We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.
Klikk kjemi har blitt undersøkt for bruk i en rekke biomaterialer programmer, inkludert levering av legemidler, tissue engineering, og cellekultur. Spesielt lys-medierte klikk reaksjoner som photoinitiated tiol-en og tiol-yn reaksjoner, ga spatiotemporal kontrollen over materialegenskaper og tillate konstruksjon av systemer med en høy grad av brukerstyrt egenskap kontroll. Fabrikasjon og modifikasjon av hydrogel-baserte biomaterialer ved hjelp av presisjons by av lys og allsidighet som tilbys av disse tiol-X Photo kjemi er av økende interesse, spesielt for kulturen i celler i veldefinerte, biomimetic microenvironments. Her beskriver vi metoder for photoencapsulation av celler og påfølgende photopatterning av biokjemiske signaler innen hydrogel matriser ved hjelp av allsidige og modulære byggeklosser polymerisert av en tiol-ene Photo reaksjon. Spesielt er en tilnærming presenteres for constructing hydrogeler fra allyloksykarbonyl (Alloc) -functionalized peptid tverrbindinger og anheng peptid-molekyldeler og tiol-funksjonaliserte poly (etylenglykol) (PEG) som hurtig polymeriserer i nærvær av litium acylphosphinate fotoinitiator og cytocompatible doser av langbølget ultrafiolett (UV) lys. Lettvinte teknikker for å visualisere photopatterning og kvantifisere konsentrasjonen av peptider lagt beskrives. I tillegg er fremgangsmåter etablert for innkapsling av celler, spesielt humane stamceller, og bestemme deres levedyktighet og aktivitet. Mens dannelsen og innledende mønstring av thiol-Alloc hydrogeler er vist her, er disse teknikkene grovt kan anvendes på en rekke andre lys og radikal-initierte materialsystemer (f.eks tiol-norbornen, tiol-akrylat) for å generere mønstrede underlag.
Klikk kjemi blir stadig mer brukt i utformingen av materialer for mange biomedisinske applikasjoner, inkludert levering av legemidler, tissue engineering, og kontrollerte cellekultur, på grunn av deres selektive, effektive, og ofte cytocompatible reaktivitet. 1-3 Photo kjemi som bruker lys til å utløse eller innlede reaksjoner (f.eks azid-alkyn, 4-tiol-en, fem og tetrazol-alken 6) er av spesiell interesse for dannelsen eller modifikasjon av biomaterialer. Rapid priser under milde betingelser og kontroll av når og hvor de finner sted med lys gjør disse reaksjonene velegnet for brukerstyrt kontroll av biomateriale egenskaper i nærvær av celler. 7,8 Spesielt har tiol-en Photo kjemikalier blitt brukt å generere hydrogel-baserte biomaterialer med robuste mekaniske egenskaper og 5,9 for innkapsling av et stort utvalg av celletyper, inkludert, men ikke i noet begrenset til, humane stamceller (hMSCs), fibroblaster, kondrocytter og pankreatiske celler, med løftet for cellekultur og levering. 10,11 Videre har disse kjemi blitt anvendt for den romlige fordelingen av biokjemiske signaler for å etterligne nøkkelaspekter innfødte celle microenvironments og legge til rette for hensiktsmessige celle-matriks interaksjoner, inkludert heft, differensiering, og invasjon. 3,12
For bygging av tiol-ene hydrogeler med lys, peptider som inneholder cysteiner (tiol) vanligvis omsettes med polymerer funksjon med akrylater eller norbornener ( 'fiendtlige') for rask, photoinitiated polymerisasjon henhold cytocompatible forhold. 