Introduction
1 - 细胞胚胎显微注射细胞质是一个非常强大的技术。它可用于递送任何溶液进入胚胎，例如，产生基因敲除研究基因功能或产生基因编辑动物。农业最相关的农场动物受精卵具有非常高的脂肪酸组合物，使得它们的细胞质不透明和暗1。他们也有相当的弹性质膜（PM）。这些特点使显微注射用常规的原核/胞浆注射在啮齿类动物具有挑战性，往往不准确使用。
细胞质微注射有超过原核显微注射法的优点，因为它是更容易执行并且也导致了注射的胚胎损伤小，导致更高的2生存能力。此协议的总体目标是演示提供解决方案到农场动物受精卵的细胞质一种成功的方法。到能够执行对家畜胚胎效率高细胞质微注射，激光被用来产生在透明带（ZP），然后一个钝端部玻璃针用于显微注射的孔。这一战略旨在减少注射时印在胚胎的机械损伤。然后，注射针内胞质内容抽吸允许PM的效率和自信破损确保溶液被输送到胚胎的细胞质中。
这种技术已在牛胚胎被成功地用于siRNA递送到合子的细胞质3,4和生成使用群集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关联的系统9（Cas9）系统5的突变。它也适合（稍加修改）注入牛卵丘封闭的卵母细胞6。这里，我们描述我们的注射方案提供的染料，这可以是适用于注射任何宫IRED溶液注入受精卵，并表明，使用这种技术使得最小裂解并且不影响早期胚胎发育。
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Protocol
1，微管生产
- 注射微量
- 放置一个硼硅玻璃毛细管（外径（OD）：1.0毫米，内径（ID）0.75毫米）的一个微量拉马（在右侧和左侧毛细管持有者的中心）并锁定。
- 使用适当的程序来拉玻璃毛细管，因此导致了薄带尖长攻丝机。 （例如：热量：825;拉：30;速度：120;时间：200;压力：500）。
- 小心地从设备中取出拉移液器，将它放在一个microforge在水平位置。
- 带上拉吸管和其玻璃珠成焦点microforge加热器丝。使用目镜标线片以测量所需的厚度和水平移动吸移管，直到加热器灯丝达到目标内径（5微米）。
- 调整热至约45％，轻轻地使吸管向下使其接触灯丝。简要地激活加热器。该W病略微熔融吸移管，因此粘附于灯丝并在冷却，移液器将在接触点产生的直切断裂。
注意：设置适当的温度是在该步骤中的关键，因为温度太高会使吸管弯曲，因此直切是不可能的，温度太低会不足以熔化移液器（ 图1A）。 - 通过从加热器灯丝定位它约10μm距离使吸管尖端附近的近似30°角。设定温度至60％，并激活加热器。
注意：这将弯曲吸管过灯丝。这个角度是所希望的，以便当安装到喷射器（ 图1B）的针的尖端平行于注入板的表面上。 - 手柄显微注射移液器要小心，因为他们都非常尖锐和脆弱。
- 保持微量
- 放置borosilic吃玻璃毛细管（外径：1.0mm时，ID：0.75mm）组合在一个微量拉马（在右侧和左侧毛细管持有者的中心）并锁定。
- 使用适当的程序来拉玻璃毛细管，因此导致了薄尖的长锥，甚至和并行墙（例如：热量：815;拉：20;速度：140;时间：175;压力：200）。
- 小心地从牵引装置取出拉出吸管，并将其放置在microforge夹持在水平位置。调整焦距加热器灯丝和吸管。
- 使用目镜标线片来测量移液管的直径和，直到它的直径比灯丝达到180微米移动吸移管。
- 在指定大小，标示用金刚石尖笔的玻璃毛细管，然后轻轻按上拉尖打碎玻璃。这将导致直切（ 图1C）。
- 移动吸管，其尖端靠近灯丝垂直位置。设置温度的microforge至60％。
- 火抛光使用标准技术7直到达到40微米的ID的吸管尖。使用目镜标线检查ID（ 图1D）。
- 使对吸移管的角度。
- 使吸管回到水平位置约10微米，从灯丝5毫米从其前端远程。设定温度至约60％，并激活加热器弯腰灯丝吸管。直到达到（约30°）所需的角度继续加热。检查视觉角度（ 图1E）。
注意：移液器通常被安装到微量在60°相对于该注射盘底部的近似角度。吸移管的前端弯曲，以便其平行于盘，这是必要的在其中间平面上的正确的注射的胚胎的底部。
- 使吸管回到水平位置约10微米，从灯丝5毫米从其前端远程。设定温度至约60％，并激活加热器弯腰灯丝吸管。直到达到（约30°）所需的角度继续加热。检查视觉角度（ 图1E）。
- 检查microinjectors满载油和有在系统中没有气泡（在微量气泡防止喷射的精细控制）。
- 检查显微处于中心位置。这将允许广泛的吸移管的移动。
- 插入保持吸管进入左显微保持器和注射针进入右显微操作支架。
- 允许通过油毛细现象进入移液器和检查系统通过使用微量控制吸管内上下移动油正常工作。
注意：如果在针内没有油的运动，有可能是一个障碍。在这种情况下，使用一个新的针。 - 使用显微控制以使移液管进入视显微镜的场的中心。使用放大4倍，检查微量提示是在正确的角度（Parallel到培养皿的底部）。
