Introduction
حقن مكروي حشوية الأجنة 1-الخلية هي تقنية قوية جدا. ويمكن استخدامه لتوصيل أي حل في جنين، على سبيل المثال، تنتج الجينات تدق الرافضة لدراسة وظيفة الجين أو لتوليد الحيوانات في تحرير الجين. بيضات ملقحة حيوانات المزرعة معظم ذات الصلة زراعيا لديها تكوين الأحماض الدهنية عالية جدا يجعل السيتوبلازم بها مبهمة والظلام 1. لديهم أيضا غشاء البلازما مرنة إلى حد ما (بعد الظهر). هذه الخصائص تجعل حقن مكروي باستخدام pronuclear التقليدي / حقن حشوية كما تستخدم في أنواع القوارض الصعبة وغالبا غير دقيقة.
حقن مكروي حشوية مزاياه على حقن مكروي pronuclear لأنه من الأسهل لأداء ويسبب أيضا أقل الأضرار التي لحقت الأجنة المحقونة، مما أدى إلى ارتفاع قابلية 2. ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار وسيلة ناجحة لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة لحيوانات المزرعة. لتكون قادرة على أداءحقن مكروي حشوية مع كفاءة عالية على أجنة الماشية، يتم استخدام الليزر لتوليد حفرة في المنطقة الشفافة (ZP) وبعد ذلك يتم استخدام الزجاج إبرة حادة في نهاية لحقن مكروي. وتهدف هذه الاستراتيجية للحد من الأضرار الميكانيكية مطبوع على الجنين أثناء الحقن. ثم، تطلع محتوى حشوية داخل إبرة حقن يسمح الكسر كفاءة وثقة من رئيس الوزراء ضمان أن الحل يتم تسليم إلى السيتوبلازم للجنين.
وقد تم بالفعل استخدام هذه التقنية بنجاح في أجنة الأبقار لتسليم سيرنا إلى السيتوبلازم اقحي 3،4 وتوليد الطفرات باستخدام تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / كريسبر يرتبط نظام 9 (Cas9) نظام 5. بل هو أيضا مناسبة (مع تعديلات طفيفة) لحقن الأبقار المغلقة الركامية البويضات 6. هنا، وصفنا لدينا بروتوكول حقن تقديم صبغة، التي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لحقن أي ديحل IRED في البيضة الملقحة، وتبين أن استخدام هذا الأسلوب يسبب الحد الأدنى من تحلل و لا يؤثر على تطور الجنين في وقت مبكر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Micropipette الإنتاج
- حقن micropipette
- ضع الشعرية البورسليكات الزجاج (القطر الخارجي (OD): 1.0 ملم، القطر الداخلي (ID): 0.75 ملم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله.
- استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع جامع طويلة. (مثال: الحرارة: 825؛ سحب: 30؛ السرعة: 120، المدة: 200؛ الضغط: 500).
- إزالة بعناية ماصات سحبت من الجهاز ووضعه على microforge في وضع أفقي.
- جلب ماصة سحبت وmicroforge سخان خيوط مع حبة الزجاج لها إلى التركيز. استخدام الشبيكة العدسة لقياس سمك المطلوب ونقل ماصة أفقيا حتى يصل إلى خيوط سخان القطر الداخلي الهدف (5 ميكرون).
- ضبط الحرارة إلى حوالي 45٪، وجلب بلطف ماصة أسفل حتى يلامس خيوط. تفعيل سخان لفترة وجيزة. هذا ثتذوب سوء قليلا ماصة لذلك تتمسك خيوط وعلى التبريد، وماصة كسر في نقطة الاتصال توليد قطع على التوالي.