13 Utvide denne verktøykassen, søkte vi å etablere metoder for dannelsen hydrogel med nye allsidige og tilgjengelig byggeklosser som krevde minimal syntetisk behandling eller var kommersielt tilgjengelig mot deres bred bruk som syntetiske ekstracellulære matriser.14 Spesielt peptider ble modifisert med allyloksykarbonyl (Alloc) beskyttede lysines: en for anheng, integrin-bindende grupper for å fremme celle adhesjon [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] eller to for ikke-nedbrytbare eller celle-nedbrytbart tverrbindinger [K ( Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G eller KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc henholdsvis]. Med disse sekvensene, ble forhold etablert for hurtig reaksjon (1-5 minutter) med fire-arm thiol-modifisert poly (etylenglykol) (PEG4SH) ved anvendelse av cytocompatible doser av lang bølgelengde UV-lys (10 mW / cm 2 ved 365 nm) og fotoinitiatoren litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). De resulterende hydrogeler var stabilt under celledyrkningsbetingelser for uker. For å aktivere celledrevet degradering og ombygging, ble en enzymatisk spaltbar peptid innlemmet i gelen tverrbindinger (dvs. GPQGIWGQ), 15 og en modell primær celle, menneskelige stamceller (hMSCs), forble svært levedyktig etter innkapsling og during kultur innenfor disse matriser. Videre peptider er romlig mønster i disse materialene, og hMSCs være levedyktig og metabolsk aktiv i henhold photopatterning forhold. Alternativ anheng peptidsekvenser som ikke er vist her (f.eks IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.), også kan innarbeides i grunnmasser for å undersøke ytterligere celle interaksjoner med det omgivende mikromiljøet. Resultatene er lovende for anvendelse av disse hydrogel-baserte materialer for tre-dimensjonale (3D) cellekultur og levering til å studere og direkte celle-matriks-interaksjoner for en rekke forskjellige celletyper.
Heri, metoder for å photoencapsulate celler og senere photopattern biokjemiske signaler innenfor det foreslåtte hydrogel systemet presenteres (figur 1). Teknikker for å observere og kvantifisere disse photopatterns også demonstreres: spesielt, i) den kvantitative og kvalitative bruk av Ellmans analyse for å bestemme den modifikasjonav frie tioler innenfor mønstrede substrater og ii) den komplementære kvalitativ bruk av fluorescerende peptider (AF488Pep1Alloc) å observere disse mønstrene i tre dimensjoner. Videre analyser for å bestemme levedyktigheten (levende / død levedyktighet / cytotoksisitet farging) og metabolsk aktivitet (MTS, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) 2H-tetrazolium) presenteres slik at brukerne kan bestemme cytocompatibility av photoencapsulation og photopatterning forhold for ulike cellelinjer innen hydrogel matriser. Mens protokollen er vist for en lettvint lysbaser Photo hydrogel systemet, kan teknikker brukes til en rekke andre radikal-initierte hydrogel systemer for photoencapsulation og photopatterning i nærvær av celler.
Prosedyren som presenteres her demonstrerer teknikker for å photoencapsulate celler i hydrogeler dannet av tiol-ene klikk kjemi og senere photopattern gels med biokjemiske signaler. Bruken av lyset til å begynne med danne hydrogeler gir homogen blanding og suspensjon av cellene i løpet av polymeroppløsningen før polymerisasjon. Rapid polymeriseringsbetingelser "låser" av gelen i form av den definerte formen og innkapsler suspenderte celler i den hydrogel-nettverket. Gel også kan støpes inn i mange forskjellige former (f.eks glass eller sprøyte tips) avhengig av den endelige søknaden ønsket. For eksempel kan celler innkapslet for 3D-kultur i hydrogeler som er knyttet til objektglass er særlig anvendbare for bildebehandlingsapplikasjoner som lett demping er begrenset innenfor en tynn prøve. Sprøytestøpeformer kan benyttes for hurtig innkapsling av celler, slik at et større antall prøver som fremstilles i løpet av kort tid (i forhold til glass-slidee) som kan brukes til eksperimenter som krever et stort antall celler slik som strømningscytometri eller qPCR. Deretter disse gels så kan mønstret med biokjemiske signaler for å lokke fram ønskede cellulære responser som differensiering eller invasjon. 30,31