注：针的正确的设置是一个成功的注入和结果一致性的关键。 - 校准按照制造商的校准手册的激光系统。
3.注射液盘的制备（图2）
- 放置温热（37℃）SOF-HEPES补充有20％胎牛血清（FBS）的上100毫米培养皿的盖的中心（在材料部分详述组合物）的50微升的下降。放置1 - 将溶液的2微升滴被注入靠近喷射滴。确保胚胎不冷静下来RT以下。
注意：在这个协议中，我们将在葡聚糖红色染料加入到注入溶液，以便能够直观注射部位和以后跟踪。 - 覆盖使用大约10mL，矿物油中的喷射板的液滴。
- 广场上的倒置显微镜阶段注射的菜，并把点子ettes到注射降。检查针是处于焦点的下降中。如使用显微控制需要调整高度。
- 在喷射液滴的上侧 - （20小时后的受精（HPF）17） - 用一个微型分配器，装入约20 30受精卵。因此在注射滴胚的数目由在该人可以注入其中的速度决定于室温下进行注射。别比能够在30分钟内被注入的那些加载更多的胚胎。
- 要加载的胚胎成微型分配器，完全踩下柱塞和沉浸的尖端插入含有胚胎的解决方案。触摸胚胎被拾起与玻璃毛细管的尖端（一个在时间）和缓慢释放所述柱塞，以便每个胚进入毛细管。重复该步骤直至所有的胚胎都拿起或微型分配器容量已满。
- 以释放加载的胚胎，轻轻压下柱塞，直到整个体积共ntaining胚胎从毛细管释放。
4.显微注射
- 使用4X物镜，加载溶液通过施加负压（吸气）被注入到注射针。装载足够的解决方案注入2 - 3受精卵。然后移动到注射降。
- 在注射下降，移动控股吸管使尖端获得接近合子。与保持微量施加负压（抽吸），以使受精卵被固定到保持吸管和变化到20X物镜。
- 一旦合子附着到保持吸管，用注射吸管轻轻来回移动胚胎不拆卸它检查其质量。良好的品质受精卵应该有两个极体（尽管有时只有一个是看到），并均匀细胞质中。不要注入受精卵异常（ 图3A）。
- 如果有必要，重新定位胚胎一个适当的注射位置。一个良好的定位将是在其中存在的ZP和PM之间的一些空间，所以在PM没有得到由激光损坏。
- 检查注射针是通过轻触注射部位的受精卵定位于胚胎的中面。如果不是在它的中平面，针将趋向于使胚胎旋转代替穿刺。根据需要进行调整的注射针的高度。
- 使用激光（ 图3B）中的ZP的孔。
- 使用激光的软件发生在那里的孔将作出（在相反侧，其中胚胎附着到保持吸管）的ZP激光掩模版。使用火按钮激光控制窗口中点击。确保该孔的尺寸足够大，以创建在ZP为所述针的开口以不损坏对PM穿过（实施例：0.662毫秒脉冲宽度/ 6.9微米孔大小）。
- 通过注射针通过在ZP的孔，使与PM的接触。继续推动吸管向前直到针是¾的方式进入胚胎（ 图3C）。
- 观察在溶液油相间的弯液面的位置，因为这将被用于一致地控制注射体积。
- 适用于注射针，这将导致在PM和细胞质被吸入注射针负压（抽吸）。继续直到细胞质的移动进针加速或当细胞质内容与注射溶液混合起来可看出。这些将指示在PM（ 图3D）的破损。
- 注入回胞质内容随后将溶液放入合子通过施加正压力（注入）细胞质中，直到在溶液油相间的弯液面已经前进一个受精卵的直径相当于过去的起点。
注意：在我们的条件下，这种repre货物内大约7注射液（ 图3E）的复数。 - 变化到4X物镜并移动所注入的胚胎/ s到喷射滴的下侧。通过对控股微量施加正压力释放胚胎。保持在上侧的未注射的胚胎和下降的下侧注入的那些，以帮助跟踪注入/未注射的胚胎和有效地工作。
5.胚胎恢复和注射结果
- 建立一个新的菜预热SOF-HEPES约200微升3滴。收集用微型分配器（如上所述）的注射的胚胎。通过3 SOF-HEPES移动它们洗净滴注入胚胎。
- 伯爵在注射溶解胚胎并丢弃它们。
注：因为第一个出现半透明，填写整个ZP裂解的受精卵可以从一个完整一是容易区分，它通常具有细胞质内容泄漏到胚胎的外部。 - 或者，用荧光显微镜检查显微注射效率。要知道，紫外线照射可诱发胚胎损害，可能会影响后续发展。
- 在补充有4毫克/ ml牛血清白蛋白（BSA）根据矿物油钾单纯优化介质的50微升液滴（KSOM）25注射的胚胎的培养基在38.5℃，5％CO 2的空气中，并且湿度饱和。
- 补充有5％FBS培养基中注射后两天。
- 检查囊胚（BL）率注射后7天。计算BL速率胚泡胚胎/在于滴培养的胚胎的总数的总数量。
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Representative Results
激光辅助显微注射细胞质是一个强大而可靠的协议，以提供解决方案为牲畜受精卵的细胞质中。 图3显示了受精卵的大致轮廓之前和注射，以及该技术的整体轮廓之后。葡聚糖红被用作注射溶液，以允许注入和注入效率和准确度的跟踪点。溶液的成功递送在图4中示出表示最近注入胚胎，其中染料被均匀地分布在细胞质中。使用这种技术的胚胎的100％在其细胞质注射。
此协议已证明具有在牛和羊的受精卵最小裂解速率。只有15.6±5和注射胚胎5.8±3.9％，分别在牛，羊，裂解，显微注射的结果
这些结果表明，激光辅助胞质内注射会导致注入，并导致正常囊胚发育率中最小的损伤。