ملاحظة: ضبط درجة الحرارة المناسبة هو مفتاح الحل في هذه الخطوة منذ درجات حرارة عالية جدا سيجعل منحنى ماصة، وبالتالي فإن قطع على التوالي لن يكون ممكنا، وسوف درجات حرارة منخفضة جدا لا تكون كافية لإذابة ماصة (الشكل 1A). - تقديم التقريبية 30 درجة زاوية بالقرب من غيض ماصة بوضعها حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط سخان. ضبط درجة الحرارة إلى 60٪ وتفعيل سخان.
ملاحظة: هذا ثني ماصة على خيوط. هذا هو المطلوب زاوية حتى غيض من الإبرة موازية للسطح لوحة حقن عندما شنت في محقن (الشكل 1B). - التعامل مع ماصات حقن مكروي بحذر لأنها حادة جدا وهشة.
- micropipette عقد
- وضع borosilicأكل الزجاج الشعرية (OD: 1.0 مم، الرقم: 0.75 مم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله.
- استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع طويلة حتى تفتق والجدران الموازية (مثال: الحرارة: 815؛ سحب: 20؛ السرعة: 140، المدة: 175؛ الضغط: 200).
- إزالة بعناية ماصة سحبها من جهاز مجتذب ووضعه على حامل microforge في وضع أفقي. ضبط التركيز على خيوط سخان وماصة.
- استخدام الشبيكة العدسة لقياس قطرها ماصة ونقل ماصة حتى قطرها على خيوط يصل 180 ميكرون.
- وفيما يتعلق بحجم المشار إليه، بمناسبة الزجاج الشعرية مع طرف قلم الماس، ثم اضغط بلطف على طرف سحبت لكسر الزجاج. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى قطع على التوالي (الشكل 1C).
- نقل ماصة لوضع عمودي مع طرفها قريب من خيوط. ضبط درجة الحرارة من microforge إلى 60٪.
- النار تلميع غيض من ماصة باستخدام التقنيات القياسية 7 حتى يصل معرف من 40 ميكرون. استخدام الشبيكة العدسة للتحقق من الهوية (1D الشكل).
- جعل زاوية على ماصة.
- جلب ماصة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط و 5 ملم بعيدا من طرفها. ضبط درجة الحرارة إلى ما يقرب من 60٪ وتفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم التوصل إلى زاوية المطلوب (حوالي 30 س). تحقق من زاوية بصريا (الشكل 1E).
ملاحظة: شنت ماصة عادة إلى microinjector في زاوية تقارب 60 درجة بالنسبة إلى الجزء السفلي من الطبق الحقن. عازمة غيض من ماصة لذلك هو مواز لقاع الطبق، وهو أمر ضروري لحقن الصحيح للجنين في الطائرة المتوسطة لها.
- جلب ماصة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط و 5 ملم بعيدا من طرفها. ضبط درجة الحرارة إلى ما يقرب من 60٪ وتفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم التوصل إلى زاوية المطلوب (حوالي 30 س). تحقق من زاوية بصريا (الشكل 1E).
- تأكد من أن microinjectors يتم تحميلها بشكل كامل مع النفط وعدم وجود فقاعات الهواء في النظام (فقاعات في microinjector منع مراقبة دقيقة من الحقن).
- تأكد من أن micromanipulators هم في موقف وسط. وهذا سوف يسمح لمجموعة واسعة من حركة ماصات.
- إدراج ماصة عقد في حامل micromanipulator الأيسر وماصة الحقن في حامل المجهرية الصحيح.
- تسمح النفط للدخول في ماصات من الشعرية والتحقق من أن النظام يعمل بشكل صحيح عن طريق نقل النفط صعودا وهبوطا داخل ماصة باستخدام عناصر التحكم microinjector.
ملاحظة: إذا كان هناك أي تحرك النفط داخل الإبر، قد يكون هناك تسد. في هذه الحالة، استخدم إبرة جديدة. - استخدم عناصر التحكم micromanipulator لجلب ماصات في وسط الميدان المجهر وجهة نظر. باستخدام 4X التكبير، تأكد من أن نصائح micropipette هي في الزاوية الصحيحة (صarallel إلى أسفل الطبق).