Analyser for levedyktighet og metabolsk aktivitet indikerer overlevelse av celler for materialet system og mønstring av betingelser som er presentert. Legg merke til at den metabolske aktiviteten ble monitorert inntil dag 3 i ikke-nedbrytbare geler (RGKGRK peptid fornettes) å vurdere den første effekten av polymerisasjons- og mønstrings forhold på cellefunksjon. I tillegg er en membran integritet analyse (live / dead levedyktighet / cytotoksisitet farging) av hMSCs 1 og 6 dager etter innkapsling i geleer formulert med et nedbrytbart peptid tverrbinding (GPQGIWGQ) støtter at celler forblir levedyktige og spres på en uke i kultur. Levedyktigheten av ytterligere cellelinjer som er blitt rapportert for photopatterning betingelser 32 som ligner de sombrukt her og kan bli vurdert for den beskrevne hydrogel systemet med live / dead farging og metabolske aktivitetsanalyser. Selv om vi ikke har observert problemer med celleviabilitet bruker dette materiale system og tilhørende prosedyrer (4.2 og 4.3), kan enkelte celletyper være følsomme for fri-radikal og / eller lys. I dette tilfellet kan brukere anser ved hjelp av ikke-photoinitiated materialer systemer, så som azid-alkyn, 12 FXIII, 31 eller Diels Alder-baserte hydrogel formasjons kjemi. 33
Lettvinte teknikker for å oppdage og kvantifisere fordelingen av biokjemiske signaler innenfor gels også presenteres (3,1 og 3,2). Ellmans analyse er av særlig interesse fordi reagensene er kommersielt tilgjengelige, og ingen ekstra syntetiske behandlingstrinn, eller mer kostbare reagenser (for eksempel fluorescens-merkede peptid) kreves. Ellmans analyse kan benyttes til å bestemme nøyaktig den modifikasjon av frie tioler med biokjemiske signaler i henhold til ulike geografiskent photopatterning tilstander, samt for å visualisere hurtig mønstre. For å kvantifisere inkorporering peptid, tiol-funksjonell gruppe konsentrasjon før og etter mønstring, som et kvantitativt mål på peptid innlemmelse, er direkte vurderes med Ellmans analyse. Selv om denne type kvantifisering kan utføres med fluoresceinmerkede peptider, krever 34 bildebasert kvantifisering mer tidkrevende håndtering og analysetrinn (for eksempel syntese av et fluorescensmerket-merket peptid og generering av en kalibreringskurve for å relatere fluorescens til peptidkonsentrasjonen ved hjelp av bildeanalyse). For avbildning peptid inkorporering, kan Ellmans reagens være direkte brukes til prøver og umiddelbart visualisert. Mens begrenset til x- og y-planene for visualisering mønster, kan den teknikk som brukes som en enkel, rutinemetode for å bestemme om matriser inneholdende frie tiolgrupper er mønstret. Det er viktig å merke seg at Ellmans analyse er ikke considered cytocompatible, slik at selv om det kan anvendes til å observere og kvantifisere photopatterns, kan det ikke gjøres i nærvær av celler. For avbilding av mønster i tre dimensjoner, og i nærvær av celler, forblir konjugering av fluorescerende peptider innenfor hydrogel matriser et kraftig og mye brukt metode. Oppløsning av mønstre kan evalueres i x-, y-, og z-plan ved hjelp av konfokal mikroskopi, og denne fremgangsmåte er cytocompatible, slik at cellene i mønstrede områder eller ikke-mønstrede områder kan identifiseres. Til sammen Ellmans analyse og bildebaserte teknikker er komplementære verktøy for forskere å vurdere både kvantitativt og kvalitativt photopatterning av biokjemiske signaler innenfor materialer system.