图1：总图显示如何使控股及注射移液器。 AB）注射移液管，CE），握住吸管A）轻轻触摸灯丝与所需直径（5微米）的拉动吸管。激活加热器短暂（显示在邻范围）。这将稍微熔化吸管所以它附着到灯丝并在冷却，移液器将在接触点断裂通过定位吸管产生直切。B）的制作和角度中的吸移管从它的前端约0.5厘米的距离约10微米远离加热器灯丝。直到所需的角度实现继续加热。C）使用金刚石尖笔来标记，并在所希望的直径（180微米）。D）的切保持吸管在垂直位置，火抛光的保持吸管尖，直到它达到所需的内部直径（40微米）。E）使对吸移管将吸管回一个水平定位几微米远离灯丝并从其尖端约0.5厘米远的角度。激活加热器弯腰灯丝吸管。直到所需的角度实现继续加热。关于如何使针的详细信息，请参阅8,9,10。=“https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 注塑菜的常规设置移液器，安排下降，胚胎被显示在此图中，请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 激光辅助胞浆内单注射规程 A）注射前安装在保持吸管合子的总图。 PB：极体，ZP：透明带，细胞色素：胞质中，PN：原核，PM：等离子MEMBRANE，HP：拿着吸管，IP：注射针BE）显微注射步骤：B）使一个洞，使用激光安装在保持吸管合子的ZP C）介绍了注射针对胚胎的对面。 。验证弯月（a）中。 的D位置）由注射针里吸胞质内容打破质膜。E）注入回胞质内容和溶液到合子的细胞质，直到弯液面未达一合子直径（二）过去的起点。距离AB表示注射液。F）注射后受精卵的总图的〜7 PL。需要注意的是注射液均匀地扩散到细胞质中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：A注入受精卵葡聚糖红色 ）注入受精卵的B亮场图像）注入受精卵的荧光图像的代表图 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 裂解的胚胎的比例受精卵的显微注射后在两种不同物种的数据表示4个重复的牛胚胎（共103注入合子）和3个重复的绵羊胚胎（共173注入合子）。误差棒代表SEM 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
图6： 囊胚优惠牛和绵羊胚胎数据表示4个重复对，共有102注射和156对照胚胎的牛物种和3个重复对，共有163注射和239对照胚胎绵羊物种。误差棒代表SEM 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
受精卵显微注射是引入解决方案集成到哺乳动物胚胎一套行之有效的方法。与一些依赖于物种和实验的目的变化，这种技术可以广泛地使用。我们展示了如何使用激光来帮助一个钝头微量的入口处进行显微注射胞浆内。某些牲畜物种（如牛，羊，和猪）的合子有黑暗的细胞质中，阻碍注射针的可视化一次胚胎内。此外，他们的血浆膜是非常有弹性的，使得与一个斜面尖刺针（通常用于注入啮齿动物物种的受精卵）难以实现其渗透。为了克服这些限制，我们使用激光来使穿过透明带和细胞质内容随后抽吸钝端针的通道，以确保在质膜和胚胎的细胞质内的溶液的释放的破损。此外，通过injecti纳克在针入口端站点（约3/4的胚胎内），我们的目标是取代PN，从而避免他们的愿望/注射。此外，这提供了破膜愈合接触的多点，因此导致较低的裂解速率。
产生良好的微量（特别是注射吸管），并相应地设置他们进入显微关键是实现这种技术的良好效果。注射针可以用于只要注射溶液的针内平滑地移动。有时，细胞质含量甚至原核内容卡住被针的尖端内部，造成流动不均匀运行和复杂化注入（这也增加裂解率和延迟处理）。更换时发生这种情况的注射针是必需的，以获得与该协议最佳结果。的时间，该胚胎孵化以外的量是至关重要的以获得一致的存活率和应不超过30分钟。培训和实践后，运营商通常达到每分钟1-2注射胚胎注射速度。此协议的成功的另一个关键点是一致的注入每个胚胎溶液的体积是相同的。这是很容易和准确地通过观察溶液 - 油界面弯液面的位移控制。重要的是在吸液管的直径是操作之间并且该尖端具有定期和恒定的直径是一致的。与在末端5微米的ID移液器，7 - 注射体积的10复通过注入相当于一个受精卵的长度来实现的。过注射常常导致胚胎裂解。
使用该协议，将胚的100％正确注入细胞质中，完全避免了假围卵腔注射（ 图4）。这最大化可靠性和正在进行的测定法的重现性（不管注射溶液），因为其结果只有所注入的溶液的作用，而不是对注射的不一致是由于。有些注入受精卵通常会裂解，由于注射过程中机械损伤。注射后存活通常率为75％11。使用这种方法，我们能够得到裂解胚胎（ 图5）的最低利率。此外，胚泡发育率可比未注射的（对照）胚胎（ 图6），表示被注入技术对早期胚胎发育没有不利的影响。这个协议的效率最近比以往细胞质微注射协议（使用有斜面的尖刺玻璃针，而无需使用激光直接细胞质微注射穿透德ZP）用于注射牛受精卵5。结果表明裂解胚胎显著率较高，为直接cytopl的囊胚形成率较低asmic显微注射。我们认为使用激光辅助细胞质微注射时，使该协议的优选的在我们的实验室注入牲畜物种针穿透过程中这些差异是由于较少的机械损坏。
这里，我们提出了通过体外受精获得的牛和羊的胚胎数据，而且还使用测试协议的体内 和体外猪胚胎获得了类似的结果（数据未显示）。取决于注入的溶液，该协议可以用于许多应用中。最近，我们已经用它来介绍一个CRISPR / Cas9系统敲除特定基因在体外受精牛胚胎，发现测序囊胚与突变比例高：胚胎的50％（N = 6）有双等位基因突变，33％（N = 4）的单等位基因的突变，和17％（N = 2）分别为野生型5。这个协议是非常可靠的，可在使用几个物种和无数应用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
| Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
| Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
| Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system. |
| Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
| Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
| 100 x 15 mm culture dish | Falcon | 351029 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used. |
| 35 mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50 μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them. |
| Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5 °C, 5% CO2 conditions can be used. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used. |
| Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
| Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10 mg/ml solution is used to inject. |
| Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
| KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use. |
| FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
| Zygotes | Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
| NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MgCl2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium. |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium. |
| BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5 μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
| Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
| SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3 - 7.4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilized through a 22 μm filter can be stored in the fridge at 4 °C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |
References
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