ملاحظة: الإعداد الصحيح من الإبر هو المفتاح لنجاح الحقن والنتائج الاتساق. - معايرة نظام ليزر التالية دليل معايرة الشركة المصنعة.
3. إعداد حقن طبق (الشكل 2)
- وضع قطرة 50 ميكرولتر من درجة حرارة (37 درجة مئوية) SOF-HEPES (تكوين مفصلة في قسم المواد) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) في وسط غطاء من 100 ملم طبق بتري. ضع 1 - قطرة ميكرولتر 2 من الحل ليتم حقنه على مقربة من انخفاض الحقن. تأكد من أن الأجنة لا يبرد أدناه RT.
ملاحظة: في هذا البروتوكول سوف نقوم بإضافة صبغ ديكستران الأحمر إلى حل عن طريق الحقن لتكون قادرة على تصور موقع الحقن وتتبع في وقت لاحق. - تغطية قطرات في لوحة الحقن باستخدام حوالي 10 مل من الزيوت المعدنية.
- وضع طبق حقن على مسرح المجهر المقلوب وجلب نقطةettes إلى انخفاض الحقن. تأكد من أن الإبر في التركيز داخل قطرة. ضبط ارتفاعها حسب الحاجة باستخدام عناصر التحكم micromanipulator.
- باستخدام microdispenser، تحميل حوالي 20 - 30 بيضات ملقحة (17-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF)) في الجانب العلوي من انخفاض الحقن. أداء حقن في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تحديد عدد الأجنة في انخفاض حقن من السرعة التي يمكن للشخص أن ضخها. لا تحميل المزيد من الأجنة من تلك التي يمكن حقنها في 30 دقيقة.
- لتحميل الأجنة في microdispenser، تضغط على المكبس بشكل كامل وتزج طرف في محلول يحتوي على الأجنة. لمس الأجنة ويمكن الحصول عليها مع غيض من الزجاج الشعرية (واحد في ذلك الوقت) والافراج عن ببطء الغطاس حتى يدخل كل جنين في شعري. كرر هذا حتى يتم القبض على جميع الأجنة أعلى أو القدرة microdispenser ممتلئ.
- للافراج عن الأجنة تحميل، كساد الغطاس بلطف حتى كامل حجم التعاونntaining الأجنة يتم تحريرها من الشعيرات الدموية.
4. حقن مكروي
- باستخدام الهدف 4X، تحميل الحل ليتم حقنه في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي (الشفط). تحميل حلا كافيا لحقن 2-3 بيضات ملقحة. ثم نقل إلى تراجع الحقن.
- داخل قطرة حقن، نقل ماصة عقد حتى يحصل على معلومات سرية بالقرب من البيضة الملقحة. الضغط السلبي (نضح) مع microinjector عقد حتى يحصل ثابتة البيضة الملقحة إلى ماصة عقد والتغيير إلى الهدف 20X.
- مرة واحدة يتم إرفاق البيضة الملقحة إلى ماصة القابضة، والتحقق من جودة وذلك باستخدام ماصة حقن للتحرك بلطف الجنين في جميع أنحاء دون فصلها. وينبغي أن يكون البيضة الملقحة ذات نوعية جيدة الهيئات القطبية اثنين (على الرغم من أن في بعض الأحيان واحد فقط وينظر) والسيتوبلازم متجانسة. لا حقن بيضات ملقحة غير طبيعية (الشكل 3A).
- إذا لزم الأمر، إعادة الجنين لحقن السليمموقع. ومن شأن تحديد المواقع الجيدة تكون تلك التي هناك بعض المساحة بين ZP ومساء، حتى رئيس الوزراء لا تحصل على تضررت بواسطة الليزر.
- تأكد من أن ماصة حقن يتوضع على منتصف الطائرة-الجنين عن طريق لمس بلطف البيضة الملقحة في موقع الحقن. إذا لم يكن عن دورتها منتصف الطائرة، فإن إبرة تميل إلى جعل الجنين تدوير بدلا من ثقب. ضبط ارتفاع ماصة الحقن حسب الحاجة.
- جعل ثقب في ZP باستخدام الليزر (الشكل 3B).
- باستخدام الليزر مكان البرمجيات الشبيكة الليزر في ZP حيث سيتم إجراء ثقب (على الجانب الآخر إلى حيث تعلق الجنين إلى ماصة القابضة). باستخدام جهاز التحكم الليزر نافذة انقر على زر اطلاق النار. تأكد من أن حجم الفتحة كبيرة بما يكفي لخلق فتحة في ZP للإبرة لتمرير من خلال دون الإضرار PM (مثال: 0،662 مللي ثانية نبض العرض / 6.9 ميكرون حجم ثقب).
- تمرير إبرة حقنمن خلال ثقب في ZP واجراء اتصالات مع رئيس الوزراء. مواصلة دفع ماصة إلى الأمام حتى الإبرة ¾ من الطريق في الجنين (الشكل 3C).
- مراقبة الموقف من الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط، حيث سيؤدي ذلك إلى أن تستخدم للسيطرة على الدوام حجم الحقن.
- الضغط السلبي (نضح) على ماصة حقن، الأمر الذي سيؤدي في الظهر، والسيتوبلازم الذي يستنشق في إبرة الحقن. تستمر حتى حركة السيتوبلازم في إبرة يسرع أو عند المحتوى السيتوبلازم الخلط مع حقن محلول يمكن رؤيتها. وتشير هذه الكسر من رئيس الوزراء (الشكل 3D).
- حقن الظهر محتوى حشوية تليها الحل في سيتوبلازم البيضة الملقحة عن طريق تطبيق الضغط الايجابي (حقن)، حتى الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط تقدمت يعادل قطر البيضة الملقحة واحد بعد نقطة الانطلاق.
ملاحظة: في ظل ظروف لدينا، وهذا ممثلى أعضاءsents حوالي 7 رر من حل حقن (الشكل 3E). - التغيير إلى الهدف 4X ونقل حقن الجنين / ثانية إلى الجانب السفلي من انخفاض الحقن. الافراج عن الجنين عن طريق الضغط الإيجابي على microinjector القابضة. الحفاظ على الأجنة غير المحقونة على الجانب العلوي، وحقن تلك الموجودة على الجانب السفلي من الهبوط للمساعدة في تتبع حقن الأجنة / غير حقنه والعمل بكفاءة.
5. الأجنة استعادة وحقن نتائج
- تقديم 3 قطرات من حوالي 200 ميكرولتر في طبق جديد مع تسخينه مسبقا SOF-HEPES. جمع الأجنة حقن باستخدام microdispenser (كما هو موضح أعلاه). غسل الأجنة المحقونة عن طريق نقلها من خلال 3 SOF-HEPES يسقط.
- عدد الأجنة هي lysed خلال حقن مكروي والتخلص منها.
ملاحظة: البيضة الملقحة هي lysed يمكن تمييزها بسهولة من واحدة سليمة منذ أول واحد يبدو شفافة، وملء ZP كله، وأنها عادة ما تكون حشويةمحتوى تسرب إلى خارج الجنين. - اختياريا، والتحقق من كفاءة حقن مكروي باستخدام المجهر الفلورسنت. كن على علم أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تحدث الضرر الجنين الذي يمكن أن يؤثر على تطور لاحق.
- جماعات ثقافة 25 الأجنة المحقونة في 50 قطرات ميكرولتر من المتوسطة البوتاسيوم البسيط الأمثل (KSOM) تستكمل مع 4 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) تحت الزيوت المعدنية في 38.5 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في الهواء، والرطوبة من التشبع.
- تكملة سائل الإعلام والثقافة مع 5٪ FBS بعد يومين من الحقن.
- تحقق الكيسة الأريمية (BL) معدلات 7 أيام بعد الحقن. حساب BL أسعار الفائدة في عدد من الأجنة الكيسة / العدد الكلي للأجنة مثقف في هذا الانخفاض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بمساعدة الليزر حقن مكروي حشوية هو بروتوكول قوية وموثوق بها لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة الماشية. ويبين الشكل 3 مخطط العام للبيضات ملقحة قبل وبعد حقن فضلا عن مخطط الشامل لهذه التقنية. يستخدم ديكستران الحمراء عن طريق الحقن الحل للسماح الموقع تتبع الحقن والحقن كفاءة ودقة. ويتضح نجاح تنفيذ الحل في الشكل 4 يظهر الجنين حقن مؤخرا والتي يتم توزيعها الصبغة متجانس في السيتوبلازم. باستخدام هذه التقنية يتم حقن 100٪ من الأجنة في السيتوبلازم بهم.
وقد أثبت هذا البروتوكول لدينا أسعار تحلل الحد الأدنى في الأبقار والأغنام بيضات ملقحة. فقط كانت هي lysed 15.6 ± 5 و 5.8 ± 3.9٪ من الأجنة المحقونة في الأبقار والأغنام، على التوالي، نتيجة للحقن مكروي
وتشير هذه النتائج إلى أن حقن داخل الهيولى بمساعدة الليزر يسبب أضرار طفيفة أثناء الحقن والنتائج في معدلات التنمية الكيسة العادية.
الشكل 1: مخطط العام عرض كيفية جعل القابضة وحقن الماصات. AB) حقن ماصة، م) عقد ماصة. أ) تلمس برفق خيوط مع ماصة سحبت في القطر المطلوب (5 ميكرون). تفعيل لفترة وجيزة سخان (أظهر في س نطاق). هذا وسوف تذوب قليلا ماصة لذلك تتمسك خيوط وعلى التبريد، وماصة وكسر في نقطة الاتصال توليد قطع على التوالي. ب) تقديم وزاوية في ماصة حوالي 0.5 سم بعيدا عن طرفها عن طريق وضع ماصة حول 10 ميكرون بعيدا عن خيوط سخان. يستمر التسخين حتى يتم تحقيق زاوية المرجوة. ج) استخدام قلم الماس الحافة للاحتفال وقطع ماصة عقد في القطر المطلوب (180 ميكرون). د) في وضع عمودي، النار تلميع غيض من ماصة عقد حتى تصل إلى القطر المطلوب الداخلي (40 ميكرون). E) تقديم زاوية على ماصة جلب ماصة مرة أخرى إلى وضع أفقي على ميكرون الزوجين بعيدا عن خيوط وحوالي 0.5 سم بعيدا عن طرفها. تفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم تحقيق زاوية المرجوة. انظر 8،9،10 لمزيد من التفاصيل حول كيفية جعل الإبر.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:.. الإعداد العام لحقن طبق ترتيب الماصات، قطرات، ويتم عرض الأجنة في هذا الرسم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): بمساعدة الليزر داخل الهيولى بروتوكول حقن أ) رسم تخطيطي العام لاقحة تعلق على ماصة عقد قبل الحقن. PB: الهيئات القطبية، ZP: المنطقة الشفافة، CYT: السيتوبلازم، PN: pronuclei، PM: البلازما MEMBRAN