Photo, eller i videre forstand photoinitiated, kjemi for dannelse og modifikasjon av hydrogeler i nærvær av celler er mange. Profilstålene, innkapsling, og mønstrings teknikkene som presenteres her er ikke limset til det beskrevne materiale system og kan anvendes til alternative lys-basert kjemi, slik som tiol-alkyn, 35 azid-alkyn, 4 og andre tiol-en kjemi (f.eks tiol-norbornen), 10,13 så vel som med forskjellige fotoinitiatorer, så som Irgacure 2959, Eosin Y, og kamferkinon. Obs, kan brukerne trenger å justere prosedyren parametere (f.eks inkubasjonstid, Polymerisasjon ganger, celle tetthet) for å sikre at forholdene fortsatt cytocompatible for disse andre systemer. Siden mønstringsprosess krever diffusjon av det alloc-modifiserte peptid (e) inn i hydrogelen (2.2.3-2.2.5) Denne prosessen kan vise seg å være mest nyttige for tilsetningen av integrin-bindende grupper (for eksempel peptider eller ekstracellulært matriksprotein fragmenter) til hydrogelen, hvor festing av liganden til nettverket er nødvendig for generering av trekkrefter av cellen og full-integrin-aktivering. 36 Note, til biomolekyler som kanskjeå være like aktiv i oppløsning eller ved immobilisering (f.eks, vekstfaktorer eller cytokiner), kan det inkuberingstrinn for delen diffusjon (~ 1 time) inn i hydrogelen føre til at signaleringshendelser som convolute mønster resultater. Andre fremgangsmåter er blitt etablert for vekstfaktor immobilisering eller lokal lagring for deres mønster. 37-39 tillegg er mønsteret oppløsning diktert av kontroll over lyseksponering. Her, fotomasker tillate opprettelse av mønstre gjennom gelen dybde og i x- og y-plan; imidlertid kan større romlig kontroll over fordelingen av biokjemiske signaler innenfor geler oppnås ved alternative metoder for bestråling, slik som bruk av en to-foton konfokalt mikroskop for å generere mønstre i x-, y- og z- plan. 34,40 til slutt er det viktig å merke seg at mens materialet systemet utnyttes innen denne prosedyren er kun innledningsvis modifisert med biokjemiske signaler, kunne ortogonale Photo kjemi anvendes for å tillate alterasjoner i matrise egenskaper over tid. 12 prosedyren og teknikkene som presenteres her legge mangfold til dagens metoder for å lage syntetiske matriser med veldefinerte og spatiotemporally-kontrollerte egenskaper. Spesielt vil den kommersielle tilgjengeligheten av reagenser og materialer som brukes i denne fremgangsmåten være nyttig for et bredt spekter av forskere som er interessert i bruk av hydrogel-baserte biomaterialer for bruk i kontrollert cellekultur.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Delaware Cobre programmene i Drug Discovery og i Avanserte biomaterialer finansiert av institusjonell utvikling Awards fra National Institute of Generals medisinske basalfag ved National Institutes of Health (P20GM104316 og P30 GM110758-01, henholdsvis), Pew Charitable Trusts (00026178), en National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), den Burroughs Wellcome Fund (1.006.787), og National Science Foundation IGERT SBE2 program ved University of Delaware (fellesskap til L. Sawicki). Forfatterne takker Delaware Bioteknologi Institute Bioimaging Center ved University of Delaware for opplæring og tilgang til konfokalmikroskopi, Ms Katherine Wiley for assistanse under videoen skyte, Mr. Matthew Rehmann for sjenerøst gi hMSCs isolert fra benmarg, professor Christopher J . Kloxin og Mr. Stephen Ma for sjenerøst gi fotomasker, og Prof. Wilfred Chen for bruk av automatisert plateleser. </p>
Custom Peptides | Various Vendors | —- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
4arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
Flask, Round Bottom, 100 mL | Chemglass | CG-1506-05 | |
80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
Magnetic Stir Bars | Various Vendors | —- | |
Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | —- | |
Vacuum Dessicator | Various Vendors | —- | |
Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
Microcentrifuge tubes | Various Vendors | —- | 1.5 or 2 mL sizes, sterile. |
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
Photomasks | Advance Reproductions Corporation | —- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
Centrifuge | Various Vendors | —- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
Multiwell Plate Reader | Various Vendors | —- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | —- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | —- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | —- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
ImageJ | NIH | —- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |