金（1006787）、およびデラウェア大学の国立科学財団IGERT SBE2プログラム（L. Sawickiにフェローシップ）。著者らは、寛大に、骨髄、教授クリストファー・Jから単離されたhMSCを提供するために、ビデオ撮影時の支援のために、共焦点顕微鏡、さんキャサリンワイリーに氏マシュー・レーマンを訓練し、アクセスのためのデラウェア大学のデラウェアバイオテクノロジー研究所バイオイメージングセンターに感謝します自動プレートリーダーを使用するため。Kloxin氏とスティーブン馬寛大にフォトマスクを提供するための、および教授ウィルフレッド・チェン。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Peptides | Various Vendors | ---- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
| 4-arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
| 2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
| Flask, Round Bottom, 100 ml | Chemglass | CG-1506-05 | |
| 80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
| Magnetic Stir Bars | Various Vendors | ---- | |
| Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | ---- | |
| Vacuum Dessicator | Various Vendors | ---- | |
| Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
| Microcentrifuge tubes | Various Vendors | ---- | 1.5 or 2 ml sizes, sterile. |
| BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
| Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
| Photomasks | Advance Reproductions Corporation | ---- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
| DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
| Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
| Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
| CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Various Vendors | ---- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
| Multiwell Plate Reader | Various Vendors | ---- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
| Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | ---- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
| Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | ---- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
| Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | ---- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
| ImageJ | NIH | ---- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |
References
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