ه، HP: عقد ماصة، IP: حقن ماصة BE) خطوات حقن مكروي: B) جعل ثقب في ZP من البيضة الملقحة التي تعلق على ماصة عقد باستخدام الليزر C) وضع ماصة حقن نحو الجانب الآخر من الجنين. . التحقق من موقف الغضروف المفصلي (أ). د) كسر غشاء البلازما بواسطة الشفط محتوى حشوية داخل ماصة الحقن. E) حقن المحتوى مرة أخرى حشوية والحل في السيتوبلازم اقحي، حتى يصل الغضروف المفصلي قطر البيضة الملقحة واحد (ب) الماضي نقطة الانطلاق . يمثل المسافة AB = 7 رر من المحلول المحقون. F) رسم تخطيطي العام للالبيضة الملقحة بعد الحقن. لاحظ أن الحل حقن ينتشر بشكل متجانس في السيتوبلازم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
"1"> 
الرقم 4: الرقم ممثل لاقحة المصبوبة مع ديكستران الحمراء أ) صورة حقل مشرق من البيضة الملقحة ب حقن) صورة الفلورسنت من البيضة الملقحة حقن الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: نسبة هي lysed الأجنة بعد اقحة حقن مكروي في نوعين من أنواع مختلفة تمثل البيانات 4 يعيد للأجنة الأبقار (103 بيضات ملقحة حقن) و 3 نسخ متماثلة للأجنة الأغنام (173 بيضات ملقحة حقن). تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
يمثل الكيسة الاسعار في الأبقار وصوف الأجنة البيانات 4 يعيد للأنواع الأبقار مع ما مجموعه 102 وحقن 156 الأجنة السيطرة و3 يعيد للأنواع الأغنام مع ما مجموعه 163 وحقن 239 الأجنة التحكم: الرقم 6. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microinjection من بيضات ملقحة هي طريقة راسخة لتقديم حلول في أجنة الثدييات. مع بعض الاختلافات التي تعتمد على الأنواع والهدف من التجربة، وهذه التقنية يمكن استخدامها على نطاق واسع. وتبين لنا كيفية أداء حقن مكروي داخل الهيولى استخدام الليزر لمساعدة مدخل micropipette كليلة نهاية. بيضات ملقحة من بعض الأنواع الحيوانية (مثل الأبقار والأغنام والخنازير) لديها السيتوبلازم الظلام، مما يعوق تصور ماصة حقن مرة واحدة داخل الجنين. أيضا، أغشية البلازما الخاصة بهم ومرنة للغاية، مما يجعل اختراقهم بإبرة ارتفعت مشطوف (التي تستخدم عادة لحقن بيضات ملقحة من أنواع القوارض) من الصعب تحقيقه. للتغلب على هذه القيود، استخدمنا الليزر لتمكين مرور إبرة حادة نهاية من خلال المنطقة الشفافة والتطلع لاحق من المحتويات حشوية لضمان كسر غشاء البلازما والإفراج عن الحل داخل سيتوبلازم الجنين. وعلاوة على ذلك، من خلال injectiنانوغرام في الموقع المقابل للمدخل إبرة (حوالي 3/4 داخل جنين) ونحن نهدف إلى تهجير PN وبالتالي تجنب لهم طموح / الحقن. وعلاوة على ذلك، وهذا يوفر المزيد من نقطة اتصال لغشاء كسر للشفاء، مما أدى إلى انخفاض معدلات تحلل.
إنتاج بال micropipettes جيدة (خصيصا ماصة الحقن) ومناسب ووضع لهم في micromanipulator هو المفتاح لتحقيق نتائج جيدة مع هذه التقنية. إبرة الحقن يمكن استخدامها لطالما يتحرك الحل حقن بسلاسة داخل الإبرة. في بعض الأحيان، ويحصل على محتوى المحتوى أو حتى pronuclei حشوية عالقا داخل رأس الإبرة، مما تسبب في تدفق لتشغيل بشكل غير متساو وتعقيد حقن (هذا أيضا يزيد من معدلات تحلل ويؤخر عملية). استبدال إبرة الحقن عندما يحدث ذلك لا بد من الحصول على أفضل النتائج مع هذا البروتوكول. مقدار الوقت أن الأجنة خارج الحاضنة أمر بالغ الأهميةللحصول على معدلات البقاء على قيد الحياة مستمرة ويجب أن لا تتجاوز 30 دقيقة. بعد التدريب والممارسة، ومشغلي عادة تحقيق سرعة حقن 1-2 حقن الأجنة في الدقيقة الواحدة. نقطة رئيسية أخرى لنجاح هذا البروتوكول هو لحقن باستمرار على نفس القدر من حجم محلول في جنين. وبسهولة ودقة التحكم بذلك عن طريق مراقبة النزوح من واجهة الغضروف المفصلي حل للنفط. من المهم أن قطر ماصة يتسق بين التلاعب وأن الطرف التي يبلغ قطرها منتظم ومستمر. مع 5 الماصات معرف ميكرومتر على الحافة، و7-10 رر من حجم الحقن ويتحقق عن طريق حقن ما يعادل طول لاقحة ل. الإفراط في حقن غالبا ما يؤدي إلى تحلل الجنين.
باستخدام هذا البروتوكول، يتم حقن 100٪ من الأجنة بشكل صحيح إلى السيتوبلازم، وتجنب تماما محيط بالمح كاذبة الحقن الفضاء (الشكل 4). هذا يزيد من الموثوقية واستنساخ للفحص يجري (بغض النظر عن الحل حقن) منذ النتائج هي فقط بسبب تأثير المحلول المحقون وعدم التضارب الحقن. وبعض بيضات ملقحة حقن عادة ليز بسبب الأضرار الميكانيكية أثناء الحقن. والمعدل المعتاد من البقاء على قيد الحياة بعد حقن 75٪ 11. باستخدام هذه الطريقة، ونحن قادرون على الحصول على معدلات الحد الأدنى من الأجنة هي lysed (الشكل 5). أيضا، كانت معدلات التنمية الكيسة الأريمية مقارنة بعدم حقن (مراقبة) الأجنة (الشكل 6)، تدل على أن تقنية الحقن ليس له آثار ضارة على تطور الجنين في وقت مبكر. تم مقارنة كفاءة هذا البروتوكول مؤخرا إلى بروتوكول حقن مكروي حشوية التقليدي (حقن مكروي حشوية المباشر باستخدام إبرة الزجاج ارتفعت مشطوف من دون استخدام الليزر لاختراق دي ZP) لحقن بيضات ملقحة البقري 5. أظهرت النتائج معدلات أعلى بكثير من الأجنة هي lysed وانخفاض معدلات تشكيل الكيسات الأريمية لcytopl مباشرةحقن مكروي asmic. ونعتقد أن هذه الاختلافات ترجع إلى التلف الميكانيكي أقل خلال اختراق الإبرة عند استخدام حقن مكروي حشوية بمساعدة الليزر، مما يجعل هذا البروتوكول هو الخيار المفضل لحقن أنواع الحيوانات في المختبر لدينا.
هنا، نقدم بيانات عن الأبقار والأغنام الأجنة التي حصل عليها المختبر في الإخصاب، ولكن أيضا باختبار بروتوكول استخدام في الجسم الحي وفي المختبر أجنة الخنازير الحصول على نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات). اعتمادا على حل حقن، هذا البروتوكول يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات. في الآونة الأخيرة، ونحن قد تستخدم لإدخال كريسبر نظام / Cas9 إلى خروج المغلوب جينات معينة على في المختبر المخصبة أجنة الأبقار وجدت نسبة عالية من الكيسات الأريمية متسلسلة مع الطفرات: 50٪ من الأجنة (ن = 6) كان الطفرات biallelic ، كان 33٪ (ن = 4) الطفرات monoallelic، و 17٪ (ن = 2) كانت من النوع البري 5. وقد تم هذا البروتوكول موثوق بها للغاية ويمكن استخدامها فيالعديد من الأنواع وتطبيقات لا تعد ولا تحصى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
- McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
- Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
- Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
- Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
- Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
- Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
- Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
- Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
- Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
- Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).
